אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

Summary

כתב היד הזה מפרט את ייצור של רקמות מיקרו- רקמות מהונדסות ברשתות עצביות: מבנים תלת-מימדיים בגודל מיקרון המורכבים משטחים אקסונליים ארוכי טווח המקיפים אוכלוסייה נוירונית מצטברת (s), המצופים בהידרוגול צינורי. אלה הפיגומים החיים יכולים לשמש ממסרים תפקודית לשחזר או לווסת מעגלים עצביים או כמו מיטות בדיקה ביופידלית מחקה נוירונטומי חומר אפור לבן.

Abstract

התאוששות פונקציונלית לעיתים רחוקות מתרחשת בעקבות פציעה או ניוון מחלה המושרה בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) בשל הסביבה מעכב ואת יכולת מוגבלת neurogenesis. אנו מפתחים אסטרטגיה בו זמנית כתובת נוירונים ואת הנתיב המסלול axonal בתוך CNS פגום. כתב יד זה מציג את פרוטוקול ייצור עבור מיקרו-רקמות מהונדסים רשתות עצביות (מיקרו- TENNs), בונה מושתל המורכב נוירונים ומסומנים axonal שטחים פורש לומן תאיים (ECM) לומן של צילינדרים הידרוג'ל preformed מאות מיקרון בקוטר שיכולים להרחיב סנטימטרים באורך. עצבים נוירונים הם תחומים לקיצוניות של תלת מימדי encasement ו הם מורחבת על ידי תחזיות axonal. Micro-TENNs מותאמים באופן ייחודי כאסטרטגיה לשיקום CNS, המדמה היבטים של cytoarchitecture במוח connectome ואפשרות לספק אמצעי להחלפת הרשת. הניאואגרגטים רונאליים עשויים סינפסה עם רקמות המארח ליצור ממסרים פונקציונליים חדשים כדי לשחזר ו / או לשנות את המעגל חסר או פגום. מבנים אלה עשויים לשמש גם "פרוגומים חיים" פרו - רגנרטיבית, המסוגלים לנצל מנגנוני התפתחות של נדידת תאים ומסלול דרכי אקונלי, המספקים רמזים מבניים ומסיסים סינרגיסטיים על בסיס מצב התחדשות. Micro-TENNs הם מפוברק על ידי שפוך נוזל הידרוג לתוך עובש גלילי המכיל מחט ממוקד longitudinally. לאחר הידרוג יש gelled, מחט מוסר, משאיר חלול מיקרו העמודה. פתרון ECM מתווסף לומן כדי לספק סביבה מתאימה להדבקה העצבית ואת תוצר axonal. נוירונים מנותקים הם מצטברים מכנית עבור זריעה מדויקת בתוך אחד או בשני הקצוות של המיקרו טור. מתודולוגיה זו מייצרת באופן אמין בונה מיניאטורי עצמאי עם ארוך הקרנת חלקים axonal שיכולים לשחזר תכונות של המוח neuroanatomy. סינפטיתUnlabeling ו מסומנת גנטית סידן מחוונים מצביעים על כך מיקרו- TENNs יש הפצה סינפטי נרחב ופעילות חשמל מהותי. כתוצאה מכך, Micro-TENNs מייצגים אסטרטגיה מבטיחה לשיקום נוירו-ניתוחי ממוקד של מסלולי מוח, ויכולים לשמש גם כמודלים ביופידליים כדי לחקור תופעות נוירוביולוגיות במבחנה .

Introduction

המאפיין השכיח של הפרעות ומחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), כגון פגיעה מוחית טראומטית (TBI), פגיעה בחוט השדרה (SCI), שבץ, מחלת האלצהיימר ומחלת פרקינסון, הוא ניתוק מסלולי האקסון ותאי העצב הפסד ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . לדוגמה, כאשר שבץ איסכמי הולך untreated, ההערכה היא כי האקסונים הם איבדו בקצב של 7 קילומטרים של אקסונים לדקה ⁵ . במקרה של TBI, אשר כ -1.7 מיליון אנשים חווים מדי שנה בארצות הברית לבדה, ניוון axona....

Protocol

כל ההליכים הקשורים לבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדות באוניברסיטת פנסילבניה ואת מייקל ג 'יי Crescenz ווטרנים לענייני המרכז הרפואי דבק הקווים המנחים שנקבעו במדיניות הבריאות הציבורית NIH מדיניות על טיפול הומאני ושימוש במעבדה בעלי חיים (2015).

1. פיתוח של הידרוגל Agarose (רכיב Acellular של מיקרו- TENNs)

1. הכנת פתרון Agarose
   1. בתוך ארון biosafe....

Results

Micro-TENNs היו במעקב באמצעות מיקרוסקופ שלב לעומת זאת להעריך cytoarchitecture שלהם תוצר axonal ( איור 4 ). בתוך חד-כיווני, מיקרו-טון של 2 מ"מ, צבירים נוירונים הוגבלו לקצה אחד של העמוד הקטן והציגו צרור של אקסונים דרך הליבה הפנימית. אקסונים משתרע על פני כל עמודה של 5 ימים במבחנה (DIV) ( איור 4 א ). היה גידול גדול יותר בשלב הראשוני של אקסונאל דו-כיווני בגודל 2 מ"מ - מיקרו-TENNs, כאשר האקסונים נמתחו על כל העמו.......

Discussion

פציעה ומחלה של מערכת העצבים המרכזית בדרך כלל גורמות לאובדן או לתפקוד לקוי של המסלולים האקסונליים למרחקים ארוכים שמרכיבים את המוח, עם או בלי התנוונות העצבית. זה מורכב על ידי יכולת מוגבלת של CNS לקדם neurogenesis והתחדשות. למרות המרדף אחר אסטרטגיות תיקון כגון גורם הגדילה, התא, ואת אספקת ביולוגי כמו גישות בודדות או קומבינטורית, טכניקות אלה נכשלים בו זמנית חשבון הן התנוונות של תאים עצביים ואובדן חיבורים axonal ^{14 , 22} . פערים .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
חותך לייזר	מערכות לייזר אוניברסליות	PLS4.75	משמש לייצור תבנית המיקרו-ערוצים החתוכה בלייזר.
מכשיר לייצור מיקרו-עמודים בחיתוך לייזר	בהתאמה אישית	--------------	צור קשר עם קבוצת המחקר שלנו אם אתה מעוניין. מידות ושרטוטים מסופקים בכתב היד.
ברגים	--------------	--------------	#4-40 בקוטר הברגה של 3.05 מ"מ
אגוזים	--------------	--------------	#4-40 בקוטר הברגה של 3.05 מ"מ
מחט דיקור סיני (180 ומיקרו; קוטר m)	Lhasa Medical	sj.16X40	הקוטר עשוי להשתנות בהתאם לגודל הרצוי עבור לומן המיקרו-עמודה.
צלחת פטרי	פישר	08772B
תמיסת מלח פוספט חוצץ פוספט (DPBS)	Invitrogen	14200075
פוליסטירן פיפלט סרולוגי חד פעמי	פישר	13-678-11D
אגרוז	סיגמא	A9539-50G
צינור נימי (398 ומיקרו; קוטר מ')	פישר	21170D	הקוטר עשוי להשתנות בהתאם לגודל הרצוי למעטפת המיקרו-עמודה.
פלטה חמה	פישר	SP88857200
בר מגנטי	פישר	1451352
מיקרופיפטה	סיגמא	Z683884-1EA
25 מ"מ מחט מד	פישר	14-826-49
מיקרואזמל	Roboz כירורגי	RS-6270
מספריים	כלי מדע עדינים	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
מעקר חרוזים חם	Sigma	Z378550-1EA
סטריאוסקופ	Nikon	SMZ800N	משמש לכל שלבי הדיסקציה ולייצור מיקרו-TNN.
קולגן קורנינג מסוג I זנב חולדה		354236	לשמור על 4 ומעלה; C ולהסיר רק בעת הצורך.  השתמש בקרח כדי לשמור על הטמפרטורה שלו בעת השימוש.
צינור מיקרוצנטריפוגה	פישר	02-681-256
עכבר למינין	קורנינג	354232	תחזוקה ב 4 & ordm; C ולהסיר רק בעת הצורך.  השתמש בקרח כדי לשמור על הטמפרטורה שלו בעת השימוש.
מדיום נוירו-בסיסי	Invitrogen	21103049	מדיום בסיסי לתרבית של תאים עצביים טרום לידתיים ועובריים. אחסן ב-4º C וחם ב 37 º C לפני השימוש.
נתרן הידרוקסיד (NaOH)	פישר	SS2661
חומצה הידרוכלורית (HCl)	פישר	SA48-1
נייר לקמוס	פישר	09-876-18
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)	חנות 14170112 Invitrogen		ב-4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	חנות 25200056	ב-20 & C וחם ב 37 º C לפני השימוש.
דאוקסיריבונוקלאז לבלב בקר (DNase) I	Sigma	10104159001	Store ב -20 º C וחם ב 37 º C לפני השימוש.
תוסף B-27	Invitrogen	12587010	נוסף למדיום הנוירו-בזאלי לתרבית נוירונים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח. אחסן ב -20 º C וחם ב 37 º C לפני השימוש.
ל-גלוטמין	Invitrogen	35050061	בכתובת -20 º C וחם ב 37 º C לפני השימוש.
ספראג דולי יום עוברי 18 חולדות	צ'ארלס ריבר	זן 001
פסטר	פיפטה פישר	22-042816
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל	EMESCO	1194-352099
וורטקס	פישר	02-215-414
צנטריפוגה	פישר	05-413-115
המוציטומטר	פישר	02-671-6
מדפסת תלת מימד Objet30	Stratasys	--------------	משמש לייצור תבניות המיקרו-באר הפירמידליות.
עובש באר פירמידלי מודפס בתלת מימד	בהתאמה אישית	--------------	צור קשר עם קבוצת המחקר שלנו אם אתה מעוניין. מידות ושרטוטים מסופקים בכתב היד.
פולידימתילסילוקסן (PDMS) וחומר ריפוי	פישר	NC9285739	מגיע כערכה עם אלסטומר וחומר ריפוי. השתמש בתוך מכסה אדים כימי.
משפך	פישר	10-348C
1 מ"ל נורת פיפטה	סיגמא	Z509035
מיקרו-מרית	פישר	S50821
צלחת תרבית 12 בארות	EMESCO	1194-353043
תנור	פישר	11-475-154
חממה	פישר	13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	חנות ב-80ºC. וירוס הקשור לאדנו (AAV) זמין מסחרית עם מחוון הסידן GCaMP6f.
פורמלדהיד 40%	פישר	F77P-4	פורמלדהיד הוא תרכובת רעילה הידועה כמסרטנת, ויש להשליך אותה למיכל נפרד.
Triton X-100	Sigma	T8787	חומר פעילי שטח לא יוני המשמש לחדירה של קרומי התאים.
סרום סוסים	Gibco	16050-122
עכבר נגד Tuj-1/beta-III טובולין נוגדן ראשוני	Sigma	T8578-200UL	חנות ב -20ºC.
ארנב אנטי-סינפסין 1 נוגדן ראשוני	מערכות סינפטיות	106-001	חנות ב -20ºC.
חמור נגד עכבר 568 נוגדן משני	Invitrogen	A10037	חנות ב 4ºC.
חמור נגד ארנב 488 נוגדן משני	Invitrogen	A21206	חנות ב 4ºC.
Hoechst 33342, חנות Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	בכתובת 4ºC.  הוכסט הוא מוטגן ידוע שיש להתייחס אליו כאל מסרטן. לכן, יש להשליך אותו למיכל נפרד.
A1RSI סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי	ניקון	--------------	משמש ללקיחת שחזורים קונפוקליים של מבנים בעלי תווית חיסונית.
מיקרוסקופ Eclipse Ti-S	Nikon	--------------	משמש לצילום תמונות ניגודיות פאזה.  עם רכישת תמונה דיגיטלית באמצעות מצלמת QiClick המתממשקת לתוכנת Nikon Elements Basic Research (4.10.01).
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מהיר מיקרוסקופ	ניקון	--------------	ניקון Eclipse Ti בשילוב עם מצלמת ANDOR Neo/Zyla להדמיית סידן.
NIS Elements AR 4.50.00 תוכנה	Nikon Instruments	--------------	משמש לזיהוי מעברי סידן מההקלטות שצולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי במהירות גבוהה.