טכניקה לפרוסקופית עבור אוסף סידורי של צומת כבדים Mesenteric הלימפה קופי מקוק

סיכום

כאן, אנו מתארים טכניקה לפרוסקופית זעיר-פולשנית, דגימה סדרתי של הכבד וקשרי הלימפה mesenteric (MLN) ב קופי המאפשר תדר הדגימה גדל, ומפחית פוטנציאל לסיבוכים כירורגיים בהשוואה ביצוע פיום.

תקציר

בלוטות הלימפה mesenteric (MLN) ואת הכבד חשופים לחיידקים ומוצרים חיידקים ממערכת העיכול (GI), מה שהופך אותם ייחודית אימונולוגית. מערכת העיכול ואת MLN הקשורים הן באתרי התרבות הנגיף בשלב מוקדם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) זיהום ואת MLN אתרים המאגר חשוב להניח כי הנמל תאים נגועים רדום גם לאחר טיפול תרופתי ממושך (ART). הכבד הוכח לשחק תפקיד משמעותי תגובה חיסונית lentiviruses ומופיע לשחק תפקיד משמעותי אישור של וירוס ממחזור. הפרימאטים הלא-אנושיים (NHP) מודלים ל- HIV תסמונת הכשל החיסוני הנרכש (איידס) מחקה היבטים אלה של הידבקות ב- HIV ודגימה האורך סדרתי של האתרים העיקריים של שכפול נגיפי ואת התגובה החיסונית קשורה במודל זה יעזור להבהיר אירועים קריטיים זיהום, בפתוגנזה , ואת ההשפעה של אסטרטגיות התערבות שונות על אירועים אלה. currאף אוזן גרון שפורסם טכניקות לדגום בכבד MLN יחד לערב ניתוח גדול ו / או necropsy, אשר מגביל את היכולת לחקור אתרים חשובים אלה באופן סדרתי באותה חיה. תיארנו בעבר בטכניקה לפרוסקופית לאיסוף mln. כאן, אנו מתארים טכניקה לפרוסקופית זעירה-פולשנית, דגימה אורכת סדרה של כבד MLN דרך אותו בשני מיקומי יציאת נדרש לאיסוף mln. השימוש באותו שתי יציאות ממזער את ההשפעה על החיות כמו שום חתכים נוספים נדרשים. טכניקה זו יכולה לשמש עם תדר דגימה גדל לעומת ניתוח בטן גדול ומפחיתה הפוטנציאל לסיבוכים כירורגיים הקשורים לתגובות דלקתיות מקומיות מערכתיות שעלולות לסבך פרשנות של תוצאות. יש הליך זה פוטנציאל להקל מחקרים שכללו דגמים NHP תוך שיפור רווחת בעלי החיים.

מבוא

העיכול (GI) בדרך היא המשטח הרירי הגדול ביותר בגוף, והוא חשוף מספר עצום של אנטיגנים שמקורם במזון, פתוגנים, וקהילות חיידקים endosymbiotic המכונה כמו Microbiome ^{1, 2.} בלוטות לימפה Mesenteric (MLN) קו העיכול והם אתר המנהלת של תפקוד מערכת החיסון לקידום תגובות דלקתיות או tolerogenic כלפי אנטיגנים מגוונים אלה. הארגון הפיזי של MLN יוצר מערכת ממודרת שיכול לתת מענה אנטיגנים מקומי בלי לעורר ³ תגובות מערכתיות. באופן דומה, הדם מתנקז העיכול אל הכבד דרך וריד השער לפני החזרה במחזור, ובכך נחשף חיידקים ומוצרי חיידקים אשר translocated מן העיכול לתוך שכבת הרירית המיוחדת ונכנס הדם ^4. הכבד מתפקד גם בתור איבר משני הלימפהיש nd מספר רב של תאי מערכת החיסון, כולל מקרופאגים מיוחדים, כדי להסיר חיידקים translocated ^{5, 6.} לפיכך, MLN ואת הכבד הם האיברים החיסון הראשוני חשוף commensal וחיידקים פתוגניים מ העיכול, כמו גם את המילייה של אנטיגנים ממקורות אחרים, מה שהופך אותם ייחודית וחשובה מבחינה אימונולוגית.

MLN אתרים קריטי להערכה של השפעות וירולוגית ו אימונולוגית של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) או וירוס הכשל החיסוני הקופי פתוגניים (SIV) זיהום, והם קרוב לוודאי מעורבים הפצת מוקדם של SIV בעקבות האתגר intrarectal. גוט-מזוהה רקמת הלימפה ידוע להיות אתר מרכזי של שכפול HIV מתמיד, למרות שליטה אפקטיבית של viremia ידי טיפולים אנטירטרוויראלי המודרני (ART) ^7. במודלי זיהום SIV, MLN הוכח להיות מאגרים חשובים של נגיף רדום והוא רשאילהיות המאגר ^{8 העיקרי, 9.} הכבד הוא גם חשוב זיהום lentiviral כפי שמעיד ההצטברות של תאים ספציפיים SIV CD8 ⁺ T ב הכבד של קופי במהלך הזיהום חריף SIV ^10. יתר על כן, זה הוא האיבר העיקרי אחראי ניקוי הווירוס ממחזור ^11.

HIV וזיהומים SIV המשויכים החיידקים במערכת העיכול שינו, שיבשו שלמות האפיתל GI, והגדילה טרנסלוקציה של חיידקים ומוצרי חיידקים מהמעי אל הפריפריה במחזור ^{12, 13.} תהליכים אלה הקשורים הפעלה חיסונית מקומית מערכתית, וגדילה לתחלואה ולתמותה ואנשים נגועים באיידס ^14. בשנת זיהום SIV, חיידקים translocated נצפו ב MLN ^15, ואילו הצטברות של מיקרופוןמוצרי robial בכבד הוכח לגרום לדלקת פגיעה באיבר ^16. לפיכך, בהקשר של HIV ודלקות SIV, את MLN והכבד יכול להיות אינפורמטיבי מאוד להבנת תהליכים דלקתיים מונע על ידי חיידקים במערכת העיכול-תושב.

כאן, אנו מציגים טכניקה לפרוסקופית זעיר-פולשנית, דגימה סדרתי של MLN והכבד אצל פרימטים לא אנושיים (NHPs). אנו להפגין ביצועים מוצלחים של טכניקה זו על שני קופי רזוס נקבה בריא (RMS), דגימת כל חיה פעמים, עם 160 ימים בין כל ניתוח. אנחנו הולכים על מנת להשתמש בדגימות הללו כדי להעריך ולהשוות אוכלוסיות לויקוציטים ו הלימפוציטים מפתח בתוך כל איבר באמצעות cytometry זרימה, ולהפגין נתונים עקביים ומתמשך בין שתי נקודות הזמן.

פרוטוקול

בעלי החיים שוכנו וטפלו ב אגודת הערכה וההסמכה של טיפול בבעלי חי מעבדה הבינלאומי (AAALACi) במתקנים מוכרים, וכל ההליכים החיים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש (IACUC) של אונ' וושינגטון מרכז המחקר הלאומי של וושינגטון הפרימאטים.

1. הכנת כירורגים, הרדמה, לבין משככי כאבים

1. סדציה ו אינדוקציה
   1. מקוק שלווים עם זריקה תוך שרירית של 10 מ"ג / ק"ג קטמין dexmedetomidine 0.015 מ"ג / ק"ג (משולבים מזרק אחד). ודא בהעדר רפלקסים נסיגה לפני הסרת מהכלוב.
   2. לצנרר החיה, ולתחזק את החיה במטוס של הרדמה כללית באמצעות isoflurane (1.0 - 2.5%) ו- 100 חמצן%. ראה סימוכין למידע נוסף בנושא אינטובציה הרדמה כללית קופי ^17,נ"צ "> ^{18, 19.}
2. תמיכת הרדמה וניטור
   1. הכנס קטטר היקפי ורידי ולספק נוזלים איזוטוניים תוך ורידי (כגון פתרון Lactated אצבעות) בשיעור של 5 מ"ל / ק"ג / שעה ברחבי הרדמה וכירורגיה. החל סיכת עין סטרילי כדי למנוע יובש קרני.
   2. לספק שיכוך כאבים, כגון ניסוח לשחרור מושהה של עצירות (0.2 מ"ג / ק"ג, תת עורי).
      הערה: כרטיס NSAID (כגון meloxicam או ketoprofen) עשוי להינתן במהלך התאוששות הרדמה, ובלבד פרוטוקול הניסוי מאפשר ממשל NSAID ובעלי החיים כי הוא normotensive היטב התייבשות במהלך הרדמה.
   3. נטור עומק הרדמה (טון לסת למשל), קצב לב, קצב נשימה, א.ק.ג, לחץ דם, דופק חמצון, CO הגאה סוף _2, ואת טמפרטורת גוף לאורך הרדמת וכירורגיה.
      הערה: כאשר הבטן insufflated, החיה עלולה hypoventilate.לספק אוורור מכני אם קצב הנשימה פוחתת, או הוא ₂ רמות CO גאות סוף מעל 45 מ"מ כספית.
   4. בעקבות הניתוח, לנהל atipamezole (0.15 מ"ג / ק"ג, בהזרקה לשריר) עבור היפוך dexmedetomidine.
3. הכנה כירורגים
   1. בצעו חוקן מים חמים מרובים כדי להקטין את נפח הצואה במעי הגס כדי לסייע להדמיה ומניפולציה מעיים במהלך הליך ^20.
   2. השתמש קוצץ עם להב מספר 40 כדי להסיר שיער מהשטח כירורגית. לגלח מרכס costal אל החיק ו מהשמאל כדי אגף ימני.
   3. בסביבה נקייה מחיידקים להכין את שדה הניתוח באמצעות חיטוי מתאים, כגון לסירוגין כלורהקסידין-אלכוהול או עלובי-povidone יוד-אלכוהול.
   4. מקם את חיה על שולחן הניתוחים על dorsum שלה, תמורת חצי הזווית בין הגב ועל שכיבה לרוחב תקין. לקשור את הידיים והרגליים עם חבל בעמדה המורחבת. ספק chlorhexi סופילסעוד הכנת אלכוהול פעם החיה עוברת לחדר הניתוח והיא ממוקמת לניתוח.

2. כירורגיה

הערה: לקבלת מידע נוסף לפרוסקופיה בחיות קטנות, ראה חומר עזר ^21.

1. לפרוסקופית Instrument כן
   1. לעטוף את החיה עם וילון fenestrated סטרילי.
   2. בעזרתו של עוזר הלא סטרילית, לעטוף את המצלמה הדיגיטלית עם וילון המצלמה סטרילי ולצרף את הכבל למגדל. צרף את ההיקף הנוקשה לראש המצלמה.
   3. צרף את כבל האור סטרילי להיקף הנוקשה ולחבר את הכבל אל מקור האור. לבן לאזן את המצלמה על פי הוראות היצרן.
   4. צרף את צינורות insufflator סטרילי אל insufflator.
2. לפרוסקופית Entry
   1. באמצעות אזמל 15 #, לעשות חתך דקירה ~ 5 מ"מ דרך העור אל העומק של שרירים, אפליקצית הבטןroximately 1 - 2 ס"מ בצד שמאל של הטבור.
   2. באמצעות היד הלא דומיננטית, להרים את גולגולתי דופן הבטן אל האתר של חתך הדקירה. עם היד הדומיננטית, למקם את קצה המחט Veress דרך החתך ואת זווית קצה cranially.
      הערה: זווית החדירה של המחט Veress תשתנה בהתאם על מצב הגוף של החיה. לדוגמא, בשנת חית שומן, מחט Veress תצטרך להיות מוכנסת כמעט בניצב לקיר הבטן. בשנת חיה רזה, מחט Veress צריך להיות בזווית cranially כדי להפחית את הסיכון של פנייה אל הקרביים.
      1. אחוז במוט (לא הרכזת) של מחט Veress, בתקיפות לדחוף את המחט לחדור את דופן הבטן לתוך חלל הבטן. מובחן "לחץ" וירידה בהתנגדות תורגש כמו הקצה חד חודר הצפק ואת הקצה הקהה של מעיינות מחט Veress קדימה לתוך חלל הבטן.
         הערה: אם המחט עוברת כראוי לתוך הדואר חלל הבטן, תהיה התנגדות קטנה כאשר הוא מתקדם ומסוגר 1 - 2 ס"מ.
   3. חבר את צינורות insufflator ₂ CO אל המחט ולפתוח את הברז. לחצים על הבטן כדי לא יותר מ 10-12 מ"מ כספי ליצור pneumoperitoneum.
      הערה: הבטן השיגה הֲפָחָה אידיאלי כאשר היא הרחיבה באופן סימטרי ויש פסד של קונטור חדה הרגילה של שולי costal. הלחץ אמור לספק מרחב מספיק עבור החדרת הצינורית / הנקז בלי סיכון של פנייה אל הקרביים.
3. מיקום קנייה
   1. ברגע הבטן insufflated במלואה, לעשות ~ 5 - 7 חתך מ"מ עם להב # 15 אזמל דרך העור של הבטן גולגולתי שמאל כדי שרירי הבטן ~ 2 - 4 ס"מ הזנב הצלע האחרונה.
   2. מניח הרכבת 5 מ"מ נקז-צינורית דרך החתך בעור והזווית אותו ~ 45 - 60 מעלות caudomedially. לחדור את חלל הבטן עד לעומק של 1-2 ס"מ. screw צינורית מושחל לתוך הבטן על ידי החלפה של צינורית (~ 0.5 - עוד 1 ס"מ) עד לעומק של 1.5 - 3 ס"מ, ולהסיר את נקז.
   3. הסר את צינורות insufflator ממחט Veress, לכבות את השסתום, ולהסיר את המחט. חבר את צינורות insufflator צינורית ופתח את הברז כדי לשמור על pneumoperitoneum על לא יותר מ 10 - 12 מ"מ כספית.
   4. הכנס את ההיקף הנוקשה דרך הצינורית לתוך חלל הבטן.
   5. תחת ויזואליזציה מצלמה, ממשיך לעשות חתך קטן עם להב אזמל # 15 דרך השרירים הצפק בטן בבית החתך בעור הקודם משמש החדרת מחט Veress. המצלמה משמשת כדי לחזות את צד הבטן של החתך כדי למנוע כלי ולמזער דימום.
      הערה: ודא חתך דרך השריר הצפק הוא גדול מספיק כדי לאפשר כניסה של החללית ו החצנה של לפדר (~ 0.5 ס"מ). חתך גדול יותר עשוי להידרש exteriorize mesentery בחיות עם שומן mesenteric מוגזם.
   6. מניח את החיה במצב Trendelenburg ²¹ עם הרגליים גבוהות בכ -15 - 30 מעלות מעל הראש. זה הוא אופציונאלי, אך עשוי לאפשר גישה קלה יותר בלוטות לימפה mesenteric של המעי הגס, כמו המעי הקטן יעבור למיקום גולגולתי יותר.
4. ביופסיה של בלוטת Mesenteric
   1. תחת ויזואליזציה מצלמה, להכניס חללית מוצקה דרך החתך בבטן עשה צעד 2.3.5.
   2. מניחים את החללית בין omentum ואת המעי ולהשתמש בתנועה סיבובית כדי לטאטא את omentum בעדינות את המעי כדי לאפשר ויזואליזציה של לפדר הבסיסית. המשך השימוש בתנועה הסיבובית מן זנב הבטן גולגולתי. Omentum ניתן להציב בחלל הבטן גולגולתי התקינה ולכן הוא מחוץ לתחום האופרטיבי.
   3. השתמש בדיקה כדי להזיז את המעי הגס היורד לכיוון דופן הבטן שמאלה או ימינה. זה יאפשר להדמיה טובה יותר של tהוא לפדר כדי לסייע בחיפוש אחר בלוטות לימפה mesenteric.
   4. השתמש בדיקה לנשוב לפדר על מנת לאתר את בלוטות לימפה mesenteric לאורך כלי נקודתיים mesenteric.
      הערה: בלוטות גסות לרוץ לאורך גבול mesenteric של המעי הגס, בלוטות כאבי בטן שמאל ניתן למצוא ליד נקודות הסניף של הכלי, ואת בלוטות mesenteric הנחות ניתן למצוא לאורך כלי mesenteric נח. בלוטות לימפה Mesenteric גלויות בקלות בחיות רזה. כאשר קבור שומן mesenteric הוא לעתים קרובות יהיה להושיט מוגבה מעט, מראה נוצץ לפדר שמעליה ועלול להיות יותר צבע שחום אפרפר יותר אז שמסביב שומן mesenteric. בנוסף, בלוטות לימפה mesenteric נוטים לשקר לאורך lymphatics ואת כלי הדם mesenteric.
   5. לאחר לימפה מזוהית, להסיר את החללית וכנס המלקחיים הגבירו מרילנד לתוך חלל הבטן. השתמש במלקחיים כדי לתפוס לפדר סמוך לצומת היעד. משוך לפדר לכיוון inciשיאון, ולהסיר את ההיקף מן הצינורית.
   6. כבה את insufflator ולהשאיר את שסתום צינורית פתוחה לְהַפִיג לַחַץ הבטן כדי להקל החצנה של לפדר. משוך לפדר מחוץ לגוף דרך חתך. לאחר exteriorized, לתפוס לפדר עם hemostats יתושים מעוקל או מלקחיים האגודל כדי להבטיח גישה דרך החתך.
   7. זהה את הקשרים לימפה (ים) בתוך לפדר exteriorized ידי מישוש בלוטת הלימפה התקיפה ו / או ההדמיה ישירה של צבע האפור יותר או מראה קשרים של הבלוטה לימפה.
      1. לאחר הזיהוי, ליצור פתח קטן (~ 3 - 5 מ"מ) ב לפדר ליד הצומת באמצעות hemostats מעוקל. מצורף חינם לפדר באמצעות לנתיחה בוטה עם hemostats המעוקל. ולקשור את כלי הדם עם תפר 4-0 monofilament לא נספגים לפי הצורך. השתמש לנתיחה חדה עם אזמל כדי להסיר את הלימפה. מניחים את הצמתים מכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) 1640 בינוני עלקֶרַח.
   8. בדוק לפדר exteriorized עבור דימום. אם הדימום הוא ציין, לספק המוסטאסיס המתאים ידי הגורם לחסימה של כלי עם hemostats או ליגטורה (תפר 4-0 monofilament לא נספגים), או על ידי שימוש כויה. שחרר לפדר ואת insufflate הבטן בחזרה 10 - 12 מ"מ כספית כדי לאפשר לפדר לחזור חלל הבטן.
   9. חזור על שלבים 2.4.1 דרך 2.4.8 להשיג ביופסיות של בלוטת לימפה נוספות.
5. ביופסיה של הכבד
   1. חזרה לשולחן למצב אופקי.
   2. מניח צינורית מושחלת לתוך הבטן דרך החתך השתמש בעבר עבור אוסף ביופסיה של בלוטה (חתך שנעשה צעד 2.3.5). ודא החתך הוא גדול מספיק (~ 5 - 7 מ"מ) כדי לאפשר מיקום צינורית ללא החדרת נקז. הכנס את ההיקף הנוקשה דרך צינורית זו כלפי חלל הבטן גולגולתי ולדמיין את הבטן וכבדה גולגולתי.
   3. תחת ויזואליזציה מצלמה, להכניס את ביופסית Forceps באמצעות צינורית להציב בעבר בבטן גולגולתי שמאלה (חתך שנעשה צעד 2.3.1).
   4. כדי להשיג ביופסיות כבדות, למקם את מלקחי הביופסיה מתחת שולי אונה כבדה שנבחרו עם החלק הנע של הלסת מול הכבד, לפתוח את המלקחיים, ולאפשר את השולים לנפול לתוך הלוע הפעור. ודא כי אין omentum הוא בין בכבד מלקחי ביופסיה. התאם את המיקום של המלקחיים ולסגור את המכשיר על האזור הרצוי המדגם.
      1. המשך ללחוץ על כ 20 - 30 s כדי להבטיח המוסטאסיס. בעזרת מלקחיים סגרה, להסיר את המדגם על ידי משיכת מלקחיים בעדינות באמצעות צינורית. זה יקרע את הביופסיה בעדינות מכבדה. מניח ביופסיות כבדות ב RPMI 1640 בינוני על קרח.
         הערה: גודל הכבד ביופסיה היא כ 5 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ באמצעות 5 מ"מ מלקחיים ביופסיה.
   5. בדוק את אתר הביופסיה לדימום באמצעות ויזואליזציה מצלמה. אם דימום הוא ציין, להציב moistene מלוחמקלון צמר גפן סטרילי ד באמצעות הצינורית ולהפעיל לחץ לאתר הביופסיה. לחלופין, לארוז באתרי ביופסיה עם קצף ג'ל סטרילי כדי לסייע המוסטאסיס.
   6. חזור על שלבי 2.5.3 דרך 2.5.5 להשיג ביופסיות כבדות נוספות.
      הערה: הנה, 3 ביופסיות לכל חיה לכל הליך נאספו, אשר מספקים את כל הניתוחים במורד הזרם.
6. סגירת כירורגים
   1. בדוק את חלל הבטן עבור דימום.
      הערה: זה לא קרה עד כה. עם זאת, אם דימום יתר הוא ציין, לקבוע את האתר של דימום ולספק המוסטאסיס מתאים באמצעות לחץ עם צמר גפן סטרילי או שימוש קצף ג'ל.
   2. כבה את insufflator ולפתוח את והברזים למיניהם צינורית. הפעל לחץ ידני עדין על הבטן כדי לְהַפִיג לַחַץ חלל הצפק במלואה. הסר את קנולות.
   3. סגור כל חתכים בדופן הבטן עם 1 עד 2 תפרים נקטעו פשוטים לכל אתר. 4-0 תפר נספג מומלץ.
   4. בצע לחסום להתיז על ידי הצבת bupivacaine 0.1-0.3 סמ"ק בכל חתך על כאבים מקומיים לפני סגירת העור.
   5. סגור את העור עם 1 - 2 קבור תפרים מופרעים (4-0 תפר נספג מומלץ) לכל אתר. דבק רקמות ניתן להחיל.

3. עיבוד ביופסיה של הכבד וניתוח לימפוציטים

1. אחסנו מספר חתיכות של רקמת כבד (כ 0.5 מ"מ x 0.5 מ"מ x 0.5 מ"מ גודל) צינורות להקפאה, בפתרון אחסון RNA מועדף, ו פורמלין 10% עבור מולקולרית היסטולוגית בעתיד המנתח.
   1. מניחים את ביופסיות כבד שנותרו 50 מ"ל של RPMI 1640 בינוני בתוספת פניצילין / סטרפטומיצין 1x, 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​של תמיסת collagenase זמינים מסחרית, וכן 4 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNAse בכוס פלסטיק סטרילי 250 מ"ל עם מכסה. מערבבים נמרצות באמצעות בר ומערבבים מגנטי וצלחת ומערבבים במשך 1 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
2. שווה להפיץ ידי מזיגת הרקמה מתעכלת. Grind הרקמה מתעכל (משלב 3.1.1) מעל שני 70 מיקרומטר מסננים מתאימים לשתי 50 צינורות מ"ל חרוטי לתוך ההשעיה תא בודד באמצעות לסוף מזרק 5 מ"ל סטרילי. תביא את הנפח של שני צינורות 50 מיליליטר ב RPMI 1640 בינוניות בתוספת 10% בסרום שור עוברי 1x פניצילין / סטרפטומיצין (R10).
3. צנטריפוגה התאים ב 840 XG במשך 6 דקות ב 4 °. למזוג supernatant. לרכז את התאים לתוך צינור חרוטי יחיד 50 מ"ל ידי השעיית תאים מן הצינורות הן 5 מ"ל R10 ושילוב לתוך צינור חרוטי אחד 50 מ"ל. תביאו נפח 50 מ"ל באמצעות R10. ספירת תאים באמצעות hemocytometer לקבוע תשואה הסלולר.
   1. צנטריפוגה התאים ב 840 XG במשך 6 דקות ב 4 °. Resuspend התאים 1 R10 מ"ל, להפיץ באופן שווה לשני צינורות פוליסטירן 5 מ"ל מסביב לתחתית ולהביא את עוצמת הקול של כל הצינור כדי 4 מ"ל עם R10, מיקוד עבור> 500,000 תאים בצינור אחד.
4. צנטריפוגה התאים ב 840 XG במשך 6 דקות ב 4 °. למזוג היםupernatant מחדש להשעות את התא גלולה בופר פוספט 4 מ"ל (PBS). צנטריפוגה ב 840 XG במשך 6 דקות ב 4 °.
5. למזוג supernatant ו resuspend התאים 100 μL של PBS על ידי vortexing בעדינות. להוסיף 1.5 μL של כתם התא מת fixable. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
6. מוסיפים את נוגדנים מכתים משטח חי הבאים טיטר המומלץ על ידי היצרן: CD45-PerCP (שיבוט D058-1283), CD3-PE-CF594 (שיבוט SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (שיבוט 2H7), CD4-BV605 ( שיבוט OKT4), CD8-BV570 (שיבוט-T8 RPA), ו CD14-BV785 (שיבוט M5E2). לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
7. להוסיף 4 מ"ל PBS ו צנטריפוגות ב 840 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C. למזוג supernatant ו resuspend התאים 250 μL של paraformaldehyde 1% ב PBS.
   זהירות: Paraformaldehyde רעיל. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים.
8. נתח את אוכלוסיות תאים באמצעות cytometer זרימה כמתואר התייחסות ^22.

תוצאות

שיטות מפורטות עיבוד של MLN שנאסף בגישה לפרוסקופית, כמו גם תשואות הסלולר, ותדרים לויקוציטים איברים אלה דווחו בעבר ^13. איור 1 מציג נתוני תשואות כדאי הסלולר השוואת MLN ו ביופסיות כבדות נאספים בשתי נקודות זמן בנפרד 160 ימים משני מנהלים אזוריים נקבה בריאות באמצעות טכניקה לפרוסקופית זה. מצאנו כי התשואה הסלולר מן MLN היה גבוה משמעותית מן הכבד (P = 0.0021), עם ממוצע של 33.5 x 10 ⁶ ו 6.74 x 10 ⁶ תאים שהושג, בהתאמה. מכתים וניתוח תא המלח ידי cytometry הזרימה עולה כי> 90% של תאים מבודדים איברים הן היו קיימא.

באמצעות זרימת cytometry, אנו הערכנו ומשווים את השפע לויקוציטים הלימפוציטים MLN והכבד. ערכת gating נציג עבור הכבד מוצגת + תאים, ולבסוף CD3 ⁺ תאים. מתוך אוכלוסיית CD3 ^+, בדקנו שכיחותם של CD4 ⁺ ו- CD8 ⁺ T תאים, בעוד אנו הערכנו שכיחותם של CD14 ⁺ ו- CD20 ⁺ תאים מן האוכלוסיות CD3-. תזרים נציג cytometry חלק מראה CD45 ⁺ ו CD3 ⁺ אוכלוסיות מן MLN וכבד הוא בחיות בבית היום 0 ויום 160 מוצג באיור 3, בעוד איור 4 מציג שכיחותם לויקוציטים ו הלימפוציטים עבור שתי הדגימות של שתי החיות. MLN הראה משמעותי שכיחותם גבוהה של CD45 ⁺ תאים מאשר בכבד (בממוצע 76.9% ו 7.66% של תאי קיימא, בהתאמה, P = 0.0002). באופן לא מפתיע, MLN הראה פרופורציות גבוהות משמעותי של תאי CD3 ⁺ T (P0; 0.0001) ו- CD4 ⁺ T תאים (P = 0.0004). מנגד, הכבד הועשר משמעותית עבור CD14 ⁺ לויקוציטים בהשוואה MLN (P = 0.0036). MLN הראה ממוצע גבוה של תאי CD8 ⁺ T, אבל זה לא היה משמעותי. באופן מפתיע, עבור שתי החיות האלה הן האיברים הפגינו שכיחותם דומה של תאי CD20 ⁺ B. התשואות ואת שכיחותם הסלולר של תת לויקוציטים ו הלימפוציטים שונה MLN במחקר זה אשר שדווחו בעבר ערכים ^23.

איור 1. תשואה סלולר סה"כ (למעלה) ואת כדאיות התא (למטה) מן סדרתי MLN נאסף כבד ביופסיות. MLN הראה משמעותי בתשואות תא גבוהות מזה של הכבד. עם זאת, שני סוגי מדגם סיפק תאים בשפע ניתוחים במורד הזרם. כדאיויות תא, הנמדדות על ידי הזרימה cytometrically באמצעות כתם אמין תא מת fixable, הראה כי סוגים מדגמים הוא בדרך כלל הניבו> כדאיויות תא 90% לאחר ניתוק רקמה. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן בין דגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. נציגי cytometry זרימת אסטרטגית Gating. ראשית, תאים מצטברים נכללו, ואחריו מבחר של תאי קיימא רק לאחר מכתים באמצעות כתם אמין תא מת fixable. הבא, לויקוציטים CD45 ⁺ נבחרו, ואחריו מבחר של תאי CD3 ⁺ T. מתוך האוכלוסייה CD3 ^+, CD4 ⁺ ו- CD8 ⁺ T תאים נותחו. מתוך CD3 ^- אוכלוסייה, CD14 ⁺ ו- CD20 ⁺ תאים נותחו. תי אסטרטגית gating ים גם שמשה עבור mln. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. מגרשים cytometry זרימה מן MLN והכבד של שתי חיות Longitudinally. MLN ודגימות כבדות נאספו בנפרד 160 ימים הם חיות. (א). MLN CD45 ⁺ תאים (לויקוציטים); (B) הכבד CD45 ⁺ תאים (לויקוציטים); (ג) MLN ⁺ CD3 ⁺ תאים (תאי T); (ד) כבד CD3 ⁺ תאים (תאי T). הן אצל בעלי החיים, את MLN הראה פרופורציות גבוהות של CD45 ⁺ ו CD3 ⁺ תאים לעומת הכבד. מעבר זמן, התדרים של אוכלוסיות אלה היו דומים בשתי החיות.s / ftp_upload / 55,617 / 55617fig3large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. תדרים של CD45 ⁺ תאים (משמאל) ליקוציט שונה לימפוציטים subpopulations (מימין) מול 23 דגימה בודדת. MLNs מוצג תדר גדול המשמעותי של CD45 ^+, CD3 ^+, ו CD4 ⁺ תאים, בעוד הכבד הראה תדרים גדולים יותר באופן משמעותי של לויקוציטים CD14 ^+, הוכיח את הפונקציות הייחודיות של כל איבר. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן בין דגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

הנה, אנחנו מדגימים טכניקה פולשנית עבור אוסף סדרה של MLN ו ביופסיות כבדות כי הייתה שיעור הצלחה 100% בחיות אלו ואחרות לא המתוארים במחקר זה. יתר על כן, שימוש בטכניקה זו על אותו החיים ברחבי זמן לא היה קשור בשום תופעות לוואי. ואכן, לא חלו סיבוכים הנובעים משימוש בטכניקה זו בקבוצות אחרות של בעלי חיים שהיו נגועים ב- SIV, הקופי / וירוס הכשל החיסוני האנושי (שיב), או וירוס זיקה (נתונים שלא פורסמו). בדומה לכך, הניתוח הזה הוכיח את יעילותו גם אצל בעלי חיים שעברו ניתוח בטן גדול בעבר, והן חיות thrombocytopenic (נתונים שלא פורסמו). הראינו כי דגימות אלה ניתן לאסוף באמצעות אותם שני פורטים על ידי היפוך מיקום המצלמה בעת מעבר MLN בכבד הימנעות צורך חתכים נוספים. גורמים המשפיעים על האוסף של MLN דווחו בעבר ^13.

class = "jove_content"> עד ארבע קולקציות של 3 MLN ו 3 ביופסיות כבדות כל בוצע לאורך זמן על בעלי חיים בודדים בלי סיבוכים, שינויים בשערי ההצלחה, או שינויים בנתונים שנאספו. בנוסף, טכניקת אוסף MLN / כבד לפרוסקופיים זה כבר משולב בהצלחה עם הליכים אחרים כגון אוסף של LNs פריפריה, ואת עליונות אנדוסקופית נמוכות ביופסיות GI, שאיבת מוח עצם, אוסף נוזל השדרתי, ו venipuncture באותו אירוע ההרדמה המאפשר הערכה מקיפה של וירולוגית ותגובות חיסוניות באופן סדרתי (נתונים שלא פורסמו).

ההליך כולו בדרך כלל לוקח 30 - 45 דקות כדי להשלים מושגת באמצעות שני ~ 0.5 חתכים ס"מ. אצל בעלי חיים שמנים, ייתכן שיהיה צורך לבצע חתך גדול יותר (~ 1 - 1.5 ס"מ) כדי לאחזר MLN דרך ולהצריך זמן נוסף כדי להשלים. בעלי חיים עם שומן mesenteric נרחב קרובות דורשים ניסיון משמעותי דifferentiate MLN מן השומן שמסביב. MLN נמצא בדרך כלל לאורך כלי דם mesenteric ו נראה נפוצה יותר ליד נקודות סניף הכלי. היבט קריטי של הטכניקה הזו הוא שהיא דורשת MLN הנבחרת יש ניידות מספיק לפדר להיות exteriorized דרך החתך בבטן. כתוצאה מכך, הטכניקה הזו לא ניתן להשתמש כדי לאסוף MLN קרוב לשורש לפדר. בשל ההגדלה, זה לפעמים יותר קל לזהות MLN עם המצלמה, ואוחזים בסמיכות לבית MLN יכול לעזור באיתור וזיהוי הצומת לאחר שהוא exteriorized.

תנוחת Trendelenburg לא תמיד תידרש לאיסוף MLN, ואם MLN ניתן לאחזר בקלות ללא שימוש בעמדת Trendelenburg זה יכול לעשות ביופסיות כבדות יותר קלה כפי שהוא ימנע את האיברים מן ההסטה cranially. לפעמים, אחרי מיקום עמדת Trendelenburg, הכבד מוסט למעלה נגד הסרעפת וחייבת לטפל בעדינות חזרה למקומו לפני לאוסף ביופסיה. כמיקום היציאה לאיסוף MLN הוא שמאלה, ביופסיות כבדות בדרך כלל נלקחות מן האונות בכבד המדיאלי לרוחב שמאל שמאל כפי שהם קרובים הצינורית.

MLN נאסף ביופסיות כבדות ספקו תשואות תא מספיק עבור מגוון רחב של זרם ניתוחים והראו כדאיויות גבוהות של התאים שנאספו. הנה, התאים היו מוכתמים עבור ניתוח התזרים cytometric של אוכלוסיות לויקוציטים ו לימפוציטים, ואת ההבדלים עיקריים בין שני האיברים חיסוניים חשובים האלה לובנו. לדוגמה, MLN היו מועשר עבור תאים מסוג CD4 ⁺ T לעומת הכבד, בשל החשיבות של MLN כנקודות מרכזי לאיסוף והפצת המערכת החיסונית אדפטיבית, כמו גם את החשיבות של CD4 ⁺ T לניהול דלקתיות תגובות tolerogenic אל המילייה אנטיגנים שמקורם צריכה תזונתית ומיקרואורגניזמים GI-התושבs = "Xref"> 24. עם זאת, הכבד הועשר משמעותי עבור CD14 ⁺ לויקוציטים בהשוואת mln. CD14 מתבטא בעיקר על מונוציטים מקרופאגים ומהווה מרכיב מרכזי של מתחם קולטן עבור lipopolysaccharide חיידקים (LPS) ^25. ואכן, ריכוזי פלזמה מוגברים CD14 המסיס הקשורים טרנסלוקציה חיידקי הפעלה חיסונית ב HIV ודלקות SIV פתוגניים ^26. לפיכך, תדירות גבוהה יותר של CD14 ⁺ לויקוציטים בכבד תוצאה מסתברת מנטל חיידקי יותר האיבר הזה בהשוואה mln.

הנה, אנחנו מדגימים טכניקה כירורגית מהירה זעירה-פולשנית, אוסף סדרה של MLN ו ביופסיות כבדות רק באמצעות שני חתכים קטנים לכניסה לפרוסקופי כי לא הובילה לשום תוצאות שליליות. דגימות אלה משמשות ערוץ שימושי להעריך Virological אימונולוגית, מפתח, ואת תהליכי מיקרוביולוגים כי לקחת PLACE ב MLN והכבד, נבדלות וייחודיות מחסינות מערכתית. באופן דומה, ביופסיות כבד הן קריטיות עבור הערכה ארוכת טווח של תופעות של HIV / SIV, טיפולים תרופתיים, חיידקים translocated, אשר לעתים קרובות לשלב כדי לגרום נזק כבד משמעותית ^16. יתרה מזאת, מאחר MLN והכבד הם איברים חיסוניים חשופים חיידקים במערכת עיכול, את היכולת להעריך חסינות באיברים אלה על פני הזמן מספק פלטפורמה מצוינת להבנת התפקיד כי Microbiome משחק בשמירה על הומאוסטזיס החיסון של פונדקאי. יחדיו, הערכה של הכבד MLN הנה בעלת חשיבות רבה בהקשר של חיסון efficacies הטיפולית, אישור למאגר ויראלי SIV, וחסינות רירית בכלל. היכולת לאסוף דגימות אלה באמצעות גישה פולשנית כלומר יש פחות סיכון של דלקת הקשורים בהליך מ קיים עם טכניקות שפורסמו כרגע ופחות השפעה על פיזיולוגית החיות. ב פוture, נוכל להעריך את הפוטנציאל לשלב את אוסף MLN וכבד עם האוסף של טחול באמצעות אותם שני מקומות הנמל כדי לאפשר דגימה של עוד חלק חשוב וייחודי של מערכת החיסון כי הוכח לשחק תפקיד משמעותי מספר מודלי מחלה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דמעות מלאכותיות חומר סיכה משחת עיניים	פטרסון וטרינרי	97-890-8152
טיפול מועדף כלורהקסידין 2% פילינג	פטרסון וטרינרי	07-842-6153
וודקו אלכוהול, איזופרופיל 70%	פטרסון וטרינרי	07-869-6434
ודקו וטדין סקראב	פטרסון וטרינרי	07-869-6772
הוספירה Lactated Ringer's 250 מ"ל	פטרסון וטרינרי	07-800-9325
וילון כירורגי לפרוטומיה למתבגרים	Medline	DYNJP3004
גישה 40 ליטר Insufflator	Dyonics	7205832
300XL קסנון מקור אור	Dyonics	7206084
460P 3 – מצלמה דיגיטלית CCD עם ראש	Dyonics	72200086
וילון מצלמה אוניברסלי, 7 אינץ' x 96 אינץ'	שירותי תמיכה באנדוסקופיה	ESS-6920
מדריך אור אוניברסלי,	שירותי תמיכה באנדוסקופיה	ארה"ב. OU225
Insufflazor Tubing	Endoscopy שירותי תמיכה באנדוסקופיה	TM-102
היקף קשיח רב תכליתי, 2.7 מ"מ x 187.5 מ"מ,	שירותי תמיכה באנדוסקופיה	B30-0007-00
בחינה ונדן מגן עבור היקף 2.7 מ"מ x 187.5 מ"מ עם פקק אחד קבוע	שירותי תמיכה באנדוסקופיה	B10-0025-00
היקף קשיח, 5 מ"מ x 300 מ"מ	שירותי	תמיכה באנדוסקופיהB30-0071-00
מחט ורס, 2 מ"מ x 80 מ"מ	שירותי תמיכה באנדוסקופיה	8302.08
בדיקה מוצקה עם סימונים, 5 מ"מ x 320 מ"מ	שירותי תמיכה באנדוסקופיה	8383.661
מרילנד אחיזה וניתוח מלקחיים עם ידית מחגר כפולה, 3.5 מ"מ x 240 מ"מ	שירותי תמיכה באנדוסקופיה	8390.2054
מלקחיים ביופסיה, 3.5 מ"מ x 310 מ"מ	R. Wolf	8391.4063
צינורית הברגה מפלסטיק עם יציאת Insufflator, 3.5 מ"מ x 60 מ"מ	שירותי תמיכה באנדוסקופיה	8903.072
צינורית הברגה מפלסטיק עם יציאת Insufflator, 5.5 מ"מ x 60 מ"מ	שירותי תמיכה באנדוסקופיה	8919.333
אנדוסקופיה טרוקר עם קצה קהה	שירותי תמיכה	8903.101
שירותי תמיכה באנדוסקופיה	טרוקר עם קצה פירמידלי	8903.121
CO2	Airgas	CD USPE
RPMI 1640	Fisher Scientific	SH30027FS	עם L-גלוטמין
RNAlater פתרון ייצוב	ThermoFisher Scientific	AM7021
פניצילין-סטרפטומיצין	סיגמא אולדריץ'	P4333
Liberase TM דרגת מחקר	סיגמא אולדריץ'	5401119001	תמיסת קולגנס זמינה מסחרית
Dnase I מלבלב בקר	סיגמא אולדריץ'	D5025
70 ומיקרו; מסנני תאים	m מורגנוויל סיינטיפיק	CSS0200
5 מ"ל מזרק	BD	309646
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים	ThermoFisher Scientific	339652
סרום בקר עוברי	פישר סיינטיפיק	SH3007003
5 מ"ל צינורות פוליסטירן עגולים תחתונים	פישר סיינטיפיק	14-959A
PBS	Fisher Scientific	SH3025601
LIVE / DEAD Aqua ערכת כתמי תאים מתים הניתנת לתיקון	ThermoFisher Scientific	L34957	אמין כתם תאים מתים
CD45-PerCP (שיבוט D058-1283)	BD Biosciences	558411
PE-CF594 עכבר אנטי-Hu CD3 (שיבוט SP34-2)	BD Biosciences	562406
BV605 עכבר אנטי-Hu CD4 (שיבוט OKT4)	Biolegend	317438
APC-H7 עכבר אנטי-Hu CD8 (שיבוט SK1)	BD Biosciences	560179
PE-CY5 עכבר אנטי-Hu CD20 (שיבוט 2H7)	BD Biosciences	555624
BV786 עכבר Anti-Hu CD14 (שיבוט M5E2)	BD Biosciences	563698
16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN	Fisher Scientific	50-980-487
LSR II Flow Cytometer	BD	NA