LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun

Xavier Gallart-Palau; Aida Serra; Siu Kwan Sze

doi:10.3791/55626

Method Article

LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun

DOI:

10.3791/55626

⸱

April 9th, 2017

Xavier Gallart-Palau*¹ , Aida Serra*¹ , Siu Kwan Sze¹

¹Division of Structural Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול של דחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית באורך ארוך אינטראקציה-טנדם כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה (LERLIC-MS / MS) שיטה. זוהי שיטה חדשנית המאפשרת כימות לראשונה ואפיון של isoforms deamidation גלוטמין ו asparagine ידי פרוטאומיקה רובה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון של חלבון deamidation הוא הכרחי כדי לפענח את התפקיד (ים) ועל פוטנציאל של שינוי posttranslational חלבון זה (PTM) בפתולוגיה האנושית בהקשרים ביוכימיים אחרים. על מנת לבצע אפיון של חלבון deamidation, אנו לאחרונה פיתחו ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה-טנדם אינטראקציה ודחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית לטווח אורך הרומן (LERLIC-MS / MS) שיטה שיכולה להפריד בין גלוטמין (GLN) ו asparagine (ASN) איזופורם מוצרים של deamidation מן תרכובות מודל דגימות ביולוגיות מורכבות מאוד. LERLIC-MS / MS היא, אפוא, אסטרטגית פרוטאומיקה הרובה הראשונה להפרדה וכימות של isoforms deamidation GLN. אנחנו גם להפגין, כחידוש, כי פרוטוקול עיבוד מדגם המתוארות כאן מייצב את ביניים succinimide המאפשר אפיון שלה על ידי LERLIC-MS / MS. יישום של LERLIC-MS / MS כפי שמוצג במאמר זה וידאו יכול לעזור כדי להבהיר את כרגע unknowמערכים מולקולריים n של deamidation חלבון. בנוסף, LERLIC-MS / MS מספקת הבנה נוספת של תגובות אנזימטיות כי להקיף deamidation ב רקע ביולוגי מובהק.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deamidation הוא שינוי posttranslational חלבון (PTM) המציג מטען שלילי לשדרת חלבון באמצעות שינוי של asparagine (ASN) ו / או גלוטמין (GLN) שאריות ^1. שינוי זה תוך העמדת פנים שהם שאריות ASN מייצר חומצת isoaspartic מוצרים isomeric (isoAsp) ו- n חומצה -aspartic (ASP) בבית 3 המשותף: יחס 1 ^2. עם זאת, יחס זה ניתן לשינוי על ידי התערבות של methyltransferase L-isoaspartyl אנזים תיקון (PIMT) ^{^3,} ^4. באופן דומה, deamidation של שאריות GLN מייצר חומצת isomeric גלוטמית-גמא (γ-Glu) ו isoforms חומצה גלוטמית-אלפא (α-Glu) במכירה צפוי 1: ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. אריזה-אניוני לטווח האורך (LAX) טור נימים

(הערה: למרות טור LAX יכול להיות בתוך הבית הארוז כפי שאנו מתארים בפרוטוקול זה, עמודות LAX זמינות גם מסחרי, ראה טבלה של חומרים ריאגנטים לפרטים נוספים).

להשעות 50 מ"ג של חומר אריזת אניוני חלש 3.5 מיליליטר של אריזת חיץ (לוח 1) כדי להכין את התרחיף.
להרכיב סוף טור הנימים (אורך 50 סנטימטרים - 200 מיקרומטר צינורות פנימי בקוטר (ID)) באמצעות נקבה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deamidation של שאריות GLN ו ASN נחשב שינוי חלבון ניוונית (DPM) מעורב בכמה מחלות כרוניות קטלנית ^14. הוכח כי PTM זה יכול לחזות את המדינות חצי-חי degradative של נוגדנים ומולקולות אחרות בגוף האדם ורקעים ביולוגיים דומים ^{^1,} ^15. המשמעות של חלבון deamidation, למעשה, מעבר להקשר ביו, ומכאן שינוי זה קיים proteomes מגוונת ^{^16,} ^.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In-מאמר בסרטון הזה אנחנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד של LERLIC-MS / MS ^3, שיטה לבצע אפיון מעמיק כדי לקבוע את המידה במדויק deamidation חלבון לבין תהליכים אנזימטיים מעורבים על שינוי חלבון זה. LERLIC-MS / MS מבוסס על השימוש באורך-ארוך (50 ס"מ) LAX תחת העיקרון של כרומטוגרפיה אינטראקציה-הידרופיליות דחייה אלקטרוסטטית (ERLIC) ^27. שימוש טור ארוך באורך, כפי שמוצג במחקר שלנו ^3, ממקסמת את הפוטנציאל של ERLIC כדי פפטי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו באופן חלקי בסיוע מענקים ממשרד סינגפור החינוך (Tier 2: גרנט ARC9 / 15), לאומי המועצה למחקר רפואי של סינגפור (NMRC-OF-IRG-0003-2016), ו NTU-NHG הזדקנות מחקר גרנט ( גרנט ARG / 14,017). ברצוננו להביע את תודתנו ותודה הכנה ביותר ד"ר אנדרו אלפרט וצוות PolyLC עבור ספק לנו בחביבות עם חומרי האריזה מתאפשרים במחקר זה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
PolyCAT 3 ומיקרו; מ' 100-וארינג; (חומר בתפזורת)	פוליLC בע"מ	הזמנה
מיוחדת עמוד נימי חילופי יונים באורך ארוך 50 ס"מ - 200 ומיקרו; מ ID	PolyLC Inc.	הזמנה
מיוחדת צינורות PEEKsil 1/16 אינץ' OD x 200 ומיקרו; m ID x 50 ס"מ אורך	SGE מדע אנליטי תחת Trajan Scientific Australia	620050
התאמה מנקבה לנקבה עבור צינורות OD בגודל 1/16 אינץ'	Upchurch Scientific	UPCHF-125
אגוז נקבה למיקרופרול	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Microferule	Upchurch Scientific	UPCHF-132
פצצת לחץ NanoBaume	הנדסת נוזלים מערביים	SP-400
Shimadzu בולטות UFLC מערכת	Shimadzu	בולטות UFLC
כדור בלנדר	הבא מתקדם	BBX24
צינורות נעילה בטוחה	Eppendorf	T9661-1000EA
חרוזי נירוסטה. 0.9 – 2.0 מ"מ. 1 ק"ג. לא סטרילי.	נקסט אדוונס	SSB14B
צנטריפוגה שולחנית	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
אמבט מחזור דיגיטלי מחומם סטנדרטי, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 מחסנית התפלה 50 מ"ג	מים	WAT020805
רכז ואקום	Eppendorf	מערכת רכז פלוס
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC
ספקטרומטר מסה Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom תרמו CaptiveSpray	מכרום-ברוקר בע"מ	TCSI-SS2
INCUCELL	MMM Group	INCUCELL111
טריפסין טריפסין שונה בדרגת ריצוף	Promega	V5111
טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז	Roche	11836170001 (ROCHE)
תמיסת חיץ פוספט 10x (מדולל ל-1x)	Sigma-Aldrich	P5493
אמוניום אצטט	Sigma-Aldrich	A1542
נתרן דאוקסיכולאט	סיגמא-אולדריץ	' D6750
דיתיותרייטול	סיגמא-אולדריץ'	D0632
יודואצטמיד	סיגמא-אולדריץ'	i6125
חומצה פורמית	סיגמא-אולדריץ	F0507 (HONEYWELL)
אמוניום הידרוקסיד	סיגמא-אולדריץ	338818 (HONEYWELL)
אצטוניטריל HPLC כיתה	סיגמא-אולדריץ'	675415
איזופרופנול HPLC כיתה	סיגמא-אולדריץ'	675431
מים HPLC כיתה	סיגמא-אולדריץ'	14263

חממת ' '

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomeri....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles