מאמר שיטה

ניתוח אלקטרופיזי של האדם Pluripotent גזע גזע נגזר Cardiomyocytes (hPSC-CMs) באמצעות מערכים אלקטרודה רב (MEAs)

DOI:

10.3791/55587

⸱

12 במאי 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Applied Stem Cell Technologies, University of Twente

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון אלקטרופיזיולוגי של cardiomyocytes הנגזר האדם בתאי גזע Pluripotent (hPSC-CMs) הוא קריטי עבור מודלים של מחלות לב ולקביעת תגובות סמים. פרוטוקול זה מספק את המידע הדרוש כדי לנתק צלחת hPSC-CMs על מערכים אלקטרודה רב, למדוד את פוטנציאל השדה שלהם, וכן שיטה לניתוח QT ו RR מרווחי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiomyocytes יכול כעת להיות נגזר עם יעילות גבוהה משני האדם עובריים אנושיים המושרה- Pluripotent תאי גזע (hPSC). HPSC- נגזרות cardiomyocytes (hPSC-CMs) יותר ויותר מוכר כבעל ערך רב עבור מודלים של מחלות לב וכלי דם בבני אדם, במיוחד תסמונות אריתמיה. הם הראו גם רלוונטיות כמו במערכות חוץ גופית לחיזוי תגובות סמים, מה שהופך אותם מועילים עבור בדיקות סמים וגילוי, פרמקולוגיה בטיחות ואולי בסופו של דבר עבור רפואה מותאמת אישית. זה יהיה להקל על ידי הפקת hPSC-CMs מחולים או אנשים רגישים כמו hiPSCs. עבור כל היישומים, עם זאת, מדידה מדויקת וניתוח של תכונות חשמל hPSC-CM חיוניים לזיהוי שינויים עקב מוטציות ערוץ יון לב ו / או תרופות המכוונות ערוצי יונים ועלול לגרום למוות לב פתאומי. לעומת תיקון ידני, מהדק, רב אלקטרודה מערך (MEA) התקנים להציע את היתרון שלהמאפשר הקלטה בינונית עד תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתק תרבויות תא 2D של hPSC-CMs כדי אגרגטים קטנים ותאים בודדים צלחת אותם על MEAs להקליט פעילות ספונטנית שלהם חשמל כמו פוטנציאל שדה. שיטות המתאר את הנתונים שנרשמו לחלוקת פרמטרים ספציפיים, כגון QT ו- RR, מתוארים גם כאן. שינויים בפרמטרים אלו היו צפויים ב- hPSC-CMs הנושאים מוטציות אחראיות על הפרעות קצב לב ואחרי הוספת תרופות ספציפיות, המאפשרות זיהוי של אלו הנושאים סיכון קרציוטסי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האדם בתאי גזע Pluripotent (hPSCs) יש את היכולת עצמית לחדש וליצור כמעט כל סוג התא של הגוף האנושי באמצעות הבחנה 1 , 2 . פרוטוקולים מפורטים על איך לכוון בידול של hPSCs לתוך כמה שושלות לב (חדרי הלב, אטריאלי, קוצב לב כמו cardiomyocytes) תוארו 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Cardiomyocytes הם תאים פעילים חשמלית ידע מפורט של הפעילות האלקטרונית שלהם יכול להיות מאוד אינפורמטיבי להבנת התפתחות הלב ואת המחלה 8 . חולי hiPSC נגזרים ספציפיים (hiPSC-CMs) שימשו בהצלחה מודל ומחקר של תכונות תאיות, מולקולריות וחשמליות של מספר הפרעות קצב לב, כולל תסמונת לונג QT(LQTS) 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , תסמונת Brugada 14 , ו cathecolaminergic טכיקרדיה חדרית פולימורפית 15 , 16 . יתר על כן, תרופות מרובות נוספו ל- hiPSC-CMs חולים לסכם התערבות טיפולית ולהצלת פנוטיפים פתולוגיים סלולריים 10 , 15 , 20 , 21 , 22 . לאחרונה, פותחו פלטפורמות הקרנה המבוססות על WT hiPSC-CMs, בתגובה לצורכי מערכות אנושיות לשלבים המוקדמים של גילוי התרופות 23 , 24 , 25 , כמו cardiomyocytes מכרסם שונים באופן מהותי מ huב יון ביטוי ערוץ ביופיסיקה 26 .

למטרה זו, טכנולוגיות המתאימות ליישומים בינוניים עד תפוקה גבוהה מפותחות ומיושמות. אלה כוללים הקלטות אופטיים של פוטנציאל הממברנה, Ca 2 + הארעיים ואת המתח, מדידות עכבה (כמדד עקיף של contractility התא), ואת הפוטנציאל שדה פוטנציאליים (FP) מדידות (לבדיקה עיין התייחסות 24 ). Multi-electrode Arrays (MEA) התקנים לאפשר הקלטה של ​​אותות waveform חשמלי (או FPs) שנוצר ועוצב על ידי monolayers או אשכולות קטנים של cardiomyocytes. קווי FP מתואמים עם פוטנציאל הפעולה הלבבית, ובמידה מסוימת עם הקלטות ה- ECG 27 ; הם בדרך כלל מראים מהלומה מהירה ראשונית המתאימה לזרם ה- Na + והדילולריזציה של הממברנה (שיא של R / Q), שלב איטי / גלגלת המישור המתאים ככל הנראה ל- Ca2 + זרם, ואת שלב repolarization המקביל פלוס K + פלוס (שיא T). הפרעה של צורת הגל של FP יכולה להיות מתואמת עם שינויים בשלבים פוטנציאליים פעולה פוטנציאל 28 .

למרות תיקון מהדק מהדקים של פוטנציאל פעולה יכול להיות אינפורמטיבי יותר, במיוחד עבור הפרמטרים כמו מהירות upstroke ואת פוטנציאל הממברנה מנוחה, מדידות ידניות לא ריאלי עבור ניסויים בקנה מידה בינוני ו תפוקה גבוהה, בעוד מהדק תיקון אוטומטי יש רק לאחרונה הוחל על hPSC -CM 29 . עם זאת, מאז הקלטות ממושכות על MEAs לאפשר גם חשיפה אקוטי וכרוני תרכובות להיחקר, עכשיו אפשר להשתמש בפלטפורמות hPSC-CM להקרנת סמים, גילוי 24 , 30 ו פרמקולוגיה בטיחות 31 , 32 . זה מחזיק את ההבטחה של דיוק בעתיד או פרסורפואה מנטלית 33 .

מטרת פרוטוקול זה הוא לספק את המידע הדרוש עבור ניתוק ציפוי HPSC-CMs על שבבי MEA ומדידת FP שלהם. בהליך זה, כל צעד כבר אופטימיזציה, הבטחת הישרדות התא אופטימלית התאוששות לאחר ניתוק, התא המצורף התא האופטימלי לצלחת MEA וניתוח סטנדרטי וכימות של פרמטרים. בפרט, את ההליך עבור הקלטה FP תאיים, ניתוח של QT ו- RR מרווחי, והערכת ההשפעות של הסמים מוסברים ומדגים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת פתרונות ריאגנטים

  1. הכינו בינוני תרבות HPSC-CM באמצעות בינוני אינסולין, אלבומין בסרום שור, polyvinylalcohol, ליפידים חיוניים (LI-BPEL) בינוני 34 , 35 , 36 על ידי שילוב ריאגנטים המתואר בטבלה 1 . סנן את המדיום דרך מסנן 0.22 מיקרומטר נקבוביות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.
  2. הכן אדם רקומביננטי פתרון fibronectin המניות על ידי recitituting 1 מ"ג של fibronectin רקומביננטי אנושי ב 5 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים להגיע 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​ריכוז, aliquot, ואת החנות ב -80 מעלות צלזיוס.
  3. הכן 1% (w / V) פתרון דטרגנט האנזים (ראה טבלה של חומרים ), כדי לסייע הסרת תאים שיורית מן שבב microarray, על ידי המסת 1 גרם של אבקת אבקת האנזים ב 100 מ"ל של חם (~ 40-45 ° C) מים מאויישים. אפשר פתרון להתקרר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוסאו עד שנה.

2. עיקור של שבבי MEA (איור 1 א)

הערה: קיימות מספר תצורות שונות של MEAs, עם פורמטים בודדים או מרובי-היטב. פרוטוקול המתואר כאן משתמשת MEA חדר יחיד המכיל 60 אלקטרודות הקלטה בהסדר 8 x 8 רשת (ראה טבלה של חומרים ). קוטר האלקטרודה הוא 30 מיקרומטר המרחק בין האלקטרודות הוא 200 מיקרומטר. אחת האלקטרודה התייחסות קיים גם.

  1. שוטפים את השבב היטב עם מים deionized.
  2. שים את הצ 'יפס MEA בתוך צלחת פטרי זכוכית שיכול להיות autoclaved. לעטוף את צלחת בנייר כסף.
  3. לעקר את הצ 'יפס בתוך סיר לחץ מעבדה במשך 6 דקות. אפשר את הכלים להתקרר לפני הפתיחה.
    הערה: לחלופין, את הצ 'יפס ניתן לעקר על ידי immersing אותם 1 מ"ל של 80% (v / v) אתנול ב RT במשך 15-30 דקות.
  4. מניחים את הצ 'יפס ברדס תרבות התא לחשוף אתמשטח אור UV במשך כ 30 דקות.

3. ציפוי של שבבי MEA (איור 1 ב ו 1 ג)

  1. מניחים את הצ 'יפס נקי בתוך תקן 10 ס"מ Ø צלחת פטרי סטרילית מפלסטיק.
  2. מוסיפים 8 מ"ל מים מזוקקים סטרילי לצלחת פטרי כדי ליצור תא humidified, אשר ימנע את נפח קטן של המדיום תרבות על השבב להתייבש כאשר הניח את האינקובטור.
  3. השתמש מותאם אישית polytetrafluoroethylene (PTFE) טבעות ( איור 1B ) כדי להבטיח ציפוי של cardiomyocytes במרכז שבב, שבו מערך האלקטרודה ממוקם. (הטבעות PTFE מאוחסנים בעבר באתנול 80%). על מכסה המנוע תרבות, להסיר את הטבעות מן אתנול, למקם אותם בצלחת פטרי סטרילית ללא מכסה ולאפשר הטבעות להתייבש על מכסה המנוע.
  4. מניחים טבעת יבשה בתוך שבב אחד MEA באמצעות מלקחיים מעוקרים להבה ( איור 1 ג ).
    הערה: לחלופין להשתמש 80% אתנול לשטוף את פינצטה ולאפשר להתייבש אניN את מכסה המנוע תרבות רקמה לפני השימוש בהם.
  5. להפשיר aliquot אחד של מלאי פיברונוקטין אנושי רקומביננטי (200 מיקרוגרם / מ"ל ​​במים מזוקקים) ו לדלל ב PBS עם Ca 2 + ו Mg 2 + כדי לקבל פתרון עבודה של 40 מיקרוגרם / מ"ל. מעילים את האלקטרודות על ידי הוספת 50 μL של 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​fibronectin בתוך הטבעת.
    הערה: ציפוי באמצעות פיברונקטין רקומביננטי אנושי מבטיח קישור hPSC-CM אופטימלי. עם זאת, סוגים אחרים של חלבונים ציפוי כגון fibroectin שור או תאי תאיים חלבונים מטריקס ניתן להשתמש.
  6. סגור את המכסה של 10 ס"מ Ø צלחת פטרי פלסטיק בזהירות להעביר את המנה המכילה את שבב MEA לתוך החממה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 1 שעות, או ב 4 ° CO / N.
  7. מעבירים את המנה המכילה את השבב MEA כדי מכסה המנוע לתרבות התא. לפני השימוש שבב MEA, לשאוב μL 50 של fibronectin באמצעות פיפטה P200 או מערכת ואקום במכסה המנוע, מבלי לעקור את הטבעת PTFE. השתמש בלהטיפים סטטיים עבור שלב זה. ודא כי אין אובייקטים מוצקים ( למשל, טיפים פיפטה) לגעת בפנים של צלחת כמו זה יכול להזיק האלקטרודות.
    הערה: זה יאריך את חיי השבבים MEA.
  8. בעדינות להוסיף 950 μL של בינוני LI-BPEL (ראה טבלה 1 ו טבלה של חומרים ), להבטיח כי הוא מופץ באופן שווה כי הטבעת לא לצוף. מחזירים את המנה לחממה.

4. hPSC-CMs דיסוציאציה ציפוי (איור 2)

הערה: פרוטוקול כאן מתואר עושה שימוש hPSC-CMs שהיו מובחנים בתרבות monolayer באמצעות ציטוקינים 34 ב ~ 18 ימים לאחר תחילת ההבחנה. עם זאת, הוכח להיות מתאים לכל 2D ו 3D hPSC-CM תרבות. כאשר באמצעות תרבויות מובחן בנקודות זמן מוקדמות או מאוחרות יותר, התאמת זמן הדגירה של האנזים ניתוק (ראה טבלה של חומרים ) עשוי להיות neמזור. הכרכים הבאים מיועדים לבאר אחת של פורמט צלחת של 12 באר (3.8 ס"מ 2 ).

  1. לשאוב את המדיום מן התרבות hPSC-CMs היטב.
  2. בעוד עובד תחת מכסה המנוע תרבות רקמה, להוסיף 1-2 מ"ל / גם של PBS ללא Ca 2 + / Mg 2 + לשטוף את התרבות. לשאוב את PBS.
  3. הוסף 500 μL / גם האנזים דיסוציאציה. דגירה של 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
  4. הוסף 1 מ"ל LI-BPEL / גם לדלל את האנזים. בעדינות לנתק את monolayer של hPSC-CMs על ידי מגרד בעדינות באמצעות פיפטה P1000. איסוף ההשעיה התא בצינור 15 מ"ל.
  5. יש לשטוף היטב עם 1 מ"ל LI-BPEL לאסוף את כל התאים הנותרים וגושים התא.
  6. הוסף עוד 2-3 מ"ל של LI-BPEL להגיע נפח סופי של 5-6 מ"ל בעדינות פיפטה למעלה ולמטה 3-5x עם פיפטה 5 מ"ל לנתק גושים התא.
    הערה: דיסוציאציה לתאים בודדים בשלב זה אינה הכרחית, שכן היא תשפיע על הישרדות התא. נוכחות של אשכולות קטנים יהיהלהבטיח כדאיות התא גבוהה.
  7. צנטריפוגה התאים ב RT במשך 3 דקות ב 300 x גרם.
  8. הסר את supernatant, מנסה להסיר את רוב הנוזלים עודף אבל בלי dislodging תא גלולה.
  9. Resuspend תא גלולה 250 μL LI-BPEL (באמצעות P1000 ו pipetting בעדינות).
  10. להפיץ ~ 50 μL ההשעיה תא לכל MEA (עד 5 MEAs יכול להיות מוכן מבאר אחת של צלחת 12 גם) על ידי pipetting ההשעיה התא ישירות למרכז הטבעת PTFE, על גבי מערך האלקטרודה.
    הערה: בשלב זה תאים קשה לספור בשל נוכחות של אשכולות התא ואת המספר הכולל של תאים לכל MEA יכול להשתנות באופן משמעותי, בהתאם במקור hPSC-CM בשימוש. בעוד ציפוי, להבטיח כי ענן של תאים ניתק מכסה את האזור של האלקטרודות.
  11. בזהירות להעביר את MEAs לאינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ולאפשר לתאים לצרף O / N

5. הסרת טבעת בינונית Reטריים (איור 3)

  1. ב 1 יום לאחר ציפוי, להסיר בזהירות את הטבעת בסביבה סטרילית באמצעות פינצטה סטרילית ( איור 3A-3B ).
  2. שוטפים את הטבעת 80% (V / V) אתנול ולאחסן אותו בצינור 50 מ"ל המכיל טריים 80% (V / V) אתנול.
  3. הסר בעדינות 500 μL של המדיום מן השבב MEA ולהוסיף 500 μL של LI-BPEL טרי.
  4. מעבירים את MEAs לאינקובטור ב 37 ° C.
    הערה: התאים צריכים להתחיל להכות 1-7 ימים לאחר הסרת הטבעת שינוי בינוני ( איור 3 ג ).
  5. למדוד פעילות חשמלית של hPSC-CMs על MEAs 1-7 ימים לאחר הסרת הטבעת.

6. בדוק את איכות האות (איור 4)

  1. הפעל את המחשב והפעל את חבילת התוכנה המקושרת ל- MEA: TCX-Control, MC_MEA Select ו- MC_Rack. הגדר את הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס ב TCX-Control כדי לרשום מדידות בטמפרטורה פיזיולוגית.
  2. הסר את המנה המכילה את שבב MEA FRom החממה. פתח את המכסה, להוציא את השבב MEA, ולמקם אותו על רקמה לקלוט מים שיורית.
  3. בזהירות לנגב את המגעים החיצוניים של הצלחת עם רקמה ולנקות אותם באמצעות צמר גפן כותנה עם 100% (v / v) אתנול כדי להסיר את כל המים או פסולת שיורית, אשר עלול לגרום רעש האות.
  4. מעבירים את צלחת MEA אל ראש ההקלטה המחומם (37 ° C) כדי לזהות את הפעילות הספונטנית ( לדוגמה, חומרה: ראה טבלת חומרים , תוכנה: MC_Rack).
    1. פתח את MC_Rack: לחץ על 'ערוך' → 'הוסף MC_Card' כדי ליצור פרוטוקול חדש. השתמש בתפריט הנפתח 'ערוך' כדי להוסיף חלונות שונים של 'מקליט' ו'תצוגה 'לפרוטוקול.
      הערה: מומלץ תדר דגימה של 10 kHz לפחות. פרוטוקול אנו משתמשים מכיל אחד Longterm כלי תצוגה, עם פריסה מלאה של כל השבב MEA, ואחד ספייק ספייק, חיוני ללכוד אפקט התרופה אניN בזמן אמת. הקיצוץ ספייק הוא מכוון עם "טרי טריגר" של 20 אלפיות השנייה, "פוסט טריגר" של 800 ms ו "זמן מת" של 2 אלפיות השנייה. ניתן לשמור את הפרוטוקול כקובץ 'rck' ולטעון מחדש לפני תחילת הניסויים.
  5. הפעל את הפרוטוקול במצב הפעלה על ידי לחיצה על כפתור 'הפעל'.
    הערה: בשלב זה ניתן לטעון מחדש את הפרוטוקול שנשמר תחת שלב 6.5. ב- MC_Rack, טען את הפרוטוקול (סיומת הקובץ. Rck) על ידי לחיצה על 'קובץ' → 'פתח'.
  6. אם האותות מוצגים בבירור R פסגות R ו- T פסגות, לחכות 10-15 דקות לסיים את שלב ההסתגלות. דוגמאות של עקבות איכות טובים ורעים מוצגים באיור 4 .
    הערה: אם לא ניתן להבחין בשיא T בכל אחת מהאלקטרודות, אל תמשיכו בניסוי. בדרך כלל זה תוצאה של פעילות חשמלית ירודה של hPSC-CMs או מצורף עני של התאים האלקטרודות.

7. הפעל את Exפרימנט ו הקלטה

  1. לחץ על 'להקליט' ולאחר מכן 'הפעל', ולרכוש נתונים עבור 10 דקות תחת תנאי הבסיס כדי לקבוע את מצב יציב. ביאורים האלקטרודות שיש להם את האות הטוב ביותר, כך שהם יכולים להיות מזוהה בקלות וייצא מאוחר יותר לניתוח.
  2. להערכת התרופה, הוסף ריכוז הולך וגדל של התרופה בכל 10 דקות. כדוגמה, להוסיף את חוסם HERG E4031 בריכוז סופי של 1 מיקרומטר. לשם כך, להסיר 100 μL של המדיום ולהוסיף את אותו נפח של 10 מיקרומטר E4031 מומס במדיום.
    הערה: כפי שהוכח בעבר על ידי Cavero ועמיתיו 31 , בחירה נבונה של נפח שבו התרופה מומס חשוב, שכן הוא יכול לשנות את עקומת התגובה לתרופה.
  3. חזור על שלב 7.2 עבור כל ריכוזי התרופה האחרים של עניין.
  4. לחץ על 'עצור' כדי לסיים את ההקלטות בסוף הפרוטוקול.

8.MEA ניקוי עבור שימוש חוזר

  1. לאחר ההקלטה הניסוי הוא סיים, בעדינות להסיר את המדיום עם פיפטה P1000. אין לגעת בפנים של צלחת כמו זה יכול להזיק האלקטרודות. מחק לפי כללי הבטיחות המקומיים.
  2. שוטפים את שבבי MEA עם מים deionized באמצעות בקבוק לשטוף, וחזור על צעד לשטוף 3-4x.
    הערה: בשלב זה אין צורך כי התאים מנותקים לחלוטין מן השבב.
  3. מוסיפים 1 מ"ל של תמיסת דטרגנט האנזים 1% (v / v) לתוך כל טוב דגירה O / N ב 4 ° C כדי לאפשר ניתוק התא הסרת התא.
  4. יום אחד לאחר מכן, לשטוף את השבבים MEA ביסודיות עם מים deionized להסיר תמיסת דטרגנט האנזים ותאי שיורית ולהוסיף מים 1 מ"ל deionized. צ 'יפס MEA נקי יכול להיות מאוחסן שקוע במים deionized ב 4 מעלות צלזיוס.

9. ייצוא נתונים

  1. פתח את תוכנת הכלי MC_Data המקושרת ל- MEA.
  2. לחץ על 'קובץ' → 'פתח את MCד '.
  3. לחץ על 'כלים' → 'המרת MCD ל- ABF' .
  4. בחר את האלקטרודות עם האותות ההקלטה הטובה ביותר להיות מיוצא לניתוח. בחר את הספריה שבה לשמור את הקבצים המיוצאים ולחץ על 'שמור'. הליך הייצוא עשוי להימשך מספר דקות בהתאם למספר האלקטרודות שיוצאו והגודל הכולל של קובצי ההקלטה.

ניתוח נתונים

  1. הורדה והתקנה של רכישת נתונים electrophysiology וניתוח התוכנית ( למשל, pClamp). לאחר השלמת, הפעל את תוכנת ניתוח ( למשל, Clampfit).
  2. RR חישוב מרווח (איור 5).
    1. במקום שני סמנים אנכיים כדי להגדיר את האזור של עניין על עקבות. בחר 'גילוי אירוע' → 'חיפוש סף'. הסמן האופקי צריך לחצות את כל האירועים שיש לכמתם, כפי שמוצג באיור 5 א .
    2. לחץ על &# 39; אישור 'ולאחר מכן' קבל את הקטגוריה כולה '. התוכנה לאחר מכן לחפש את עקבות עבור כל האירועים המתאימים. הסימנים הכחולים יוצבו מעל האירועים.
    3. כוונן את הרגישות של הבחירה האוטומטית על ידי כוונון הפרמטרים בחלון איתור האירועים הראשי.
    4. לאחר שכל האירועים מזוהים באופן אוטומטי, עבור אל חלון התוצאה (חלון → תוצאות) ולהעתיק את העמודה "Intervent Interval", אשר מכיל את נתוני התדר ( איור 5 ב ).
  3. חישוב QT מרווח (תרשימים 6-9):
    1. מניחים סמן אחד לפני ואחרי FP בודד במצב מצב יציב. בחר 'גילוי אירוע' → 'יצירת תבנית' ( איור 6 ) .
    2. ודא שה- FP מזוהה כהלכה ולחץ על 'הוסף'. התבנית תועבר ללוח התחתון.
    3. שמור את התבנית כ- 'atf'קוֹבֶץ. בדרך זו, עקבות תבנית נוצר כי יהיה לחפש על ידי התוכנה לאורך כל ההקלטה ( איור 7 ). יצירת תבנית אחת עבור כל תנאי, שכן אפקט סמים עשוי לשנות את הצורה של FP. במידת הצורך, לסנן את עקבות מעט כדי לכלול מקסימום של 10.000 נקודות בתוך שני הסמנים.
    4. לאחר שהתבנית נשמרה בתוסף '.atf', בחר 'איתור אירוע' → 'חיפוש תבנית' וטען את התבנית.
    5. התאם את "סף ההתאמה תבנית" כדי לזהות כראוי את כל FP ב המרווח שנבחר.
    6. לאחר שכל האירועים יזוהו כראוי, שמור אותם בקובץ '.ab' חדש.
  4. פתח את הקובץ עם תוכנת ניתוח באופן אוטומטי לחשב את "זמן שיא" הן Q / R ואת פסגות T ( תרשימים 8, 9 ). אם עקבות הם רועשים מאוד, להחיל מסנן. חישוב מרווח QT על ידי חיסורQ / R ערך מ T ערך בעורך גיליון אלקטרוני של בחירה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יום אחד לאחר דיסוציאציה ציפוי, שכבת hPSC-CMs יהיה גלוי כסרט צפוף לבן מכסה את מרכז החדר MEA ( איור 3 א ). לאחר הסרת הטבעת ( איור 3 ב ),   השכבה צריכה להישאר במקום בדיקה על מיקרוסקופ אור יציג את האלקטרודות MEA מכוסה על ידי (קבלנות) hPSC-CM שכבת ( איור 3 ג ). בגלל צימוד פיזי וחשמלי של התאים, רק אלקטרודה אחת (אלקטרודה הזהב) ישמש לניתוח.

לחלופין, כאשר עובדים עם מבנים 3D, כגון גופים embryoid או microtissues, אלה יכולים להיות מצופה כך הם פיזית חשמלית פיזית. בדיקה חזותית במיקרוסקופ יכול לאשר שום חיבור פיזי בין אשכולות וגלי R לא nonsynchronized ב MEAs לאשר שום צימוד חשמל. ב ג זה כמו, אלקטרודות עצמאיות מרובות ניתן לנתח.

הקלטות אופייניות של עקבות FP מוצגים באיור 4 . בפרט, עקבות איכות טובה יכולה להיות מוגדרת על ידי נוכחות של שיא ברור המתאים את זרם + Na ו depolarization הממברנה (R / Q שיא), שלב repolarization ברור המתאים K + אפלוקס (שיא T), גבוה אות לרעש יחס ( איור 4 א , שמאל: הערה y- ציר בקנה מידה ואיור 4B ). עקבות באיכות רעה ( איור 4 א ' , באמצע) עשוי להיות תוצאה של כשל של hPSC-CMs לצרף את צלחת MEA או פעילות חלשה hPSC-CM. המתנה 1-3 ימים עבור התקשרות טובה יותר עשויה לשפר את האות; עם זאת, אם לא שיפור האות הוא גלוי, למעט MEA זה מן הניסויים מומלץ. רועש עקבות ( איור 4 א , ימין) ניתן לנתח לאחר סינון.

.Within-page = "1"> ניתוח מוצלח של מרווח RR יכול להיות מזוהה על ידי בדיקה חזותית של המסך מראה שיא שיא ( איור 5 א, 5 ב ). בתוך מרווח הזמן המוגדר על ידי הסמנים האנכיים, יש להכיל סימנים כחולים המתאימים לכל פסגה. במקרה שהתוכנה אינה מזהה פסגה אחת או יותר, נסה להזיז את הסמן האופקי ולהפעיל את הניתוח שוב או להתאים את הגדרות האיתור. באופן דומה, ניתוח מוצלח של מרווח QT יכול להיות מזוהה על ידי בדיקה חזותית של המסך מראה זיהוי FP ( איור 7 ). בתוך מרווח הזמן המוגדר על ידי הסמנים האנכיים, הסימנים הכחולים המתאימים לכל זיהוי FP צריכים להיות נוכחים. במקרה שהתוכנה אינה מזהה אחד או יותר FPs, נסה להגדיר מחדש את תבנית FP ( איור 6 ) או להתאים את הגדרות האיתור ולהפעיל את הניתוח שוב.

עקבות בודדים FP בודדים או הממוצע שלהם ( איורE 8) ניתן להשתמש עבור קבלת ערכי מרווח QT עם הגדרות ספציפיות כמו בתרשים 9 . ניתוח של QT-RR היחסים רצוי והוא בעל משמעות בקווים חולים ו WT hPSC ( איור 10 א ) ו כדי להעריך את הצורך ו / או את ההשפעה של תיקונים QT- מרווח ( איור 10B-10D ). HPSC-CMs נושאת מוטציות LQTS גורמת ממושכים QT מרווחים לעומת בקרות WT ( איור 11 א ). טיפול של hPSC-CMs עם חוסם HERG תוצאות הארכת מרווח QT ( איור 11 ב ); לעומת זאת, טיפול עם activator HERG תוצאות קיצור מרווח QT ( איור 11 ג ). לבסוף, טיפול בתרופות המשפיעות על תדירות המכות של hPSC-CMs צריך להיות גלוי כשינוי במרווח RR ( איור 11D , RR מרווח קיצור).

figure-results-1 />
איור 1: עיקור וציפוי של שבבים MEA. ( א ) Scheme המייצג את תהליך העיקור כולל הצבת שבב MEA ב autrlavable צלחת פטרי זכוכית, גלישת בנייר אלומיניום, אידוי במשך 6 דקות, וחשיפה UV למשך 30 דקות. ( B ) למעלה (פאנל שמאל) ואת הצד (באמצע הלוח) תצוגות של טבעת PTFE מותאם אישית; את הטבעת יש קוטר חיצוני של 1.2 ס"מ, כולל 4 כנפים המאפשרים את מיקומו במרכז שבב MEA ואת הקוטר הפנימי הוא 0.4 ס"מ (פאנל ימין). ( C ) סכמטי המייצג הכנת השבב MEA כולל הצבת שבב צלחת פטרי פלסטיק סטנדרטי, הוספת 8 מ"ל של מים deionized מחוץ לחדר MEA, הצבת טבעת PTFE באמצע החדר, ואת הציפוי מערך האלקטרודה עם fibronectin . לאחר הדגירה זמן, fibronectin מוסר מוחלף במדיום התרבות.T = "_ ריק"> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2: דיסוציאציה ציפוי של hPSC-CMs. סכמטי המייצג את התהליכים של hPSC-CMs דיסוציאציה אנזימטית, צנטריפוגה, resuspension, ציפוי על מרכז החדר MEA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3: צ 'יפס MEA עם שכבת hPSC-CM. ( א ) למעלה צפיות של MEA שבב המכיל את הטבעת ואת השכבה של hPSC-CMs. ( ב ) נוף צד של שבב MEA לאחר הסרת הטבעת. ( ג ) תמונה שדה בהיר של hPSC-CMs שכבת מצופה על מיקרו-מערך אלקטרודה; הגדלה 4X. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 4: MEA הקלטה של ​​hPSC-CMs. ( א ) נציג עקבות נרשם עם MEA מראה עקבות איכות טובה עם R / Q ו פסגות T ברור עם יחס אות לרעש גבוה (משמאל), עקבות באיכות גרועה ללא ברור R / Q ו- T פסגות (באמצע), ואת עקבות רועש עם R / Q ו פסגות T ברור בבירור אבל עם יחס אות נמוך רעש (מימין). ( B ) דוגמאות נציג באיכות טובה FP עקבות עם מורפולוגיות שונות שניתן להקליט במהלך ניסויים MEA באמצעות hPSC-CMs. האזור המוצלל מייצג את מרווח הזמן QT שנמדד במהלך הניתוח. מאז FP ב MEA דומה הגזטיב הראשוןE של פוטנציאל הפעולה 28 , יש לנו לחשב את האינטגרל של עקבות FP, כפי שמוצג קו אדום מנוקד, כמו הדגמה תיאורטית של הבחירה גל T קרוב פעולה מלאה repolarization פוטנציאל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5
איור 5: חישוב מרווח RR. ( א ) דוגמה של ניתוח מרווח RR עם זיהוי שיא אוטומטי (הדף) והפקת נתונים (תחתית) באמצעות תוכנת ניתוח (ראה טבלה של חומרים). סמנים אנכיים לזהות את מרווח הזמן של הריבית ואת הסמן האופקי הוא חוצה את כל האירועים מזוהים מזוהים על ידי סימנים כחולים. ( ב ) העמודה המוגדלת מציגה את הנתונים המחולקים המשמשים לחישוב מרווח RR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-6
איור 6: יצירת תבנית FP. דוגמה לבחירת תבניות באמצעות סמנים אנכיים המוצבים לפני ואחרי FP יחיד. תבנית זו משמשת לזיהוי אוטומטי של FP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-7
איור 7: זיהוי אוטומטי של תבנית FP. דוגמה לחיפוש בתבנית לאורך פרק זמן המוגדר על ידי שני סמנים אנכיים. כל האירועים שזוהו מזוהים באמצעות סימנים כחולים והם אוטומטייםY על גבי הבלעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-8
איור 8: כימות של פרמטרים FP. ניתוח של האירועים שנשמרו, עם שיא R מזוהה באופן ידני בתוך שני הסמנים הראשונים ואת שיא T מזוהה באופן ידני בתוך שני הסמנים האחרונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-9
איור 9: חלון ניתוח. פרמטרים המשמשים את חלון הסטטיסטיקה כדי לזהות שיא R. עבור זיהוי של שיא T, לשנות סמנים (ואם יש צורך) po. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-10
איור 10: יחסי QT-RR. ( A ) דוגמה של יחסים שונים בין QT ו- RR מרווחי בין WT (LQT1 קור ) ו Long QT תסמונת סוג 1 (LQT1 R190Q ) hPSC-CMs. אזורים מוצלים מראים כי השינוי באותו מרווח RR מייצר שינוי גדול יותר במרווח QT של הקו LQT1 חולה, ולכן סביר להגדיל את הרגישות הפרעת קצב. ( B ) הקשר בין QT לא מתוקן RR המרווחים נמדד ב MEA ב CMs מ -7 שורות hPSC שונים. ההשפעה של תיקון QT עבור נוסחאות של Bazett ( C ) או Fridericia ( D ) מוצג וגלוי כמו שינוי במדרון של QT-RR ב מערכת יחסים טרואלית. דמויות המותאמות מעיון 30 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-11
איור 11: מחלות או קטלני המושרה QT ו RR מרווחי וריאציות. ( A ) דוגמא להמשך מרווח QT ב- hPSC-CM הנגזר מחולה הנושא מוטציה של תסמונת לונג-QT (LQTS) בהשוואה לשליטה WT איזוגנית. ( ב ) דוגמה של הארכת מרווח QT ב hPSC-CM על הבלוק hERG תרופתי. ( ג ) QT מרווח קיצור על הטיפול עם מינונים הולכים וגדלים של activator hERG. חץ מציין את כיוון הקיצור. ( ד ) דוגמה של תרופה המושרה RR מרווח קיצור. פאנל (C) הותאם מתוך התייחסות> 30. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

נמוכה אינסולין, BSA, polyvinylalcohol, ליפידים חיוניים (LI-BPEL) בינוני
רְכִיב כמות עבור 100 מ"ל
IMDM 43 מ"ל
F12 43 מ"ל
חומצה אסקורבית 2 פוספט (5 מ"ג / מ"ל ​​במים מזוקקים) 1 מ"ל
תוספת לתרבית תאים (תחליף ישיר ל- L-glutamine) 1 מ"ל
פניצילין / סטרפטומיצין 0.5מ"ל
פנול אדום 1 מ"ג
פרוטאין חינם היברידומה בינוני II (PFHMII) 5 מ"ל
BSA (10% wt / vol ב- IMDM) 2.5 מ"ל
PVA (5% wt / vol במים מזוקקים) 2.5 מ"ל
כימי מוגדר ליפיד להתרכז (CDLC) 1 מ"ל
אינסולין-טרנספרין-סלניום-אתנולמין (ITS-X) 100X 0.1 מ"ל
Α-Monothioglycerol (13 μL ב 1 מ"ל IMDM) 0.3 מ"ל
שלב את ריאגנטים, מסנן עם מסנן 0.22 מיקרומטר נקבוביות ולאחסן את המדיום על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.

טבלה 1: הרכב לי-פפל בינוני.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מראה כיצד לנתק ולהכין hPSC-CMs למדידת FP שלהם באמצעות MEAs. HPSC-CMs בדרך כלל להציג פעילות חשמל ספונטנית, אשר ניתן למדוד כמו FP והוא יכול לספק נתונים משמעותיים לגבי תדירות פעימות, משך הזמן QT, ואירועים אריתמיים.

דיסוציאציה של תרבויות דו-ממדיות לבביות דומות נחוצה ליצירת מחדש של שכבת מכות ב- MEA והיא מייצגת צעד קריטי. לחץ מכני על ידי פיפטינג חוזר ו / או טיפול אנזימי דיסוציאציה אגרסיבי עלול לגרום לתמותה גבוהה של תאים, אי-הצמדות לצלחת ה- MEA וחוסר פעילות ספונטאנית. פרוטוקול זה כבר מותאם במיוחד עבור תרבויות monolayer. עם זאת, גישה דומה ניתן להשתמש בתרבויות תלת מימדי (3D) ( למשל, גופים embryoid או EBS) עם שינויים קלים, כגון איסוף של EBs ואחריו לשטוף PBS ואת זמן הדגירה יותר עם האנזים מתנתק. יְבוּאAntine, בתרבויות 2D ו 3D הבדיל, המבוגר תאים מובחנים, הזמן הדגירה ארוכה ככל הנדרש ניתן לנתק את התאים בשל תצהיר מטריקס מוגברת תאיים.

פרוטוקול המתואר כאן לכימות פרמטרים FP ניתן להשתמש כדי ליצור עקומות מינון התגובה עבור תרופות cardioactive. כפי שתואר לאחרונה על ידי Cavero et al. 31 , הריכוז ההתחלתי של התרופה עלול להשפיע עמוקות על התוצאה של מדידת MEA. לכן, כדי לשפר את הדיוק ואת האמינות של התוצאות, אנו מציעים את הדברים הבאים: 1) במקרה של activators / blockers בלתי הפיך, להשתמש בכמויות גדולות יחסית של המדיום המכיל את התרופה להיבדק. עוד בפירוט, להסיר 10-50% נפח בינוני מן השבב MEA ולהוסיף נפח שווה של המדיום שבו התרופה נמסה בעבר בריכוז המתאים. במקרה זה, לצורך חישוב הריכוז הסופי של התרופה, זה קריטי כדי considאה שינוי הריכוז לאחר הסרת בינוני. 2) במקרה של activators / חוסמי הפיך, להוסיף 10 μL של כל תרופה מנה מ 100X פתרון המניה.

רוב פרוטוקולי ההבחנה הלבבית משפיעים על אוכלוסייה מעורבת משתנה של קרדיומיומיטים דמויי אטום, כמו חדר לב וכלי דם, עם סוג החדר הייצוגי ביותר. זה עשוי להוות מגבלה בעת דוגמנות מחלות לב המשפיעים על תת סוג מסוים cardiomyocyte או תרופות הפועל על ערוץ יון ספציפיים תת סוג. למרות מספר מחקרים יש אופטימיזציה התנאים כדי לכוון מפרט מבוקר יותר במהלך בידול לב 3 , 5 , 37 , 38 , תחולת רחבה שלהם עדיין תחת חקירה.

יתר על כן, יעילות משתנה של בידול (בניסויים שונים ב diקווים hPSC שונים) ניתן לראות 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . Cardiomyocyte- מעשיר אסטרטגיות המבוססות על ביטוי פני השטח של החלב 35 , 45 (על ידי מיון תא בסיוע פלואורסצנטי או על ידי בחירה חרוז מגנטי 46 , 47 ), ומבחר מטבולי 44 , 48 עשויים לייצג אסטרטגיות תקפות שניתן להחיל על כל (מהונדס גנטית או ללא שינוי) hPSC-line ציפוי מוקדם של hPSC-CMs, כדי לשפר את האות החשמלי.

למרות hPSC-CMs ידועים לשמצה בהשוואה cardiomyocytes מבוגר האדם 4 , 49 , הם הוכיחו להיות בעל ערך ב rאקפיטציה וזיהוי של שינויים ספציפיים הקשורים למחלה ( למשל , ב - channelopathies) , 19 , 20 , 50 ותגובות הנגרמות מתרופות ( למשל, חוסמי ערוץ יון לב). יתר על כן, תאים בוגרים יותר קל לנתק, להתאושש טוב יותר מאשר cardiomyocytes מבוגרים לאחר ניתוק ציפוי 44 ולכן, אי-הבגרות hPSC-CM עשוי להיות מתוגמל יתרון זה. עם זאת, כדי להיות מסוגל לסכם למשל . מחלות לב מאוחר להתרחש ולשחזר בנאמנות תגובות סמים של cardiomyocytes מבוגר, מכני יותר, מטבולית, חשמל hPSC-CM המדינה צריכה להיות מושגת. שיטות להתבגר תאים אלה כוללים זמן ממושך בתרבות 52 , זן מכני 53 , צעדה חשמל 54 , תוספת של קטןמולקולות 55 , 3D תרבות 56 , שיתוף תרבות עם סוגי תאים אחרים 57 , ואפילו שילוב של גישות אלה 58 ; עד כה, אף אחת מהגישות הללו לא הובילה לפנוטיפ דמוי מבוגר.

כחלק מהתכונות חוסר בגרות, hPSC-CMs להראות חשמל אוטומטי. הנה, פרטים מסופקים על איך לכמת במדויק QT ו RR מרווחי. מגבלה אחת של מדידת הפעילות החשמלית הספונטנית היא כי השוואה של מרווחי QT עשוי להיות קשה כאשר hPSC-CMs להציג תדרים שונים להכות. במקרה זה, נוסחאות של Bazett או Fridericia ניתן להשתמש כדי לתקן את מרווח QT עבור התדר. עם זאת, כפי שדווח בעבר 30 , אנו ממליצים בחום לבצע ניתוח רגרסיה של ציר ראשי על ידי תכנון מרווח QT לעומת מרווח RR עבור נתונים גולמיים ומתוקנים, כדי למנוע כל הטיה אפשרית עקב שיטת התיקון עצמה.

הפרוטוקול המוצג כאן, יחד עם שיטות שתוארו בעבר 59 , 60 מסייע סטנדרטיזציה של נהלים וניתוח של FPSs hPSC-CM, שיפור שחזור נתונים ומאפשר השוואה טובה יותר של תוצאות בין המעבדה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CLM הוא מייסד ומייסד של Pluriomics bv. חלק מעלויות הפרסום היה מכוסה על ידי Multi Channel Systems.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים: CVON (HUSTCARE): הולנד CardioVascular Research Initiative (קרן הלב ההולנדית, הפדרציה ההולנדית של המרכזים הרפואיים של האוניברסיטה, הארגון ההולנדי למחקר ופיתוח רפואי והאקדמיה המלכותית של הולנד למדעים); מועצת המחקר האירופית (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). אנו מודים E. ג 'קומלי (LUMC) לעזרה עם בידול hPSC לב.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ארון בטיחות ביולוגי / קולט אדים
הקלטה MEA2100 in vitro מערכותרב ערוציות
חממת תרבית תאים CO2 SanyoMCO-15A
צנטריפוגההיטאצ'יhimac-CT6EL
Leica סטריאומיקרוסקופLeica פיפטמןMS5
(P-10 (10 μ L), P-200 (200 μ L), P-1000 (1,000 μ L))טיפים לסינון הבינלאומי
(10 μ L, 200μ L, 1,000μ L)קורנינג4807 (10 μ L), 4810 (200μ L), 4809 (1000μ L)
מסנן עליון בקבוק חד פעמי (0.22 μ m גודל נקבוביות)MilliporeSCGVU02RE
פיפטה פלסטיק סטריליתGreiner Bio-One606180 (5 מ"ל), 607180 (10 מ"ל), 760180 (25 מ"ל)
פינצטהDumont
צלחות פטרי ניתנות לחיטויVWR / Duran Group391-0860
שבב MEAמערכות רב ערוציותMEA200/30iR-Ti-gr
חוצץ פוספט תמיסת מלח (PBS) סידן, מגנזיוםThermo Fisher Scientific14040-091
תמיסת מלח פוספט (PBS) ללא סידן, ללא מגנזיוםThermo Fisher Scientific14190-169
פיברונקטין רקומביננטי אנושיTebu-BioJ64560
טבעות MEA בהתאמה אישית של פוליטטרפלואורואתילן (PTFE)LUMC: המחלקה לפיתוח
מכשיריםאנזים דיסוציאציה - TrypLE Select 1xThermo Fisher Scientific12563-029
חומר ניקוי אנזים TergazymeSigma-AldrichZ273287-1EA
מים מזוקקיםThermo Fisher Scientific15230-089
NameCompanyCatalog Number הערות
ריאגנטים למדיום LI-BPEL
מדיום Dulbecco שונה של Iscove (IMDM)Thermo Fisher Scientific21056-023
F12 תערובת תזונתית (חזיר)Thermo Fisher Scientific31765-027
חומצה אסקורבית 2-פוספטסיגמא-אולדריץA8960
Glutamaxתרמו פישר סיינטיפיק35050-038
פניצילין/סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק15070-063
פנול אדוםסיגמא-אולדריץ'P3532
היברידומה ללא חלבון Medium-II (PFHMII)Thermo Fisher Scientific12040-077
אלבומין סרום בקר (BSA)Bovogen Biologicals אוסטרליהBSAS05
פולי (אלכוהול ויניל) (PVA)סיגמא-אולדריץ'P8136
תרכיז שומנים מוגדר כימית (CDLC)תרמו פישר סיינטיפיק11905-031
אינסולין-טרנספרין-סלניום-אתנולמין (ITS-X) 100xתרמו פישר סיינטיפיק51599-056
&אלפא;-מונותיוגליצרולסיגמא-אולדריץ'M6145
<חזק> שםCompanySoftware version>Comments
MC_Rackמערכות רב-ערוציות4.6.2לחלופין, ניתן להקליט נתונים באמצעות Cardio2D או MC_Experimenter (מערכות רב-ערוציות)
TCX ControlMulti Channel Systems1.3.4
MEA SelectMultichannel מערכות1.3.0
כלי MC_Dataמערכות רב ערוציות2.6.15לחלופין, ניתן להשתמש במנהל נתונים רב-ערוצי (מערכות רב-ערוציות) כאשר נדרש ייצוא נתונים מותאם אישית (HDF5, EDF, etc.)Clampfit
Molecular Devices7.0.0משמש בשלב 10.1 לניתוח, גרפים ועיצוב של כל הנתונים. כדי להשתמש ב-Clampfit, הורד והתקן את רכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים ואת ה-pClam (הגרסה העדכנית ביותר, 10.7.0), הזמין באתר האינטרנט של התקנים מולקולריים. לאחר השלמתו, הפעל את התוכנה Clampfit. לחלופין, ניתן לנתח נתונים באמצעות Cardio2D (מערכות רב-ערוציות) או קוד מותאם אישית של MatLab.
למינרי מערכת כף יד Microsystems של גילסון'

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Birket, M. J., et al. Expansion and patterning of cardiovascular progenitors derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 970-979 (2015).
  4. Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1728-1748 (2016).
  5. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7 (4), 394-410 (2015).
  6. Lewandowski, J., Kolanowski, T. J., Kurpisz, M. Techniques for the induction of human pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. J Tissue Eng Regen Med. , (2016).
  7. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  8. Davies, M. P., An, R. H., Doevendans, P., Kubalak, S., Chien, K. R., Kass, R. S. Developmental changes in ionic channel activity in the embryonic murine heart. Circ Res. 78 (1), 15-25 (1996).
  9. Bellin, M., et al. Isogenic human pluripotent stem cell pairs reveal the role of a KCNH2 mutation in long-QT syndrome. EMBO J. 32 (24), 3161-3175 (2013).
  10. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  11. Ma, D., et al. Modeling type 3 long QT syndrome with cardiomyocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells. Int J Cardiol. 168 (6), 5277-5286 (2013).
  12. Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471 (7337), 230-U120 (2011).
  13. Limpitikul, W. B., et al. A Precision Medicine Approach to the Rescue of Function on Malignant Calmodulinopathic Long QT Syndrome. Circ Res. , (2016).
  14. Liang, P., et al. Patient-Specific and Genome-Edited Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Elucidate Single-Cell Phenotype of Brugada Syndrome. J Am Coll Cardiol. 68 (19), 2086-2096 (2016).
  15. Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Mol Med. 4 (3), 180-191 (2012).
  16. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. J Cell Mol Med. 16 (3), 468-482 (2012).
  17. Bellin, M., Mummery, C. L. Inherited heart disease - what can we expect from the second decade of human iPS cell research. FEBS Lett. 590 (15), 2482-2493 (2016).
  18. Sallam, K., Li, Y., Sager, P. T., Houser, S. R., Wu, J. C. Finding the rhythm of sudden cardiac death: new opportunities using induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 116 (12), 1989-2004 (2015).
  19. Sinnecker, D., Goedel, A., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: a versatile tool for arrhythmia research. Circ Res. 112 (6), 961-968 (2013).
  20. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
  21. Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacol Ther. 143 (2), 246-252 (2014).
  22. Terrenoire, C., et al. Induced pluripotent stem cells used to reveal drug actions in a long QT syndrome family with complex genetics. J Gen Physiol. 141 (1), 61-72 (2013).
  23. Abi-Gerges, N., et al. Assessment of extracellular field potential and Ca2+ transient signals for early QT/pro-arrhythmia detection using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Pharmacol Toxicol Methods. 83, 1-15 (2016).
  24. Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
  25. Blinova, K., et al. Comprehensive Translational Assessment of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes for Evaluating Drug-Induced Arrhythmias. Toxicol Sci. , (2016).
  26. Nerbonne, J. M. Studying cardiac arrhythmias in the mouse--a reasonable model for probing mechanisms? Trends Cardiovasc Med. 14 (3), 83-93 (2004).
  27. Halbach, M., Egert, U., Hescheler, J., Banach, K. Estimation of action potential changes from field potential recordings in multicellular mouse cardiac myocyte cultures. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 271-284 (2003).
  28. Tertoolen, L. G., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun. , (2017).
  29. Rajamohan, D., et al. Automated Electrophysiological and Pharmacological Evaluation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25 (6), 439-452 (2016).
  30. Sala, L., et al. A new hERG allosteric modulator rescues genetic and drug-induced long-QT syndrome phenotypes in cardiomyocytes from isogenic pairs of patient induced pluripotent stem cells. EMBO Mol Med. 8 (9), 1065-1081 (2016).
  31. Cavero, I., Guillon, J. M., Ballet, V., Clements, M., Gerbeau, J. F., Holzgrefe, H. Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA): Pending issues for successful validation and implementation. J Pharmacol Toxicol Methods. , (2016).
  32. Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come? Br J Pharmacol. , (2016).
  33. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: at the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
  34. Dambrot, C., et al. Strategies for rapidly mapping proviral integration sites and assessing cardiogenic potential of nascent human induced pluripotent stem cell clones. Exp Cell Res. 327 (2), 297-306 (2014).
  35. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8 (12), 1037-1040 (2011).
  36. Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nat Protoc. 3 (5), 768-776 (2008).
  37. Karakikes, I., et al. Small molecule-mediated directed differentiation of human embryonic stem cells toward ventricular cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (1), 18-31 (2014).
  38. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21 (4), 579-587 (2011).
  39. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107 (21), 2733-2740 (2003).
  40. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).
  41. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  42. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  43. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
  44. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  45. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  46. Fuerstenau-Sharp, M., et al. Generation of highly purified human cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cell-derived induced pluripotent stem cells. PLoS One. 10 (5), e0126596(2015).
  47. Schwach, V., Passier, R. Generation and purification of human stem cell-derived cardiomyocytes. Differentiation. 91 (4-5), 126-138 (2016).
  48. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  49. Veerman, C. C., Kosmidis, G., Mummery, C. L., Casini, S., Verkerk, A. O., Bellin, M. Immaturity of human stem-cell-derived cardiomyocytes in culture: fatal flaw or soluble problem? Stem Cells Dev. 24 (9), 1035-1052 (2015).
  50. Karakikes, I., Ameen, M., Termglinchan, V., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes. Circ Res. 117 (1), 80-88 (2015).
  51. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).
  52. Otsuji, T. G., Minami, I., Kurose, Y., Yamauchi, K., Tada, M., Nakatsuji, N. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Res. 4 (3), 201-213 (2010).
  53. Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35 (9), 2798-2808 (2014).
  54. Lieu, D. K., et al. Mechanism-based facilitated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Arrhythm Electrophysiol. 6 (1), 191-201 (2013).
  55. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
  56. Mannhardt, I., et al. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. , (2016).
  57. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  58. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  59. Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Curr Protoc Toxicol. 68 (22), 1-22 (2016).
  60. Harris, K. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte (hiPSC-CM) Multielectrode Array Assay for Preclinical Cardiac Electrophysiology Safety Screening. Curr Protoc Pharmacol. 71, 1-15 (2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

QTRRMEA

מאמרים קשורים