כאן אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול של דחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית באורך ארוך אינטראקציה-טנדם כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה (LERLIC-MS / MS) שיטה. זוהי שיטה חדשנית המאפשרת כימות לראשונה ואפיון של isoforms deamidation גלוטמין ו asparagine ידי פרוטאומיקה רובה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אפיון של חלבון deamidation הוא הכרחי כדי לפענח את התפקיד (ים) ועל פוטנציאל של שינוי posttranslational חלבון זה (PTM) בפתולוגיה האנושית בהקשרים ביוכימיים אחרים. על מנת לבצע אפיון של חלבון deamidation, אנו לאחרונה פיתחו ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה-טנדם אינטראקציה ודחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית לטווח אורך הרומן (LERLIC-MS / MS) שיטה שיכולה להפריד בין גלוטמין (GLN) ו asparagine (ASN) איזופורם מוצרים של deamidation מן תרכובות מודל דגימות ביולוגיות מורכבות מאוד. LERLIC-MS / MS היא, אפוא, אסטרטגית פרוטאומיקה הרובה הראשונה להפרדה וכימות של isoforms deamidation GLN. אנחנו גם להפגין, כחידוש, כי פרוטוקול עיבוד מדגם המתוארות כאן מייצב את ביניים succinimide המאפשר אפיון שלה על ידי LERLIC-MS / MS. יישום של LERLIC-MS / MS כפי שמוצג במאמר זה וידאו יכול לעזור כדי להבהיר את כרגע unknowמערכים מולקולריים n של deamidation חלבון. בנוסף, LERLIC-MS / MS מספקת הבנה נוספת של תגובות אנזימטיות כי להקיף deamidation ב רקע ביולוגי מובהק.
מבוא
Deamidation הוא שינוי posttranslational חלבון (PTM) המציג מטען שלילי לשדרת חלבון באמצעות שינוי של asparagine (ASN) ו / או גלוטמין (GLN) שאריות 1. שינוי זה תוך העמדת פנים שהם שאריות ASN מייצר חומצת isoaspartic מוצרים isomeric (isoAsp) ו- n חומצה -aspartic (ASP) בבית 3 המשותף: יחס 1 2. עם זאת, יחס זה ניתן לשינוי על ידי התערבות של methyltransferase L-isoaspartyl אנזים תיקון (PIMT) 3, 4. באופן דומה, deamidation של שאריות GLN מייצר חומצת isomeric גלוטמית-גמא (γ-Glu) ו isoforms חומצה גלוטמית-אלפא (α-Glu) במכירה צפוי 1: ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. אריזה-אניוני לטווח האורך (LAX) טור נימים
(הערה: למרות טור LAX יכול להיות בתוך הבית הארוז כפי שאנו מתארים בפרוטוקול זה, עמודות LAX זמינות גם מסחרי, ראה טבלה של חומרים ריאגנטים לפרטים נוספים).
- להשעות 50 מ"ג של חומר אריזת אניוני חלש 3.5 מיליליטר של אריזת חיץ (לוח 1) כדי להכין את התרחיף.
- להרכיב סוף טור הנימים (אורך 50 סנטימטרים - 200 מיקרומטר צינורות פנימי בקוטר (ID)) באמצעות נקבה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Deamidation של שאריות GLN ו ASN נחשב שינוי חלבון ניוונית (DPM) מעורב בכמה מחלות כרוניות קטלנית 14. הוכח כי PTM זה יכול לחזות את המדינות חצי-חי degradative של נוגדנים ומולקולות אחרות בגוף האדם ורקעים ביולוגיים דומים 1, 15. המשמעות של חלבון deamidation, למעשה, מעבר להקשר ביו, ומכאן שינוי זה קיים proteomes מגוונת 16, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
In-מאמר בסרטון הזה אנחנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד של LERLIC-MS / MS 3, שיטה לבצע אפיון מעמיק כדי לקבוע את המידה במדויק deamidation חלבון לבין תהליכים אנזימטיים מעורבים על שינוי חלבון זה. LERLIC-MS / MS מבוסס על השימוש באורך-ארוך (50 ס"מ) LAX תחת העיקרון של כרומטוגרפיה אינטראקציה-הידרופיליות דחייה אלקטרוסטטית (ERLIC) 27. שימוש טור ארוך באורך, כפי שמוצג במחקר שלנו 3, ממקסמת את הפוטנציאל של ERLIC כדי פפטי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו באופן חלקי בסיוע מענקים ממשרד סינגפור החינוך (Tier 2: גרנט ARC9 / 15), לאומי המועצה למחקר רפואי של סינגפור (NMRC-OF-IRG-0003-2016), ו NTU-NHG הזדקנות מחקר גרנט ( גרנט ARG / 14,017). ברצוננו להביע את תודתנו ותודה הכנה ביותר ד"ר אנדרו אלפרט וצוות PolyLC עבור ספק לנו בחביבות עם חומרי האריזה מתאפשרים במחקר זה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| PolyCAT 3 ומיקרו; מ' 100-וארינג; (חומר בתפזורת) | פוליLC בע"מ | הזמנה | |
| מיוחדת עמוד נימי חילופי יונים באורך ארוך 50 ס"מ - 200 ומיקרו; מ ID | PolyLC Inc. | הזמנה | |
| מיוחדת צינורות PEEKsil 1/16 אינץ' OD x 200 ומיקרו; m ID x 50 ס"מ אורך | SGE מדע אנליטי תחת Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| התאמה מנקבה לנקבה עבור צינורות OD בגודל 1/16 אינץ' | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| אגוז נקבה למיקרופרול | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| פצצת לחץ NanoBaume | הנדסת נוזלים מערביים | SP-400 | |
| Shimadzu בולטות UFLC מערכת | Shimadzu | בולטות UFLC | |
| כדור בלנדר | הבא מתקדם | BBX24 | |
| צינורות נעילה בטוחה | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| חרוזי נירוסטה. 0.9 – 2.0 מ"מ. 1 ק"ג. לא סטרילי. | נקסט אדוונס | SSB14B | |
| צנטריפוגה שולחנית | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| אמבט מחזור דיגיטלי מחומם סטנדרטי, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 מחסנית התפלה 50 מ"ג | מים | WAT020805 | |
| רכז ואקום | Eppendorf | מערכת רכז פלוס | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| ספקטרומטר מסה Orbitrap Elite | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom תרמו CaptiveSpray | מכרום-ברוקר בע"מ | TCSI-SS2 | |
| INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| טריפסין טריפסין שונה בדרגת ריצוף | Promega | V5111 | |
| טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| תמיסת חיץ פוספט 10x (מדולל ל-1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| אמוניום אצטט | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| נתרן דאוקסיכולאט | סיגמא-אולדריץ | ' D6750 | |
| דיתיותרייטול | סיגמא-אולדריץ' | D0632 | |
| יודואצטמיד | סיגמא-אולדריץ' | i6125 | |
| חומצה פורמית | סיגמא-אולדריץ | F0507 (HONEYWELL) | |
| אמוניום הידרוקסיד | סיגמא-אולדריץ | 338818 (HONEYWELL) | |
| אצטוניטריל HPLC כיתה | סיגמא-אולדריץ' | 675415 | |
| איזופרופנול HPLC כיתה | סיגמא-אולדריץ' | 675431 | |
| מים HPLC כיתה | סיגמא-אולדריץ' | 14263 |
מקורות
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomeri....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
