הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידה חוזרת של פעילות שרירי הנשימה ואת אוורור בעכברי מודל של המחלה שרירית

13.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55599

⸱

17 באפריל 2017

 ,  ,  , 
1Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati, 2Department of Biological Sciences, Wright State University, 3Division of Neurosurgery, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג שיטה מדידות חוזרות של אוורור ופעילות שרירי הנשימה בתוך טרשת לרוחב amyotrophic מתנהג בחופשיות במודל של עכברים (ALS) לאורך התקדמות המחלה עם plethysmography הגוף כולו ואת electromyography באמצעות מכשיר טלמטריה מושתל.

תקציר

שרירי הנשימה אביזר לעזור לשמור אוורור כאשר פונקציה הסרעפת נפגעת. הפרוטוקול הבא מתאר שיטת מדידות חוזרות לאורך שבועות או חודשים של פעילות שריר נשימת אבזר תוך מדידת אוורור בו זמנית הלא מורדם, עכבר מתנהג בחופשיות. הטכניקה כוללת את ההשתלה כירורגית של משדר רדיו ואת החדרת אלקטרודה מובילה לתוך השרירים השווים צלעות ו טרפז כדי למדוד את פעילות electromyogram של שרירי שאיפה אלה. אוורור נמדד plethysmography הגוף כולו, ותנועת חיה נבחנת על ידי וידאו מסונכרן עם פעילות electromyogram. מדידות של פעילות שריר ואוורור במודל של עכברים של טרשת לרוחב amyotrophic מוצגות להראות איך הכלי הזה יכול לשמש כדי לחקור שינויים בפעילות השרירים איך נשימה לאורך זמן כדי להעריך את ההשפעה של פעילות שרירים על אוורור. השיטות שתוארו יכולות דוארasily להתאים למדוד את הפעילות של שרירים אחרים או להעריך פעילות שריר נשימת אבזר בעכברי מודל נוסף של מחלה או פציעה.

מבוא

שרירי הנשימה אביזר (נשק) להגדיל אוורור בתקופות של ביקוש גבוה (למשל, פעילות גופנית) ולעזור לשמור אוורור כאשר פונקציה הסרעפת נפגעת בעקבות פציעה או מחלה 1, 2. למרות שינויים בתפקוד הסרעפת תוארו היטב טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) בחולים ועכבר מודלים 3, 4, 5, 6, הרבה פחות ידוע על פעילות או פונקציה של נשק ALS. עם זאת, מחקר אחד הציע כי חולי ALS המגייסים נשק בעלי פרוגנוזה טובה יותר מאשר אלו עם תפקוד הסרעפת דומה כי לא 7. יתר על כן, פעילות ARM מספיק נשימה במקרים של סרעפת שיתוק 8. מחקרים אלו מצביעים על כך אסטרטגיות להגדלת פונקציה ARM עשוי לשפר breathing בחולים הסובלים ממחלת שרירית, פגיעה בחוט השדרה, או תנאים אחרים בהם פונקציה הסרעפת נפגעת. עם זאת, מנגנוני שליטת גיוס ARM לנשימה אינם ידועים ברובם. שיטות למדידת תפקוד נשימה ושינויים בפעילות ARM לאורך זמן במודלים של בעלי חיים למחלות או פציעה יש צורך ללמוד איך זרועות גייס, כמו גם להעריך טיפולים כדי לשפר ARM גיוס ואוורור. יתר על כן, הפעילות המוגברת של נשק בד בבד עם האובדן ההדרגתי של תפקוד סרעפת עשויה להיות סמן ביולוגי שימושי עבור התקדמות מחלה במחלות עצבות-שריר כגון 7 ALS, 9, 10.

פרוטוקול זה מתאר שיטה הלא פולשני (בעקבות הניתוח הראשוני) שוב ושוב למדוד את הפעילות של שרירי נשימה ואוורור ב ערים, עכברים מתנהגים. הקלטות מסונכרנות של electromyography (EMG), כל הגוף plethysmography (WBP), ווידאו לאפשר לחוקר להעריך כיצד שינויי אוורור השפעת פעילות ARM ולקבוע כאשר הנושא נמצא במנוחה או נע. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא שהיא יכולה להתבצע ערים, עכברים מתנהגים, בעוד כמה שיטות חלופיות כדי למדוד EMG דורש הרדמה ו / או הליכים הטרמינל 11, 12, 13. ההקלטה של פעילות EMG בעכברים ערים לאורך הזמן עשויה גם להתבצע באמצעות ההשתלה הכרונית של EMG המוביל, שבו העכבר קשור ידי חוטים למערכת הרכישה 14, 15. בגלל קשירת עכבר יכול להפריע לתנועה נורמלית או התנהגות לא יכולה להיות תואמת עם תא plethysmography סטנדרטי, השיטה המתוארת משתמשת התקנים טלמטריה לשדר אות EMG באופן אלחוטי אל מערכת הרכישה. המשדר יכוללהיות מופעל או כבוי עם מגנט כדי לחסוך בסוללה ומאפשר מדידות חוזרות של פעילות EMG על פני כמה חודשים. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות למדוד את הפעילות של שרירי נשימה נוספים או אי-נשימה על ידי החדרת EMG מוביל לתוך שרירים שונים. לחלופין, אחד משני המובילות עשוי לשמש למדידת פעילות EEG להעריך מצב שינה או לזהות התקף פעילות 16. טכניקה זו שימשה בהצלחה למדוד שינויים בפעילות ARM במנוחה לאורך התקדמות המחלה במודל של עכברים של ALS ולזהות נוירונים המפתח נהיגה פעילות ARM בעכברים בריאים 10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוצדורות אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי המרכז רפואי בית החולים בסינסינטי הילדים ועדת השימוש ונצחו בהתאם מדריך NIH לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה.

1. הכנות לקראת ניתוח שתל התקן טלמטריה

  1. שים על ציוד מגן אישי (כלומר, סקראבס, כיסויי נעליים, חלוקה, נטו שיער, מסכה, כפפות כירורגים).
    הערה: ניתוח זה דורש שדה סטרילי.
  2. הפעל את החממה (אינקובטור לתינוק אדים / שבשליטת סרוו מוגדר 29 ° C) וקו במגבות יבשות, לבנות לאפשר התחממות נאה להתאוששות.
  3. לפני הניתוח, לעקר את כל מכשירי הניתוח עם אתילן אוקסיד לעקר את המשדר עם חומר ניקוי אנזימטי sterilant הכימי (או כפי שצוין על ידי היצרן) לפני השימוש.
    הערה: מכשירי כירורגיים צריכים לכלול מלקחי laminectomy 2 # (טיפי תקן / ישר / 12 סנטימטרים) (x4), צרהמלקחי דפוס (סנטימטר משונן / מעוקל / 12), מספרי הפרדת רקמות (ישר / בוטים-בוטים / 11.5 סנטימטרים), וגם בעל אזמל להב. מומלץ יש סט נפרד של מכשירים מעוקרים (שני # 2 מלקחיים ומספריים) שמורים באופן בלעדי לטיפול החוטים של המשדר לשמור את כלי ניתוח במצב טוב.
  4. לעקר את כל המשטחים בתחום כירורגית עם חומר חיטוי מקובל. מקם מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו, מכונת הרדמה isoflurane, כלים כירורגיים, ו קוצץ בתחום הכירורגי (ראו טבלה של חומרים).
  5. כדי לשמור על טמפרטורת גוף עכבר תוך בהרדמה, הניח כרית חימום או שמיכת מים מתחת למגבת סטרילי מול המיקרוסקופ לנתיחת סטריאו.
  6. ודא כי משדר היא מתפקדת במלואה לפני השימוש.
    הערה: מגנט קטן ממוקם בתוך 2 ב של המשדר יהפוך את המכשיר ולכבות. כאשר המשדר נמצא על והחזיק קרוב raDio להגדיר בתדר AM 500 הרץ, זה ישמיע רעש זמזום מתמשך, צורמני. כדי לחסוך בחיי סוללה, להפוך את הסוללה מעל לפני השתלת אותו החיה.
  7. הכן את האלקטרודה מוביל לפני ניתוח על ידי זמירה מובילה דיסטלי עם המספריים שמורים לטיפול חוטים כך שיש כ 3 סנטימטר של עופרת (מספיק כדי להגיע שריר היעד) (איור 1A). לחלופין, סליל חוטים הפרוקסימלי למכשיר ולקשור אותם יחד עם התפרים כך שיש כ 3 ס"מ של עופרת uncoiled.
    הערה: שמור את החלק הגזוז-off של האלקטרודה מוביל על מנת להכין "כובעי עופרת" (מעטפת מבודדת פלסטיק), כפי שמתואר בשלב 1.9. בשלב 3, מוביל המשדר יוכנס דרך השריר, כך ואת החלק הדיסטלי, חשופים של החוטים חייב להיות מוחזק במקום מבודד באמצעות מכסי עופרת.
  8. השתמש אזמל לקצץ את 0.5 ס"מ המארז בלי לחתוך את החוט עצמו. השתמש בכלים השמורים FOטיפול חוט r למתוח את הקצוות של לידים 4 - 5x אורך המקורי שלהם, כך שהם מתאימים בקלות בתוך מחט 25-מד (איור 1B-B ""). חתוך את החוט החשוף של לידים כך שהם 0.5 ס"מ אורך.
  9. הכין כובעי עופרת (צינורות פלסטיק כדי לכסות את קצות החוט) לפני הניתוח. השתמש אזמל לקצץ את צינורות 0.25 ס"מ באורך ממעטפת פלסטיק סביב קטעים של האלקטרודה מוביל הציל משלב 1.7.
    הערה: ארבעה כובעים להוביל נדרשים עבור כל עכבר כי יעבור השתלה, אבל עדיף להכין הכמות כפולה של כמוסות הנדרשות. לאחר כובעים מוכנים להוביל סטרילי נוספים הוא מועיל במקרה הבטחה כובע עופרת אינו מצליח על הניסיון הראשון.
  10. רשום את המספר הסידורי של המשדר המוכנס ולשמור את האריזה המקורית עם המידע המכויל. לכל משדר כיולי תדר שונים עבור הקלטת EMG; והזן אותן תוכנות הרכישה להשיג מקובל EMGהקלטות.

2. הכנת עכבר לכירורגיה

  1. בחר את העכבר הרצוי עבור השתלה (כלומר, SOD1 (G93A) או מלא) ולשקול את החיה.
    הערה: הגיל המומלץ והמשקל עבור עכבר (זכר או נקבה) שעברה ניתוח זה הוא P56 - P120 ו ≥ 24 גרם, בהתאמה.
  2. להרדים את העכבר תחת isoflurane 3.5% עם שיעור זרימת חמצן 2 ליטר / דקה. בצע קמצוץ בוהן קמצוץ זנב לוודא כי העכבר הוא בהרדמה מלאה.
  3. לאחר מורדם, להסיר את העכבר מתפריט הבחירה ולשמור הרדמה באמצעות חרטומו ידי הגדרת רמת isoflurane ל 1.5% ואת קצב זרימת חמצן 1 L / min. בצע קמצוץ הבוהן ו / או זנב קמצוץ לוודא כי הרדמה נשמרת.
  4. החל משחת עיניים סיכה כדי למנוע את העיניים מהתייבשות במהלך הניתוח.
  5. לגלח את העכבר כדי לחשוף אתר כירורגי בין האוזן לכתף (1C איור).
  6. קליפ ציפורני ipsilateral לאתר הכירורגים כדי להקטין את הסיכוי של העכבר תליש המוביל או גרימת פצעים על ידי הגירוד במהלך תהליך הריפוי.
  7. Alternate בניקוי האתר כירורגית, ראשון עם חיטוי ולאחר מכן עם isopropanol. חזור על 2 פעמים יותר.

3. השתלת מכשיר טלמטריה כדי להקליט Scalene ו הטרפז EMG פעילות

  1. מניח את החיה מתחת למיקרוסקופ לנתיחה, על צידו על גבי כרית מחוטא כרית חימום, ולאבטח את חרטומו במקום עם קלטת. שים לב עדיף לשתול בצד ימין כדי להפחית אות א.ק.ג. שמקורם בלב.
    הערה: צג נשימה ולהתאים את רמות isoflurane, במידת צורך, כדי לשמור על קצב נשימה רגיל ו מטוס כירורגית מתאים של הרדמה.
  2. משוך את forelimb לכיוון הרגל ipsilateral לאורך הגוף.
    הערה: עמדה זו דוחקת את עצם השכם caudally, מתן גישה כירורגית אל היםשרירי calene ו טרפז.
    1. קח את המלקחיים מעוקלים הבוטים, לעצור את ipsilateral כפה מול לאתר כירורגית, ואת קלטת הכף במקום (האיור 1C). השתמש בפלסטר הדבק החזק כדי לוודא כי הכפה מאובטחת למשך ההליך.
  3. לשים על זוג טרי של כפפות מנתחים. השתמש אזמל לעשות חתך אלכסוני, כ 2 ס"מ באורך, בין הכתף לאוזן (הקו האדום באיור 1C).
  4. באמצעות שני מלקחיים laminectomy # 2, אחד בכל יד, למשוך בחזרה את כרית השומן ולהפיץ לגזרים את שרירי הטרפז ואת platysma לחשוף את fascia המכסה את השרירים sternocleidomastoid ו שווה צלעות (איור 1D ו- E).
  5. השתמש שרירים חיוור sternocleidomastoid עצב הסרעפת כציוני דרך לזהות את השרירים שווה צלעות. שים לב עצב הסרעפת מקביל השרירים השווים הצלעות, ואילו sternocleidomastoid טמון inferior. שרירי Scalene יעברו באלכסון מן חוליות הצוואר אל צלעות מתחת לשריר הטרפז. מוביל biopotential יוכנס לתוך השריר Scalene הקדמי, אשר ניתן לזהות את השריר שפועל בצמוד עצב הסרעפת (איור 1F ו- G).
    הערה: זהירות. אזור זה הוא כלי דם מאוד, יש לנקוט זהירות כדי למנוע חיתוך העורק subclavian. למנוע פגיעת מקלעת עצבים ואת זרוע הסרעפת.
  6. לאחר השרירים שווה צלעות ו הטרפז זוהו (איור 1G), לבצע בכיס תת עורית עבור משדר על גב החיה, בין scapulas.
    1. השתמש במספרי הפרדת הרקמות, להכניס את הטיפים הבוטים של המספריים מתחת לעור ולהפיץ אותם עד בכיס הפתיחה כי הוא כ 1.25x הרוחב של המשדר נוצר (1H איור).
      הערה: צריך להיות מוכנס משדר עם התנגדות מינימלית, אבל תוך הנקבet לא צריך להיות כל כך גדול כי המשדר יכול לנוע בכוחות עצמו. אם הכיס הוא קטן מדי, המשדר יכול להתחכך העור, שגורם לגירוי שעשוי להנחות את החיה לגרד את העור ו / או למשוך המוביל החוצה. אם הכיס הוא גדול מדי, seromas יכול להיווצר, או המשדר יכול להעביר למצב שלילי.
  7. סומק עם חם, מלח סטרילית ולהכניס את המשדר עם הצד להחמיא נגד השרירים. מקם את המשדר כך שהוא מונח ישר ואת החוטים להגיח מן הכיס, מקבילות זו לזו ולא (ט 1 איור) המעווה. להתכרבל בכל אורך עודף של תיל תחת התקן ולהניח אותה שטוחה.
  8. הפעל מוביל מהמשדר אל השרירים שווה צלעות ו הטרפז כך ששני סטים של מוביל bipotential לשקר שטוח מקבילות זו לזו.
  9. השתמש מלקחיים laminectomy להפריד את Scalene הקדמי מן השרירים המקיפים ולהכניס מחט 25-מד דרך mus שווה צלעותCLE, בניצב לסיבי השריר.
    1. הכנס אחד עופרת לתוך קצה מחט ולאחר מכן למשוך את המחט של השריר, משאירים מאחוריהם את ההובלה מוכנס לתוך השריר עד כדי בידוד של חוט (איור 1J ו- K). שיא אשר מוביל בצבע מוחדר אשר שריר.
  10. מקום טיפה קטנה של דבק cyanoacrylate אל הקצה החשוף של החוט, קרוב לשריר שבו להוביל מוכנס, ובמהירות להחליק את הכובע להוביל על פני החוט כך ששום חוט חשוף בין הכובע להוביל ואת השריר (איור 2A ו- B).
    הערה: למרות שזה דבר מקובל לאבטח EMG מוביל עם cyanoacrylate 17, 18, שיטה חלופית היא להבטיח את הכובע להוביל במקום על ידי קשירת קשר תפר משי סביבו.
  11. חתוך את דיסטלי החוט העודף על הכובע ולהחיל טיפת דבק cyanoacrylate אל קצה החוט / כובע העופרת. תן דבקזמן לְפַלְמֵר לפני שחרור (איור 2C ו- D).
  12. בצע את השלבים זהים (שלבי 3.10-3.12) להכניס את ההקבלה להוביל קוטביות ההפוכה לראשון באותו השריר, 1 - 2 מ"מ מן ליתרון הראשון.
  13. חזור על שלבים 3.10 - 3.12 להכניס מוביל לתוך בשריר הטרפז, הממוקם רק קדמית שריר שווה צלעות (איור 1 ליטר ו- M).
  14. ודא מוביל החוט שתוקנו במקום וכי יש רפוי בדיוק את הכמות דרושה המוביל עבור החיה לבצע תנועות גוף ללא משייכת המובילה. ודא כי כל אורך עודף של עופרת לא לדחוף כנגד העור, שכן הדבר עלול לגרום גירוי שעשוי להנחות את החיה לגרד או למשוך המוביל החוצה. מיקום מחדש מוביל, במידת הצורך, כדי למנוע כל אי נוחות פוטנציאל.
  15. הוצא בעדינות את הקלטת כדי לחיצה על forelimb. משוך את כרית השומן בחזרה מעל השריר ולהשתמש בו כדי לכסות את המוביל המוכנס. סגירת החתך עם דבק cyanoacrylate ידי מתגרהאת שולי העור בחזרה ביחד כך שקווי החתך למעלה. צביטת חלק שולי העור יחד עם המלקחיים המעוקלים להחיל קו קטן של דבק cyanoacrylate לאורך הקו הזה.
  16. להזריק 0.1 מ"ל של תת-עורית carprofen כדי להקל את הכאב שלאחר הניתוח בעוד החיה עדיין תחת הרדמה.
    הערה: המשך לנהל 0.1 מ"ל של carprofen פעם ביום במשך 1 - 2 ימים שלאחר הניתוח, ולאחר מכן לפי הצורך לאחר מכן.
  17. הסר את החיה מן nosecone ולמקם אותו בכלוב נקי בחממה המחוממת מראש עד שהחיה היא ערה נעה סביב הכלוב בהתנדבות. שמור את החיה בחממה במשך דקות 15 לפחות לאחר מכן, ניטור התנועות והערנות שלה.

4. טיפול לאחר הניתוח

  1. חיות בית בנפרד לאחר הניתוח. לספק ריפוי חיות עם ג'ל דיאטה ובקבוק מים.
  2. נטר את החיה דקות 30 הראשונים שלאחר הניתוח. בדוק על החיה לפחות כל שעה Fאו 5 שעות לאחר הניתוח. בימים הבאים הניתוח, לבדוק לפחות פעמיים ביום.
  3. Watch עבור נמק, דלקת לאורך החתך בתוך חלל הגוף המכיל את השתל (כלומר, חום, נפיחות, אודם), ועל היווצרות seroma.
    הערה: סימנים אלה מתרחשים בתוך השבוע הראשון לאחר ניתוח. חודש אחד של בעלי החיים רפא בריא לאחר הניתוח מוצג באיור 1N. למרות הקלטות EMG יכולות להתבצע מייד לאחר השתלה, החיות מקבלות לפחות אחד בשבוע כדי לרפא לפני הקלטת EMG ו plethysmography, כמו אותות א.ק.ג. יכולים להיות גבוהים מייד לאחר השתלה.

5. אותות Electromyography ו Plethysmography סימולטני רכישה

  1. הפעל את כל הציוד הרכישה, כולל זרימת הטיה.
    הערה: קצב הזרימה עבור עכברים מוגדר בדרך כלל על 1.0 L / min.
  2. כיול חדר plethysmography (ים) באמצעות מד זרימה.
    הערה: לבדוק מדי פעם את plethysmography chambeRS כדי להבטיח כי חותמות אינם סדוקים או שבורים. מעיל חותמות גומי עם חומר סיכה כגון גריז ואקום פעם בשבוע כדי לשמור במצב טוב שלהם.
  3. כיול משדר קלט כפי שצוינו על ידי היצרן.
  4. מניחים את העכבר בתא plethysmography עבור h 1 לפחות להסתגל אותו לפני ההקלטה EMG ו plethysmography. שימוש בתאים מרובים, אפשר להקליט מעכבר אחד בעוד העכבר הבא להתאקלם בתא שני. אין להדליק את המשדר בזמן האיקלום על מנת לחסוך בצריכת החשמל של הסוללה (איור 1o).
  5. לפני ההקלטה (אך לאחר כיול), להדליק את המשדר על ידי הצבת מגנט חזק בתוך 1 ב של החיה המושתלת; אור אדום על החלק הקדמי של המקלט יציין כאשר המשדר פועל.
  6. בגין רכישה באמצעות התפריט הנפתח שכותרתו "רכישה" ולבחור "התחל רכישה." למרות משך ההקלטה רשאילהשתנות לפי ניסוי, plethysmography טיפוס הקלטת EMG נמשך 1 - 3 h.
    הערה: יש משדר בקצב דגימה פנימי של 240 הרץ. קצב גבוה יותר של 500 הרץ מוגדר בתוכנה כדי לשרבב בין נקודות ו לספק צורת גל חלקה. המסנן מעביר הנמוך (אשר משמש מסנן אנטי כינוי) ואת מסנן המעביר הגבוה השתל לציין את רוחב פס 1 עד 50-הרץ עבור מכשיר טלמטריה זה. התערבות 60-רץ A / C אינה תורמת רעש עודף אות EMG כי השתלים הם מצברי החיה מגנה את השתל ומובילה מתחומים חשמליים. Plethysmography, EMG, וידאו מסונכרן אוטומטית בזמן אמת באמצעות תוכנת רכישה.
  7. כאשר הרכישה היא סיימה, לכבות את המשדר עם מגנט ולהסיר את החיה מבית הבליעה.
  8. אם מתחיל הקלטה אחרת, לנקות את החדר, להזין את כיולי משדר חדשות מן החיה הבאה, ולהתחיל את ההקלטה השנייה. אם סנפירished עם רכישה ליום, לכבות את המשדר, לנקות את חדר plethysmography, וכבו את כל ציוד הרכישה ואת זרימת ההטיה.

figure-protocol-1
איור 1. השרשה של התקן טלמטריה למדוד EMG שרירי הנשימה. (א) משדרי טלמטריה עם שני זוגות של biopotential מוביל למדוד EMG. הובלות ניתן גזוזות לאורך הרצוי (למטה) או מפותלות ותחבו מתחת המשדר (העליון). (B) משדר מוביל. (ב") הוא מקיים עם בידוד פלסטי גזוז-off כדי לחשוף את החוטים כדי להפוך כובעי עופרת (שיבוץ). (ב "") הוא מקיים עם חוטים נמתחו 4 - 5x האורך המקורי שלהם. הובלות צריכות להיות מטופחות, כך שהם ארוכים 0.5 סנטימטר (לא מוצג). (ג) עכבר מוכן לניתוח, עם האתר כירורגית המגולח ובצורה נכונהבכפו מיקומו. הקו המקווקו האדום מציין את אתר החתך. (ד) שרירים שטחיים הממוקם מתחת כרית שומן fascia, ראה בעקבות החתך הראשוני. T = טרפז. S = sternocleidomastoid. P = platysma. חץ צהוב = עצב הסרעפת. (ה) תרשים Cartoon של השרירים ואת עצבי סרעפת מוצגים (D). מלקחיים יש להשתמש כדי להפיץ לגזרים את שרירי הטרפז ואת platysma להגיע שריר שווה צלעות עמוק, מוצג (F) ו- (ז). (F) ציוני דרך המשמשת לזיהוי המיקום של Scalene ואת הטרפז. תמונה זו מראה את עורק subclavian (חץ לבן), מקלעת עצבים / זרוע הסרעפת (חץ שחור), ואת שריר sternocleidomastoid החיוור (חץ צהוב). (G) קריקטורה המתארת את מיקומו של שהרירים העמוקים (כלומר, שווה צלעות תיכונות, שווה צלעות קדמיות, ואת SCM), עורק subclavian, ואת עצב סרעפת. האחורי Scalene אינו גלוי. אלה ניתן לגשת רק כאשר המשטחיםשרירי אל (ב D ו- E) הפשוקות רחבה. (H) ביצוע כיס עבור משדר באמצעות מספריים-קצה קהה. (אני) הוכנס משדר בכיס תת עורית, עם המוביל המקביל ממוקם מתעורר מן הכיס. (J) החדרת המחט 25-מד לתוך שווה צלעות, בניצב לסיבי השריר, ליצור מנהרה עבור להוביל תיל. (K) שניהם מוביל מוכנס לתוך השריר שווה צלעות. כובעים יצוקים ממוקמים בקצה ומודבק למקומו. (L) החדרת המחט 25-מד אל הטרפז, בניצב לסיבי השריר, ליצור מנהרה עבור להוביל תיל. (ז) כל ארבעה המוביל מוכנס לתוך שרירי טרפז ואת שווה צלעות ו שוכב שטוח לפני סגירת החתך. (N) Fully התאושש העכבר, עם תת-עורית מיקומו משדר על הגב. (O) plethysmography הקלטה במקביל, פעילות EMG שריר,וידאו nd באמצעות תא plethysmography (חץ צהוב), כרית קבלת טלמטריה (חץ אדום), ואת המצלמה (חץ שחור), בהתאמה. זרימת הטיה תכליתית מחוברת לתא plethysmography באמצעות צינור פלסטיק (חץ כחול) כדי לספק חמצן אל העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-protocol-2
איור 2. אבטחת Caps יצוקה עם Cyanoacrylate דבק. (א) החל ירידה קטנה של cyanoacrylate (עיגול סגול) אל החוט החשוף של עופרת אלקטרודה הפרוקסימלי התיל (E) לשריר. (B) במהירות להחליק את הכובע להוביל המוכן (LC) על החוט החשוף מעל דבק cyanoacrylate כך כובע העופרת ממוקמת בסמוך ישירות לשריר. (גחתוך) חלק קטן בקצה הדיסטלי של כובע עופרת חוט כך שאין הנוכחי האלקטרודה חשוף שאינו מבודד עם פלסטיק. (ד) החל טיפה אחת קטנה של דבק cyanoacrylate אל סוף כובע העופרת. הסר את הקצה הדיסטלי הגזוז-off של הכובע להוביל מן החי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

6. ניתוח ARM EMG ו Plethysmography

  1. פתח את תוכנת הניתוח ולסקור את הקובץ של עניין (ללכת "קובץ" ולבחור "קובץ ביקורת פתוח"). סנן את אותות EMG באמצעות מסנן high pass 30-הרץ על ידי לחיצה ימנית על עקבות EMG, בחירה "לנתח תכונות," הדגשה "מתקדם תכונות 1" כרטיסייה, והשינוי לעבור סינון הגבוה כדי 30 הרץ.
    הערה: שלב סינון זה מסיר מידע שאינו להפלות, בתדירות נמוכה.
  2. אתר תחומי פעילות עכבר על ידי בדיקה ויזואלית המבוססת על חוסר התנועה בקובץ וידאו המסונכרן וחוסר שינויים בלחץ גדול, לא סדירים עקב תנועת עקבות plethysmography (תיבה אדומה איור 3A); חוסר פעילות מתרחשת כאשר העכבר הוא ער או ישן אבל עדיין.
  3. זיהוי התקפי EMG באופן עצמאי עבור כל שריר.
    1. לתקן ולשלב את אות EMG מסונן מעל 30 מילישניות (איור 4).
      הערה: מאחר עכברים לנשום בקצב של 3 הרץ, כל נשימה מיוצגת על ידי כ 11 ערכים משולבים.
    2. קבע את המשרעת EMG הבסיס על ידי חישוב ממוצע הערכים המתוקנים משולבים הקשורים אות EMG לתקופה של 3 s כאשר העכבר אינו פעיל ואת עקבות plethysmography מציגה eupnea (נשימה רגילה) (איור 4).
    3. זיהוי "התקפים" של פעילות המוגדרת על ידי לפחות ברציפות 3 ערכים מתוקנים משולבים כי הם לפחות 5עליית 0% מעל אות EMG הבסיס (שנקבע בשלב 6.3.2).
      הערה: שלושה ערכים רצופים לייצג חלון 90-ms, אבל מכמה התקפים יכילו יותר מ 3 ערכים מעל הסף ו יימשכו יותר מ 90 מילישניות.
    4. השתמש עקבות וידאו plethysmography מסונכרנים להוציא התקפים המתרחשות במהלך אנחות (איור 3B); מרחרח (איור 3 ג); או תנועות עכבר רצונית, כגון ראש מפנה או טיפוח.
    5. חזור על שלבים 6.3.1 - 6.3.4 עבור השריר השני.
  4. חשב את תדר התקף לכל שריר. תיעוד) בפעם הזמן והסוף בתחילה כל תקופה פעילה ב) הזמן בכל התקף התרחש באמצעות הקריטריונים הנ"ל. תמצת את הזמן פעיל הכולל. מחלק את המספר הכולל של התקפים ידי דק 'הכולל של זמן פעיל במהלך ההקלטות כדי לחשב את תדירות ההתקף.
  5. קבע אם שינויי האוורור משויכים ההפעלה של m היסטורייתuscles.
    1. בחר את פרמטרי הנשימה להימדד (למשל, זרימת שאיפת שיא, נפח גאות, נפח דק, נשימות לדקה).
      הערה: כל הבחירות האפשריות ניתן למצוא בתפריט הנפתח Setup P3 תחת "פרמטרים נגזרים."
    2. זהה את הנשימות המתרחשות במהלך פעילות התקף EMG ואת הנשימות המתרחשות במהלך פעילות בסיס EMG (איור 4).
    3. צור פלחי מנתח פורשים נשימות plethysmography המשויכים לפעילות התקף EMG וליצור מגזרי מנתח עצמאיים המשויכים פעילות EMG בסיס. הקפד להגדיר את סוג הניתוח "מנתח Seg."
      הערה: בחירה זו נמצאת בתפריט הנפתח Setup P3 תחת "הגדרת הפחתת נתונים."
    4. לסמן את תחילתו של כל פלח מנתח עם אירוע על ידי לחיצה ימנית על עקבות plethysmography. ציין התקף המכיל קטעים מנתחים כמו "אירוע 1" בתפריט ו sp הנפתחecify מגזרי מנתח הבסיס כמו "אירוע 2" כדי להבחין בין שתי המעמדות של מגזרים.
    5. בתפריט "פונקציות", להציל את "סעיף מרקס" ו- "מרקס נגזר נתונים." בתפריט מנתח הנתונים, להציל את "קובץ הסקירה המנותחת" ו "נתונים נגזרים מנותחים."
      הערה: פרמטרי הנשימה שנבחרו עבור כל נשימה בודדת נמצאות גיליון הנתונים נגזר מרקס בכרטיסייה שכותרתו "גזירה".
    6. השוואת הפרמטרים הנשימה עבור נשימות המתרחשות במהלך התקפי ARM (מסומן אירוע 1) לעומת נשימות המתרחשות במהלך פעילות הבסיס (מסומן אירוע 2) כדי לקבוע אם פעילות שרירים קשורה לשינויים אוורור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר שימש להשתיל מכשיר טלמטריה להקליט EMG שווה צלעות ו הטרפז, WBP, ווידאו של עכבר מודל SOD1 (G93A) ALS. תקופות שבהן חיה אינה פעילה (למשל, לא זז) זוהו באמצעות הקלטת וידאו ואושרו על ידי חוסר פעילות הקשורה תנועה עקבות WBP (איור 3A). תקופות פעילות כוללות משך זמן רע"מ או אי-REM, כמו גם בילה זמן ער אבל עדיין (איור 3 א). פעילות EMG במהלך הזמן פעיל זה היה הבקיע כמו התקף כאשר לפחות מתוקן משולב ברצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההליך הפגין כאן מאפשר פולשנית (לאחר השתלה כירורגית ראשונית של המשדר) המדידה של פעילות שריר נשימה ואוורור במשך חודשים רבים באותה החיה. יש טכניקה זו מספר יתרונות על פני שיטות EMG סטנדרטיות בעכברים מורדמים: 1) הניסויים דורשים עכברים פחות ולספק את היכולת להקליט נתונים מאותו האתר ב עכבר אחת על פני שלבי מחלה (במקום להשתמש בעכברים מרובים שלב משלבי מחלה שונה); 2) ניתוח נתונים יכול להתבצע עם מבחנים סטטיסטיים חזקים יותר (כלומר, באמצעות מדידות חוזרות במקום להשוות קבוצות ניסוי נפרדות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לחשוף.

תודות

תמיכה עבור עבודה זו סופקה על ידי פרס נאמן המרכז רפואי בית החולים בסינסינטי ילדים כדי SAC ומענק אימון NIH (T32NS007453) כדי VNJ

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 מעבדת גור/ג'ייג'קסון4435
תא פלתיסמוגרפיהבוקסקו מוצרי נשימה / מדעי הנתונים הבינלאומי601-1425-001
מקלטי טלמטריה (דגם RPC-1)מדעי הנתונים הבינלאומיים272-6001-001
משאבת זרימת הטיה (דגם BFL0500)מדעי הנתונים הבינלאומי601-2201-001
ACQ-7000 USBData Sciences InternationalPNM-P3P-7002XS
Dataquest A.R.T. מטריקסחילופי נתונים מדעי נתונים בינלאומי271-0117-001
חדש Ponemah Analysis SystemData Sciences InternationalPNM-POST-CFG
Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20Data Sciences InternationalPNM-P3P-520
Ponemah חבילת ניתוח פלתיסמוגרפיה של נשימה שלמה בלתי מרוסנת v5.20מדעי נתונים בינלאומייםPNM-URP100W
מוגדרת Ponemah מערכת תוכנהמדעי נתונים בינלאומייםPNM-P3P-CFG
מודול ניתוח (URP)מדעי נתונים בינלאומייםPNM-URP100W
מגבר אוניברסלימדעי נתונים בינלאומיים13-7715-59
לוח סינכרוןמדעי נתונים בינלאומי271-0401-001
סינכרוןכבלים מדעי נתונים בינלאומיים274-0030-001
מתמר-לחץ BuxcoData Sciences International600-1114-001
מד זרימהמדעי נתונים בינלאומיים600-1260-001
מגנט ורדיו כלולים בערכתההתחלה F20-EETמדעי הנתונים הבינלאומיים276-0400-001
ציר P1363 מצלמת וידאו   Data Sciences International275-0201-001
Terg-A-ZymeFisher Scientific50-821-785חומר ניקוי אנזימי
ActrilMinntech Corporation78337-000
מיקרוסקופ ניתוח סטריאו סטרילנטי כימי (דגם MEB126)Leica10-450-508
מכשיר אדים/אינקובטור לתינוקות מבוקר סרווOHMEDA Ohio Care Plus6600-0506-803
TL11M2-F20-EET משדריםמדעי נתונים בינלאומיים270-0124-001
Dumont #2 מלקחיים למינקטומיה - טיפים סטנדרטיים/ישר/12 ס"מ (x2) מכשירים מדעיים משובחים11223-20לטיפול בחוטים
Dumont #2 מלקחיים למינקטומיה - טיפים סטנדרטיים/ישר/12 ס"מ (x2)מכשירים מדעיים משובחים11223-20לניתוח
מלקחיים בתבנית צרה- משוננים/מעוקלים/12 ס"ממכשירים מדעיים משובחים17003-12
מספריים קפיצים - חיתוך קשיח/ישר/חד/12.5 ס"מ/6 מ"מ חיתוךמכשירים מדעיים משובחים15124-12
מספריים להפרדת רקמות - ישר / קהה-קהה / 11.5 ס"מFine Scientific Instruments14072-10
מספריים עדינים - חיתוך קשיח / מעוקל / חד-חד / 9 ס"מ מכשירים מדעיים משובחים14058-11לחיתוך חוטים וגזירת ציפורניים
ידית אזמל #3מכשירי דיוק עולמיים500236
להב אזמלמכשירים מדעיים עדינים10010-00להכנת כובעי עופרת
פוליסורב קלוע תפר נספגCovidenD4G1532Xלפיתול משדר
מוביל Gluture זוטיס בע"מ6606-65-1דבק ציאנואקרילט
3 מ"ל קצה החלקה מזרק -חיוניות רפואיתרכה 118030055
מחט 25 גרם (x2)Becton Dickinson and Co.305-145
אפליקטורים עם קצה כותנההנרי שיין בריאות בעלי חיים100-9175
סט קוצץ שיער Andis Easy CutAndis049-06-0271סכין גילוח חשמלי נמכר ב- Target
IsofluraneHenry Schein בריאות בעלי חיים29404הרדמה 
איזופרופיל אלכוהול 70%Priority Care 1MS070PC
Dermachlor 2% פילינג רפואי (כלורוהקסדין 2%)Butler Schein55482
דמעות מלאכותיותHenry Schein Animal Health48272חומר סיכה משחה אופטלמית
גריז ואקוםDow Corning Corporation1597418
שמיכת מיםJorVetJOR784BN

מקורות

  1. Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Common mechanisms of compensatory respiratory plasticity in spinal neurological disorders. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 419-428 (2013).
  2. Sieck, G. C., Gransee, H. M. Respiratory Muscles: Structure, Function & Regulation. , Morgan & Claypool Life Sciences. Lecture #34 (2012).
  3. Rizzuto, E., Pisu, S., Musaro, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1(G93A) Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng. 43 (9), 2196-2206 (2015).
  4. Kennel, P. F., Finiels, F., Revah, F., Mallet, J. Neuromuscular function impairment is not caused by motor neurone loss in FALS mice: an electromyographic study. Neuroreport. 7 (8), 1427-1431 (1996).
  5. Pinto, S., Alves, P., Pimentel, B., Swash, M., de Carvalho, M. Ultrasound for assessment of diaphragm in ALS. Clin Neurophysiol. 127 (1), 892-897 (2016).
  6. Stewart, H., Eisen, A., Road, J., Mezei, M., Weber, M. Electromyography of respiratory muscles in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci. 191 (1-2), 67-73 (2001).
  7. Arnulf, I., et al. Sleep disorders and diaphragmatic function in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Am J Respir Crit Care Med. 161, 849-856 (2000).
  8. Bennett, J. R., et al. Respiratory muscle activity during REM sleep in patients with diaphragm paralysis. Neurology. 62 (1), 134-137 (2004).
  9. Pinto, S., de Carvalho, M. Motor responses of the sternocleidomastoid muscle in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 38 (4), 1312-1317 (2008).
  10. Romer, S. H., et al. Accessory respiratory muscles enhance ventilation in ALS model mice and are activated by excitatory V2a neurons. Exp Neurol. 287 (Pt. 2, 192-204 (2017).
  11. Moldovan, M., et al. Nerve excitability changes related to axonal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis: Insights from the transgenic SOD1(G127X) mouse model. Exp Neurol. 233 (1), 408-420 (2012).
  12. Pagliardini, S., Gosgnach, S., Dickson, C. T. Spontaneous sleep-like brain state alternations and breathing characteristics in urethane anesthetized mice. PLoS One. 8 (7), 70411(2013).
  13. Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
  14. Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
  15. Tysseling, V. M., et al. Design and evaluation of a chronic EMG multichannel detection system for long-term recordings of hindlimb muscles in behaving mice. J Electromyogr Kinesiol. 23 (3), 531-539 (2013).
  16. Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Res Brain Res Protoc. 14 (3), 154-164 (2005).
  17. Pilla, R., Landon, C. S., Dean, J. B. A potential early physiological marker for CNS oxygen toxicity: hyperoxic hyperpnea precedes seizure in unanesthetized rats breathing hyperbaric oxygen. J Appl Physiol. 114 (1985), 1009-1020 (1985).
  18. Morrison, J. L., et al. Role of inhibitory amino acids in control of hypoglossal motor outflow to genioglossus muscle in naturally sleeping rats. J Physiol. 552 (Pt. 3, 975-991 (2003).
  19. Tscharner, V., Eskofier, B., Federolf, P. Removal of the electrocardiogram signal from surface EMG recordings using non-linearly scaled wavelets). J Electromyogr Kinesiol. 21 (4), 683-688 (2011).
  20. Hof, A. L. A simple method to remove ECG artifacts from trunk muscle EMG signals. J Electromyogr Kinesiol. 19 (6), e554-e555 (2009).
  21. Lu, G., et al. Removing ECG noise from surface EMG signals using adaptive filtering. Neurosci Lett. 462 (1), 14-19 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ALS
מדידה חוזרת של פעילות שרירי הנשימה ואת אוורור בעכברי מודל של המחלה שרירית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.