מאמר שיטה

כרוני אוטואימונית יבש עין עכברוש דגם עם הגדלת זיכרון תאי זיכרון T ב Eyeball רקמות

DOI:

10.3791/55592

⸱

7 ביוני 2017

 ,  ,  , 
1Singapore Eye Research Insitute, A Member of SingHealth, 2DUKE-National University of Singapore Medical School, 3Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 4Singapore National Eye Center, 5Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוח זה מתאר שיטה להניע עין כרונית ניסויית אוטואימונית יבשה בחולדות לואיס באמצעות חיסון עם תחליב של תמצית בלוטת חולדות עכברוש, ovalbumin, adjuvant מלאה של פרוינד, ואחריו הזרקה של תמצית בלוטת דרכי ו ovalbumin לתוך subconjunctiva תת-עורית ו בלוטות דרכי שישה שבועות לאחר מכן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות עיניים יבש הוא מצב שכיח מאוד שגורם תחלואה נטל הבריאות מקטין את איכות החיים. יש צורך במודל מתאים של חיית העין היבשה לבדיקת טיפול חדשני לטיפול בתנאים של עיניים יבשות אוטואימוניות. פרוטוקול זה מתאר כרוני אוטואימונית יבש העין עכברוש המודל. עכברים לואיס היו מחוסנים עם תחליב המכיל תמצית בלוטת דרכי, ovalbumin, ו להשלים של אדג'ובנט של פרוינד. חיסון שני עם אותם אנטיגנים באדג'ובנט של פרוידינג לא הושלם כעבור שבועיים. חיסונים אלה ניתנו תת עורית בבסיס הזנב. כדי להגביר את התגובה החיסונית על פני העין ו בלוטות דרכי, תמצית בלוטת דרכי השתן ovalbumin הוזרקו subconjunctiva forniceal ו בלוטות דרכי 6 שבועות לאחר החיסון הראשון. החולדות פיתחו תכונות עיניים יבשות, כולל הפחתת ייצור הדמעות, ירידה ביציבות הדמעות ונזק מוגבר בקרנית. החיסון הפרוהגשת על ידי cytometry הזרימה הראה שפע של CD3 + זיכרון זיכרון T תאים בעין העין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת עיניים יבשות (DED) היא מחלה רב-תחומית של הדמעות ומשטח העין המוביל לתסמינים של אי-נוחות, הפרעה חזותית וחוסר יציבות בסרט, דבר שעלול לגרום נזק למשטח העין. זה מלווה על ידי osmolarity מוגברת של הסרט מדמיע על ידי דלקת של משטח העין 1 . הסימפטומים הקשורים DD הם שריפה, עקצוץ, גרידות, תחושה של גוף זר, קריעה, עייפות העין, ויובש 2 , 3 . שני הגורמים העיקריים של DED מופחת הייצור מדמיע על ידי בלוטת הפרשת מדמיע ואת אידוי יתר של הסרט מדמיע 4 . בחולים עם מחלות אוטואימוניות, כגון תסמונת סיוגרן, זאבת זאבתית מערכתית, וכן דלקת מפרקים שגרונית של דלקת מפרקים במערכת החיסונית של בלוטות המייבום מפחיתה את הביטוי של שומנים החיוניים ליציבות דמעה. כמו כן, פגיעה חיסונית על פני העין מקטין את productiעל של mucins חשוב wittability השטח. יחד, תהליכים אלה מצטברות לגרום לעין יבשה כרונית 5 , 6 , 7 .

החלפת דמעות וטיפול אנטי דלקתיות הם התווך של הטיפול. עם זאת, הטיפולים נוגדי דלקת הנוכחי עבור DED ( כלומר, סטרואידים ו cyclosporine) הם חיסונים רחב, המוביל תופעות לוואי חמורות 8 , 9 , 10 . יש צורך במודל חיים מתאים לבדיקת חומרים אימונומודולטוריים חדשים לטיפול בעין יבשה אוטואימונית.

עכברים עם פגמים גנטיים ספציפיים 11 , 12 , 13 , עכברים חסרים גנים ספציפיים 14 , 15 , עכברים מהונדס overexpressing immunoregulatגנים אורי משמשים כמודלים של עין יבשה אוטואימונית 16 , 17 . אנטיגן המושרה מודלים בעלי חיים אוטואימוניים דווחו גם בעכברים 18 , ארנבות 19 , חולדות 20 , 21 . כאן, אנו מתארים מודל אנטיגן המושרה של עין כרונית אוטואימונית יבש. מודל זה הוא שינוי של שני מודלים קודמים; אחד המשמש תמציות בלוטות דרכי, והשני המשמש autoantigen ( כלומר, klk1b22) מן בלוטות דמעות 20 , 21 .

המחלה נגרמה על ידי חיסון תת-עורקי של חולדות לואיס בנות 6 עד 8, עם ovalbumin, אדג'ובנט של פרוינד, וכן תחליב המכיל תמציות בלוטות דרכי מעכברושים של Sprague-Dawley ( איור 1 ). חיסון שני עם אותו אנטיגן באדג'ובנט של פרוידינג לא הושלםלאחר שבועיים. כדי לגייס תאים אנטיגן ספציפי החיסון כדי בלוטת דמעות משטח העין, תערובת של תמצית בלוטת דרכי ו ovalbumin (1 מ"ג / מ"ל) הוזרק לתוך subconjunctiva ו בלוטות דלקתיות ב 6 בשבוע השביעי ( איור 1 ). יותר מ 85% של חולדות פיתחה תכונות אופייניות של עין יבשה 70 ימים לאחר החיסון הראשון. תכונות אלה כוללות הפחתת הייצור מדמיע ( איור 2 ), מוגברת הקרנת פלואורצין הקרנית ( איור 3 ), וירידה בירידה דמעה ( איור 4 ). פרופיל החיסון של תאי T גלגלי העין הרגיל על ידי זרימת cytometry מגלה שפע של CD3 + זיכרון זיכרון תאים T ( דמויות 5 ו -6 ). חולדות עם אוטואימוניות DD להראות עלייה ב- CD3 + זיכרון זיכרון תאים T ו מקביל ירידה בתאי זיכרון נאיבי המרכזי זיכרון ( איור 6 ).

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעלי חיים טופלו על פי הנחיות מוסדיות ועל הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים בחקר עיניים וחזון. פרוטוקול המחקר אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת SingHealth.

1. הכנת תמצית בלוטת דלקת

הערה: חולדות היו הרדים עם הזרקת intraperitoneal של קטמין (75 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג). הרדמה נכונה אושרה על ידי צובט הבוהן וזנב צביטה. ג'ל עיניים הוחל על העיניים חולדה כדי למנוע יובש לאחר כל הליך. העכברושים הרדים הונחו תחת אורות אינפרא-אדום רחוקים כדי לשמור על החיות החמות עד להחלמה מלאה. במהלך ההליכים וזמן ההחלמה, בעלי חיים היו במעקב הדוק על ידי חוקרים. כל החומרים וכלי הניתוח היו סטריליים לפני השימוש. בסוף הניסוי, חולדות היו מורדמים על ידי הזרקת intraperitoneal של pentobarbital (80 מ"ג / ק"ג).המתת חסד מלאה אומתה על ידי חוסר דופק לב ולא רפלקס למצמץ על ידי נגיעה בעין העין. חולדות שוכנו בתנאים סטנדרטיים: טמפרטורת החדר, 21-23 מעלות צלזיוס; לחות יחסית, 30-70%; אור כהה מחזור, לסירוגין 12 שעות (7 עד 7 בערב).

  1. מניחים את חולדות Sprague-Dawley הנרצחות (טווח גילאים בין 8 שבועות ל -16 שבועות), עם אוזן אחת על השולחן והשנייה פונות כלפי מעלה. הפוך חתך 10 מ"מ מעולה - מתחת לאוזן חשוף עם זוג מספריים האביב. הסר את בלוטת הדיסק על ידי לנתח אותו מרקמת החיבור הסובבת מן צינור ניקוז.
    1. חנות הבלוטות ב -80 מעלות צלזיוס עד הנדרש. להפשיר את הבלוטות על הקרח. מינס דק ככל האפשר על קרח עם מספריים. הוסף 150 μL של PBS עם מעכב פרוטאז 1x לכל בלוטת דמעות.
  2. Sonicate את דגימות על הקרח במשך 5 דקות ב 20 קילוהרץ עם להגדיר sonicator ב 10 על, 10 שניות הנחה במשרעת 30%. צנטריפוגה את הבןדגימות icated עבור 20 דקות ב XG 13,000 ו 4 ° C.
  3. פיפטה supernatant ולהעביר אותו צינור חדש. Aliquot supernatant צינורות 1.5 מ"ל ולאחסן אותם -80 מעלות צלזיוס. למדוד את ריכוז החלבון עם assay חומצה bicinchoninic 22 , בהתאם להוראות היצרן.

2. הכנת תחליב ועמילן Toxin

  1. אֵמוּלְסִיָה
    1. הוסף 40 מ"ג של חום נהרג Mycobacterium שחפת H37Ra לתוך 10 מ"ל של adjuvant של פרוינד להשלים המכיל 1 מ"ג / מ"ל Mycobacterium שחפת H37Ra ומערבבים היטב.
      הערה: להשלים את adjuvant הסופי של Freund מכיל 5 מ"ג / מ"ל Mycobacterium שחפת H37Ra .
    2. לשקול את ovalbumin, להמיס אותו PBS, ולהכין תערובת אנטיגן המכיל 2 מ"ג / מ"ל ​​ovalbumin ו 10 מ"ג / מ"ל ​​תמצית בלוטת דרכי הלב. מכוון עבור נפח הזרקה של 200 μL עבור כל חיה, להכין תערובת אב בכמו על מספרי בעלי החיים.
    3. העברת ADJVVANT שלם של Freund או להשלים של adjuvant של Freund לצינור 50 מ"ל, להבטיח כי נפח adjuvant לתערובת אנטיגן הוא ביחס 1: 1. הוסף את תערובת אנטיגן ירידה על ידי ירידה אל adjuvant בעוד vortexing עם המהירות הגבוהה ביותר כי לא לגרום לשפכים. המשך vortexing במשך 5 דקות לאחר כל אנטיגן נוספה.
    4. מעבירים את תחליב מזרק 5 מ"ל ולקשר אותו עם מזרק 5 מ"ל אחר דרך מחבר מזרק. דחפו את האמולסיה מזרק אחד לשני כדי לערבב אותו.
      הערה: תחליב מוכן אם טיפה אחת נשארת ככדור כאשר הניח במים. רק טריים אמולסיה מוכן או מאוחסן מאוחסן לילה ב 4 ° C יש להשתמש.
  2. רעלן העובר
    1. לשחזר 50 מיקרוגרם של רעלן שעלת μL 500 של מים לעשות ריכוז סופי של 100 ng / μL. ווטקס מיכל עבור 30 s כדי לוודא את tאוקסין מתמוסס לחלוטין.
      הערה: אין לעקר על ידי סינון, שכן זה יוביל לאובדן של חומר. אל תקפא. פתרון זה נשאר פעיל לפחות 6 חודשים ב 4 ° C.
    2. לדלל 100 ng / μL של רעלן שעלת ל 3 ng / μL באמצעות PBS. העברת 100 μL של רעלן שעלת מדולל ל 1 מ"ל Luer-lock מזרק הזרקת עם מחט 27 G.

3. חיסון של חולדות לואיס

  1. ביום 0, לערבב את האמולסיה כמה פעמים. הפצת 200 μL של תחליב, המכיל 1 מ"ג של תמצית בלוטת דרכי ו 200 מיקרוגרם של ovalbumin ב adjuvant של פרוינד מלאה, לתוך 1 מ"ל לואר- lock מזרקים עם מחטים 27G. להזריק את תחליב תת עורית בבסיס זנב חולדה ללא הרדמה.
    הערה: הזנב אינו צריך להיות מראש חימם לפני ההזרקה. כל עכברוש הוא מחוסן עם 1 מ"ג של תמצית בלוטת דרכי ו 200 מיקרוגרם של ovalbumin ב להשלים של אדג '500 מיקרוגרם של Mycobacterium שחפת H37Ra .
  2. ביום 14, להזריק 200 μL של תחליב, המכיל 1 מ"ג של תמצית בלוטת דרכי ו 200 מיקרוגרם של ovalbumin ב adjuvant שלם של Freund, באותו אופן כמו ביום 0. להזריק 300 ננוגרם של רעלן שעלת ב 100 μL של PBS intraperitoneally לכל עכברוש באותו יום.

4. הזרקה של תערובת אנטיגן לתוך Subconjunctiva Forniceal ו בלוטת דמעות לגייס תאים אנטיגן ספציפי החיסון לגרום דלקת מקומית

  1. חישוב כמות של ovalbumin ו דלקת הבלוטות דלקת מבוסס על מספר חולדות בניסוי. לשקול את הכמות הנדרשת של ovalbumin ולשלב אותו עם תמצית בלוטת דמעות מופשר מוכן בשלב 1, מה שהופך פתרון אנטיגן המכיל 1 מ"ג / מ"ל ​​ovalbumin ו 1 מ"ג / מ"ל ​​תמצית בלוטת הדמעות.
  2. להרדים את החולדות עם קטמין (75 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) על ידי הזרקה intraperitoneal. צבוט אתEs של חולדות כדי להבטיח הרדמה נאותה הושגה ( כלומר, אין תגובה התנועה הוא ציין לאחר קמצוץ). להזריק 5 μL של אנטיגן לתוך subconjunctiva forniceal של העין. להזריק 20 μL של אנטיגן לתוך בלוטת דמעות.

5. הערכה של תכונות עין יבשה

הערה: עבור צעדים 5.1-5.3, עכברים הרדים צריך להיות מוחזק בעדינות על ידי יד כפפה במצב זקוף על משטח שטוח, כדי למנוע תנועה.

  1. למדוד את נפח הדמעה עם חוט אדום פנול.
    1. השתמש זוג אחד של מלקחיים להחזיק את החוט ועוד למשוך את העפעף התחתון של עכברוש. מניחים את החוט בפינה הפרוקסימלית של fornix התחתון במשך דקה 1 ולאחר מכן להסיר את פתיל.
      הערה: הדמעות הופכות את החלק הרטוב של החוט אדום לצבע.
    2. צלם תמונה של אורך החלק הרטוב של החוט ליד סרגל עם סימוני מילימטר. מדוד את אורך הרטבה לעשיריתFa millimeter באמצעות תוכנת תמונה ( למשל, ImageJ).
  2. מדוד את הקרנית / החלקות.
    1. מניחים את החולדה תחת stereomicroscope מצויד מאיר טבעת ומצלמה. החל 5 μL של מלוחים על הקרנית חולדה. פסיבי למצמץ על ידי הזזת העפעפיים העליונים והתחתונים עם אצבעות כפפות ~ 5 פעמים כדי להפיץ את מלוחים.
    2. פוקוס את הטבעת מאירה על משטח משטח הקרנית תחת הגדלה 1.6x. רכישת תמונות צילום לאחר 10 s.
      הערה: מאירה הטבעת פרויקטים שתי שורות מעגליות של תמונות נקודה על הקרניות של החיה. ריווח קבוע של הנקודות הבלתי מסודרות מציע שכבה חלקה של הקרנית / דמעה.
  3. מדוד נזק הקרנית עם מכתים פלואורסצין.
    1. הוסף 2 μL של 0.2% פלואורסצין הקרנית עכברוש. פתח וסגור את העפעפיים חולדה 3 פעמים עם אצבע כפפה כדי להפיץ את צבע פלואורסצין על פני העין.
    2. לאחר 1 דקות, לצייר 1 מ"ל של תמיסת מלח עם מזרק 3 מ"ל (ללא כל המחט המחט), למקם את המזרק על 2-3 מ"מ הקדמי לקרנית, בעדינות להניע מלוחים על העין.
    3. לרכוש תמונות תחת מסנן כחול קובלט ( כלומר, ~ 400 ננומטר) של מיקרוסקופ הדמיה ocular עם אורות הרקע כבוי.
      הערה: תמונות לאחר מכן נותחו על ידי מערכת לדירוג שונה מפרסומים קודמים 23 . תמונות נותחו על ידי סובייקטיבי לדירוג מספר, אזור ועוצמה של כתמים ירוקים מ 0 עד 2, שם 0 מציין שלהם נעדר, 1 מציין מכתים לדקלם של פחות מ 50 מקומות, ו 2 מציין מכתים לנקב של יותר מ 50 מקומות.
  4. להרדים את החולדות דרך הזרקת intraperitoneal של pentobarbital (80 מ"ג / ק"ג). הסר את העפעפיים העליונים והתחתונים באמצעות מספריים. תקן ו לצנוח את eyeballs ידי לחיצה על רקמות periocular עם מלקחיים. חינם את העולם על ידי ניתוק tהוא שריר חוץ, העצב האופטי, ואת הלחמית.
  5. לתקן את המיקום של גלגל העין חולדה עם מלקחיים ולפתוח אותו עם חתך היקפי לאורך קו המשווה. הסר את העדשה הזגוגית. שים את גלגלי העין גזור לתוך צינורות 1.5 מ"ל על הקרח.
  6. איסוף בלוטות דרכי, כמתואר בשלב 1.1. מיד להעביר את גידולי העין גזור ובלוטות דרכי למעבדה להתכונן ניתוח cytometry זרימה.
  7. מבודד את תאי החיסון עם collagenase ו dispase II שיטות העיכול 24 , 25 . המשך להשתמש cytometry הזרימה לפרופיל תת T-subbopulation ברקמות העין 26 .
    הערה: לוח הנוגדנים הוא: אנטי CD4APC-Cyanine7 (OX-1), אנטי CD3 BV421 (1F4), אנטי CD4 PE-Cyanine7 (OX-35), אנטי CD45RC Alexa647 (OX-22), אנטי -CD62 PE (HRL1), נגד CD44 FITC (OX-50), ואת הכדאיות תא צבע 7-AAD. בין CD45 + CD3 + CD + CD45RC + ), זיכרון המפעיל (T EM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - ), וזיכרון מרכזי (T CM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + ) .

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 ממחיש את תכנון הניסוי. ביום שני 48 ו יום 70, עין יבש תכונות קליניות מוערכים חולדות מחוסנים. נפח הדמעה מיוצג על ידי אורך החלק הרטוב של פתיל אדום פנול. איור 2 מציג תמונות נציג של פנול אדום הנושאים מן השליטה חולדות DED. אורך החוט פנול אדום בקבוצת DED קצר מקבוצת הביקורת, המציין נפח דמעה פחות.

פלואורצין נקשר אפיתל הקרנית פגום. לפיכך, נזק הקרנית נמדדת על ידי מכתים פלואורצין הקרנית. כתמים פלואורסצין על פני הקרנית של חולדות DED דורגו בין 0 ל 2 ו לעומת חולדות שליטה. חולדות עם D יש יותר פלואורצין מכתים מאשר חולדות שליטה ( איור 3 ), דבר המצביע על נזק הקרנית.

חלקות הקרניתב DED חולדות שליטה הוערך על ידי מאיר הטבעת. אם משטח הקרנית הוא חלק, עם יציבות מדמיע גבוהה, את התמונה של טבעת מאירה על פני העין הוא עגול ומושלם. עיוות התמונה מצביע על ירידה בחלקה של הקרנית ובדמעה לא יציבה. דרגת העיוות של הטבעת דורגה בין 0 ל -2. דרגת עיוות טבעת גבוהה יותר נרשמה בקבוצת ה- DED ( איור 4 ), דבר המצביע על יציבות פחות מדמיע.

חולדות מוגדרות כבעלות עין יבשה כאשר לפחות שתי תכונות קליניות של עין יבשה הן חריגות. בין 24 החולדות שחוסנו, 21 חולדות פיתחו DD ביום 48. התוצאות היו עקביות כאשר הוערכו ביום 70.

ניתוח cytometry הזרימה מראה כי המשנה העיקרית תא משנה ב רגיל גלגל העין רקמות הם תאים זיכרון T ממריץ ( איור 5 ). ב eyeballs של חולדות DD, ~ 70% של CD3+ תאים T הם תאים זיכרון T effector, בעוד חולדות שליטה, מספר זה הוא ~ 50%. גלגלי עכברים DED יש גבוה משמעותית זיכרון תאים T effector מאשר אלה של חולדות שליטה ( איור 6 ).

figure-results-1
איור 1: סכמטי של העיצוב הניסויי. LG: בלוטת דמעות; DD: מחלת עיניים יבשה; CFA: adjuvant של פרוינד להשלים; IFA: אדג'ובנט לא שלם של פרוינד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2: פתיל אדום פנול מדוד את נפח הדמעות. חוט פנול אדום ממוקם בפינה הפרוקסימלית של שתי העיניים חולדה למשך 1 דקות ולאחר מכן הוסר. ייצוגE תמונות של פתיל אדום פנול, יחד עם שליט, הן קבוצות שליטה DD מוצגים. ImageJ שימש למדוד את אורך החלק הרטוב של פתילים אדומים פנול. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3: תמונות נציג של הנזק אפיתל הקרנית נמדד על ידי מכתים פלואורסצין. כל קורנית עכברוש היה מוכתם עם 0.2% פלואורסצין במשך 1 דקות סומק עם לפחות 1 מ"ל של תמיסת מלח. התמונות צולמו תחת מיקרוסקופ הדמיה עין עם אור כחול כחול. העמודה הראשונה מציגה תמונות מייצגות של קרניות שליטה. העמודה השנייה מכילה תמונות נציג של מכתים הקרנית מחולדות עם תכונות DED. כתמי הניאון הירוקים מצביעים על אפיתל הקרנית נזק. כל התמונות הופקו באותו קנה מידה צבעוני. כימות של מכתים פלואורסצין בוצע על פי השטח ואת הצפיפות של כתמים ירוקים. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 4: נציג קורנה תמונות מציג את השתקפות של מאיר הטבעת. קרני עכבר / מדמיע חלקות נמדדה על ידי מנורה טבעת. דרגת העיוות של הטבעת בתמונות שנתפסו היא מידה של יציבות דמעה יחסית. העמודה השמאלית מציגה את התמונות המייצגות בחיות בקרה, ואת העמודה הימנית מציגה תמונות נציג לאחר אינדוקציה של עין יבשה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ.אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5
איור 5: נקודות מגרש נגזר מניתוח זרימת cytometry. תאי T מבודדים מרקמות העין היו מוכתמים בחלונית של נוגדנים. ב CD45 + CD3 + 7AAD - האוכלוסייה, CD3 + 7-AAD - T תאים היו נשלטים. בין תאי CD3 + 7-AAD - T, זיכרון נאיבי, זיכרון מרכזי, ואוכלוסיות זיכרון תאים מסוג T נקבעו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-6
איור 6: פרופיל תא T-cell בעין. CD3 + CD45RC+ תאי נאיבי, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - זיכרון זיכרון T (T EM ) תאים, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + זיכרון מרכזי T (T CM ) תאים מוצגים כאחוז של תאי CD3 + T. התוצאות הן מ 3 חולדות שליטה 6 חולדות DED. תוצאות דומות הושגו מניתוח של תאי T מבדיקות דלקתיות בודדות (נתונים לא מוצגים). מבחן הסטודנט של הסטודנט הלא-מנוצל שימש להשוואה סטטיסטית. סורגי השגיאה מייצגים את ה- SD. * P <0.05, ** p <0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלב קריטי של פרוטוקול זה הוא להבטיח את ההומוגניות של תחליב. ב אמולסיות מוכן היטב, אנטיגנים מצופים לחלוטין עם שמן, הבטחת שחרור איטי של אנטיגן מוזרק גירוי חיסון מתמשך. תכונה קריטית נוספת של פרוטוקול זה הוא השימוש של חולדות לואיס. חולדות לואיס רגישות יותר להתפתחות של מחלה אוטואימונית מאשר זנים אחרים 27 .

פרוטוקול זה שונה משני פרוטוקולים שפורסמו בעבר, אשר גם השתמשו תמצית בלוטת דרכי רק או רקומביננטי Klk1b22 20 , 21 . בפרוטוקול הנוכחי, ovalbumin פלוס תמצית בלוטת דרכי משמשים אנטיגן, ותאי החיסון אנטיגן ספציפי נמשכים אל פני השטח ocular ואת בלוטת דמעות, גרימת נזק לרקמות המקומי. עין יבשה מתפתחת לאט, להגיע ~ 85% על ידי יום 48 לאחר החיסון הראשוני. אתגר אנטיגניהעין והבלוטת דמעות ביום 48 מחריפה את העין היבשה ומבטיחה את הכרוניות עד ליום 70.

בהשוואה Klk1b22 רקומביננטי במודל DLC דמויי Klk, תמצית בלוטת דרכי ו ovalbumin המשמשים את המודל הנוכחי הם זולים יותר וקלים יותר להשיג. תמצית בלוטת הדמעות מכילה גם חלבונים אחרים, מלבד Klk, שעשויים לעורר אוטואימוניות, ולכן תמצית זו היא בעלת עוצמה תיאורטית יותר משיטת ה- Klk בהפיכת DED. ניסינו גם לחסן חולדות עם תמצית בלוטת דמעות בלבד; אם כי חולדות אלה חוסנו פיתחו DED, לא היה גידול משמעותי של תאים T זיכרון זיכרון במעין רקמות העין לעומת בקרות.

המגבלה של טכניקה זו היא כי זה לוקח 70 ימים כדי להשיג את המודל. זיכרון זיכרון תאי T הם התאים העיקריים תא T בעין חולדה רגילה. במודל זה, תוצאות אוטואימוניות DED עלייה בתאי T זיכרון CD3 + מייצג בעין העין. סמים כי prefלדכא מעכב זיכרון T ממריץ, כגון מעכבים סלקטיביים של ערוץ אשלגן Kv1.3, ולכן עשויים להיות תועלת טיפולית על DD 28 אוטואימונית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים. LT קיבל מימון מראש ו / או מתנות מאלקון, אלרגן, סנטן, באוש ולומב, איילנס ואידטק.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לגב 'טין מיני צ'י וד"ר ולוצ'מי אמוטהה באראתי והצוות שלה על עזרתם בטיפול בבעלי החיים. עבודה זו נתמכה על ידי NHIC-I2D-1409007, קרן SingHealth SHF / FG586P / 2014, ו- NMRC / CSA / 045/2012.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
קוקטייל מעכב פרוטאזSigma-AldrichP2714-1BTL
Pierce BCA ערכת בדיקת חלבוןThermal Scientific23227
Mycobacterium tuberculosis H37Ra בקטון, דיקינסון וחבריו231141
להשלים את האדג'ובנט של פרוינדבקטון, דיקינסון וחבריו231131
ovalbuminSigma-AldrichA5503-10G
האדג'ובנט הלא שלם של פרוינד סיגמא-אולדריץ'F5506-6X10ML
רעלן שעלת סיגמא-אולדריץ'P7208-50UG
תמיסת נתרן פלואורסצאיןבאוש & Lomb UK LimitedNA
strong>Name>CompanyCatalog Number>Comments
Equipment
SonicatorSonics פנול Vibra-Cell
טיאנג'ין ג'ינגמינג פיתוח טכנולוגי חדש ושות' בע"מ
מיקרוסקופ סטריאו NA עם תאורת אור טבעת ומצלמהמיקרוסקופ קרל זייסNA
Micro IV מעבדות מחקר פניקסNA
<חוט אדום

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). Ocul Surf. 5 (2), 75-92 (2007).">The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). Ocul Surf. 5 (2), 75-92 (2007).
  2. Etiology, prevalence, and treatment of dry eye disease. Clin Ophthalmol. 3, 405-412 (2009).">Gayton, J. L. Etiology, prevalence, and treatment of dry eye disease. Clin Ophthalmol. 3, 405-412 (2009).
  3. The dry eye. Praxis (Bern 1994). 102 (13), 803-805 (2013).">Tong, L., Tan, J., Thumboo, J., Seow, G. The dry eye. Praxis (Bern 1994). 102 (13), 803-805 (2013).
  4. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Dtsch Arztebl Int. 112 (5), 71-81 (2015).">Messmer, E. M. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Dtsch Arztebl Int. 112 (5), 71-81 (2015).
  5. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Curr Allergy Asthma Rep. 14 (1), 403(2014).">Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Curr Allergy Asthma Rep. 14 (1), 403(2014).
  6. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Arch Ophthalmol. 130 (1), 90-100 (2012).">Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Arch Ophthalmol. 130 (1), 90-100 (2012).
  7. The eye: a window of opportunity in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (9), 552-560 (2014).">Tong, L., Thumboo, J., Tan, Y. K., Wong, T. Y., Albani, S. The eye: a window of opportunity in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (9), 552-560 (2014).
  8. Ocular complications of topical, peri-ocular, and systemic corticosteroids. Curr Opin Ophthalmol. 11 (6), 478-483 (2000).">Carnahan, M. C., Goldstein, D. A. Ocular complications of topical, peri-ocular, and systemic corticosteroids. Curr Opin Ophthalmol. 11 (6), 478-483 (2000).
  9. Development of a cyclodextrin-based aqueous cyclosporin A eye drop formulations. Int J Pharm. 493 (1-2), 86-95 (2015).">Johannsdottir, S., Jansook, P., Stefansson, E., Loftsson, T. Development of a cyclodextrin-based aqueous cyclosporin A eye drop formulations. Int J Pharm. 493 (1-2), 86-95 (2015).
  10. Efficacy of cyclosporine 0.05% eye drops in Stevens Johnson syndrome with chronic dry eye. J Ocul Pharmacol Ther. 29 (3), 372-377 (2013).">Prabhasawat, P., Tesavibul, N., Karnchanachetanee, C., Kasemson, S. Efficacy of cyclosporine 0.05% eye drops in Stevens Johnson syndrome with chronic dry eye. J Ocul Pharmacol Ther. 29 (3), 372-377 (2013).
  11. Severe destructive autoimmune lesions with aging in murine Sjogren's syndrome through Fas-mediated apoptosis. Am J Pathol. 156 (5), 1557-1564 (2000).">Ishimaru, N., et al. Severe destructive autoimmune lesions with aging in murine Sjogren's syndrome through Fas-mediated apoptosis. Am J Pathol. 156 (5), 1557-1564 (2000).
  12. Sialadenitis in the MRL-l mouse: morphological and immunohistochemical characterization of resident and infiltrating cells. Immunology. 60 (4), 611-616 (1987).">Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Holmdahl, R., Klareskog, L. Sialadenitis in the MRL-l mouse: morphological and immunohistochemical characterization of resident and infiltrating cells. Immunology. 60 (4), 611-616 (1987).
  13. Immunohistochemical characterization of sialadenitis in NZB X NZW F1 mice. Clin Immunol Immunopathol. 42 (1), 93-101 (1987).">Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Klareskog, L. Immunohistochemical characterization of sialadenitis in NZB X NZW F1 mice. Clin Immunol Immunopathol. 42 (1), 93-101 (1987).
  14. A T cell intrinsic role of Id3 in a mouse model for primary Sjogren's syndrome. Immunity. 21 (4), 551-560 (2004).">Li, H., Dai, M., Zhuang, Y. A T cell intrinsic role of Id3 in a mouse model for primary Sjogren's syndrome. Immunity. 21 (4), 551-560 (2004).
  15. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).">Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
  16. Exocrinopathy resembling Sjogren's syndrome in HTLV-1 tax transgenic mice. Nature. 341 (6237), 72-74 (1989).">Green, J. E., Hinrichs, S. H., Vogel, J., Jay, G. Exocrinopathy resembling Sjogren's syndrome in HTLV-1 tax transgenic mice. Nature. 341 (6237), 72-74 (1989).
  17. Development of autoimmunity in IL-14alpha-transgenic mice. J Immunol. 177 (8), 5676-5686 (2006).">Shen, L., et al. Development of autoimmunity in IL-14alpha-transgenic mice. J Immunol. 177 (8), 5676-5686 (2006).
  18. Immunopathology of experimental autoallergic sialadenitis in C3H/He mice. Clin Exp Immunol. 75 (3), 471-476 (1989).">Hayashi, Y., Hirokawa, K. Immunopathology of experimental autoallergic sialadenitis in C3H/He mice. Clin Exp Immunol. 75 (3), 471-476 (1989).
  19. Experimental autoimmune dacryoadenitis: purification and characterization of a lacrimal gland antigen. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (6), 2029-2036 (1992).">Liu, S. H., Zhou, D. H. Experimental autoimmune dacryoadenitis: purification and characterization of a lacrimal gland antigen. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (6), 2029-2036 (1992).
  20. Experimental autoimmune dacryoadenitis. I. Lacrimal gland disease in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 28 (2), 270-275 (1987).">Liu, S. H., Prendergast, R. A., Silverstein, A. M. Experimental autoimmune dacryoadenitis. I. Lacrimal gland disease in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 28 (2), 270-275 (1987).
  21. A new model of experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca (KCS) induced in Lewis rat by the autoantigen Klk1b22. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 2245-2254 (2009).">Jiang, G., et al. A new model of experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca (KCS) induced in Lewis rat by the autoantigen Klk1b22. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 2245-2254 (2009).
  22. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).">Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  23. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride. Mol Vis. 17, 257-264 (2011).">Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride. Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
  24. Flow cytometric detection of lymphocyte proliferation in eyes with immunogenic inflammation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 31 (10), 2111-2122 (1990).">Cousins, S. W., Streilein, J. W. Flow cytometric detection of lymphocyte proliferation in eyes with immunogenic inflammation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 31 (10), 2111-2122 (1990).
  25. Dynamic change in natural killer cell type in the human ocular mucosa in situ as means of immune evasion by adenovirus infection. Mucosal Immunol. 9 (1), 159-170 (2016).">Yawata, N., et al. Dynamic change in natural killer cell type in the human ocular mucosa in situ as means of immune evasion by adenovirus infection. Mucosal Immunol. 9 (1), 159-170 (2016).
  26. Chronic dry eye disease is principally mediated by effector memory Th17 cells. Mucosal Immunol. 7 (1), 38-45 (2014).">Chen, Y., Chauhan, S. K., Lee, H. S., Saban, D. R., Dana, R. Chronic dry eye disease is principally mediated by effector memory Th17 cells. Mucosal Immunol. 7 (1), 38-45 (2014).
  27. The origin of the autoimmune disease-resistant LER rat: an outcross between the buffalo and autoimmune disease-prone Lewis inbred rat strains. J Neuroimmunol. 44 (2), 215-219 (1993).">Goldmuntz, E. A., et al. The origin of the autoimmune disease-resistant LER rat: an outcross between the buffalo and autoimmune disease-prone Lewis inbred rat strains. J Neuroimmunol. 44 (2), 215-219 (1993).
  28. The functional network of ion channels in T lymphocytes. Immunol Rev. 231 (1), 59-87 (2009).">Cahalan, M. D., Chandy, K. G. The functional network of ion channels in T lymphocytes. Immunol Rev. 231 (1), 59-87 (2009).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים