מאמר שיטה

דיסקציה של הלבלב העכבר עבור ניתוח היסטולוגית והגדרת פרופיל מטבולי

39.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55647

⸱

19 באוגוסט 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Miami University, 2College of Medicine, Central Michigan University

במאמר זה

סיכום

המאמר וידאו מספק הפגנה מפורט של ההליכים הנדרשים בהצלחה להסיר בלבלב עכבר על-ידי ניתוח עבור ניתוח היסטולוגית והגדרת פרופיל מטבולי.

תקציר

לנו יש כבר חוקרת את הלבלב גורם שעתוק ספציפיים, 1a cre-recombinase; לקס-עצור-סלומון-קריסטן עכברוש סרקומה, גליצין כדי חומצה אספרטית-codon 12 (Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / +) העכבר זן כמודל של סרטן הלבלב אנושי. מטרת המחקר הנוכחי שלנו הוא לזהות סמנים מטבוליים חדשניים של התקדמות סרטן הלבלב. ערכנו פרופיל מטבולי של שתן, צואה, דם, ואת תמציות רקמת הלבלב, כמו גם ניתוחים היסטולוגית של הלבלב לביים את התקדמות סרטן. הלבלב העכבר אינו איבר מוצק מוגדר היטב כמו בבני אדם, אך מעדיף רקמה רכה diffusely מבוזרת לא בקלות המזוהה על-ידי אנשים מכירים את האנטומיה הפנימית העכבר או על ידי יחידים שיש להם מעט או ללא ניסיון ביצוע העכבר איברים והניתוחים. מטרת מאמר זה היא לספק מפורטת step-wise ויזואלית הפגנה מדריך טירונים להסרת הלבלב העכבר על ידי ניתוח. מאמר זה צריך להיות יקר במיוחד סטודנטים, חוקרים חדשים למחקר הדורש קציר בלבלב עכבר על-ידי ניתוח פרופיל מטבולי או ניתוחים היסטולוגית.

מבוא

העכבר התפתחה חשוב במודל חיה של סרטן הלבלב האנושי1,2. ב- Ptf1acre / +; LSL-קראסG12D / + דגם העכבר, קריסטן עכברוש סרקומה (K-Ras) אונקוגן מופעל באופן בלעדי הלבלב, וכתוצאה מכך חניכה של נגעים טרום סרטניים בלבלב, המכונה הלבלב neoplasias intraepithelial הנרתיק (PanINs), לזה ההתקדמות כדי אדנוקרצינומות ductal הלבלב, נפוץ המכונה PDACs3. מערכת מודל זה העכבר מספק אחד מהדגמים הכי זמין בבעלי חיים עבור סרטן הלבלב האנושי4,5, עם יתרון נוסף העולות PanINs בתוך בחמשת החודשים הראשונים של החיים ולעיתים קרובות התקדמות PDAC בתוך יחיד בן4,5, ואילו סרטן הלבלב מתרחשת לעתים קרובות ביותר בבני 60-70 שנים של גיל.

מיצוי של הלבלב על ידי ניתוח של Ptf1acre / +; LSL-קראסG12D / + עכברים בגילאים שונים מאפשרת בדיקה היסטולוגית האורך מקיפה של התפתחות סרטן הלבלב, החל בשלבים המוקדמים הייתה דרך ההתקדמות PDAC3,4 , 5. קצירת הלבלב בגילאים הנעים מ-5 עד חמישה עשר חודשים יכול לשמש גם כדי להכין טישו תמציות לאפיין שינויים כלליים בחילוף החומרים4 הלבלב להתרחש במהלך המעבר בריא רקמה חולה 6,7.

מאמר זה מציג מדריך ויזואלי מלא של כל השלבים הדרושים לביצוע חילוץ הלבלב של העכבר, מספקת קווים מנחים עבור אחסון פוג'אלאדוצ'נוי זהאלאזי לצורך ניתוח נוסף. מדריך זה יהיה שווה ערך עבור יחידים ניסוי על מחלות אחרות הלבלב, לרבות סוג של סוכרת, צריכה להיות שימושית במיוחד סטודנטים, חוקרים חדשים למחקר מעורבים קציר של הלבלב העכבר באמצעות ניתוח פרופיל מטבולי או ניתוחים היסטולוגית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההליכים וידאו והנחת המתוארים להלן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת מיאמי.

1. הכנה ובדיקה הגירוי

  1. צור שני תחומים ברורים הליך כירורגי, שולחן הניתוחים של הטבלה פעולה-מאוחרת. שלב שני אזורים עם כל חומרים וכלים הדרושים. שולחן
    1. הבמה פעולתו ברדס פרקו. לסדר את השולחן. עם הציוד באופן המאפשר ביצועים רציפה, ללא הפרעה של ההליך-
    2. ליצור טבלה לאחר הניתוח באותו החדר, ליד השולחן הראשי של המבצע. לשמור על שתי הטבלאות כמו סביבות סטרילי לאורך כל ההליך.
  2. המקום הבאות מספקת על שולחן הניתוחים: כוס אחת צנצנת עם מכסה, שפופרת אחת 15 מ"ל, זוג מספריים כירורגיים, בקבוק לחיץ אחד של 70% אתנול, שתי לוחות קצף, מלקחיים שני, שני מזרקים מד 1 מ"ל 21, שני צינורות 50 מ ל, שפופרת אחת צנטריפוגה , בקבוקון אחד קריוגני 4 רפידות כירורגי, עשר סיכות, מתקן של מגבונים חיטוי, מיכל שרפ.
  3. למקם את המצרכים הבאים על השולחן פעולה-מאוחרת: איזון האנליטי אחד, אחד דיואר L 4 של חנקן נוזלי, רחב רדוד פה דיואר מתלה microtube צף, זוג מספריים כירורגיים, מלקחיים שני, 4 מבחנות הקפאה, מתקן של מגבונים סטריליים.
  4. למלא אחד 50 mL ושפופרת אחת 15 מ"ל לאמצעי 75% עם פורמלין.
  5. שימוש במספר זיהוי אישי בכל פינה, מוספית אחת כירורגי pad כדי לוח מוקצף משוער 30 ס"מ על 30 ס"מ כדי לשמש הלוח לנתיחה. להשתמש בפינים ארבעת הנותרים במהלך המבצע. להכין לוח מוקצף קטן עם כרית כירורגית כדי להעביר את האיברים הטבלה לאחר הניתוח.
    התראה: איזופלוריין (99.9%) כימי רעיל, אמור לשמש בשכונה האוורור כדי להבטיח את הרמה המקסימלית של ביטחון מפני ניקוי פסולת גז הרדמה 8. ניתן למצוא פרטים נוספים אודות הסיכונים לחוקרים הקשורים לשימוש של השיטה הפתוחה-שחרור באמצעות איזופלוריין מאמר מאת טיילור ו מוק 8.
  6. מקום אחד משטח כירורגי לתוך צנצנת זכוכית להשרות כמה טיפות של איזופלוריין (99.9%) ומניחים מגבת נייר לפסגה כדי למנוע מגע ישיר של העכבר עם איזופלוריין. באופן דומה, להשתמש בפתקים כירורגי קו הצינור הנותרים, להשרות כמה טיפות של איזופלוריין ולמקם רכיב pad נוספים לפסגה כדי למנוע מגע ישיר בין העכבר את איזופלוריין.
  7. חנקן נוזלי לשפוך לתוך הפה רחב רדוד דיואר עד למקסימום מילוי קו מתמלאת.
  8. המקום העכבר שנבחר עבור ניתוח לתוך ההרדמה קאמרית, כלומר צנצנת הזכוכית עם כרית ספוג עם כמה טיפות של איזופלוריין (99.9%) מכוסה את המכסה, עבור מינימלית ~ 1
    הערה: הפעם משתנה של עכבר. ברגע העכבר מחוסר הכרה, להסיר אותו מן החדר ומניחים אותו על גבי לוח ההפעלה.
  9. אוריינט העכבר כך הוא שוכב בצד הגחוני והגביר את ראשו הצביע מן המדען. שים את ראשך בתוך הצינור מרופדת עם כרית כירורגי שרויות במים עם מספר טיפות של איזופלוריין (99.9%), ולבצע מבחן גירוי על ידי צביטה רגל כדי להבטיח העכבר מגיב לגירויים.
    1. אם נכשלת במבחן זה העכבר מגיב במבחן קמצוץ רגל, חזור על שלב 1.8.

2. ראשוניות החתך לב לנקב, המתת חסד

  1. להצמיד את הגפיים של העכבר ללוח קצף כירורגי. ולהשתין הצד הבטני של העכבר באמצעות אתנול 70%-
  2. לצבוט הפרווה/העור ליד הפתח השופכה עם מלקחיים ולמשוך מעט כלפי מעלה. לעשות חתך עם המספריים כירורגי דרך חלל הבטן החל פתח השופכה, את האמצע ואת הסוף על הסנטר.
    1. ליד נקודת המוצא של החתך הראשוני, תפוס צד אחד של הפרווה/העור עם המלקחיים, להפוך את חיתוך נוסף עם המספריים כלפי מטה באלכסון לכיוון הכפה גב-
    2. חוזר זה באופן זהה בצד השני.
      הערה: הפרווה/העור עלול להיסגר כדי ליצור פתח רחב יותר, אך לא הכרחי.
  3. לאתר הלב ולהסיר את קרום הלב, אשר נמצא השק. סביב הלב, כדי למנוע סתימת מחט מזרק.
    1. ולהיאחז הכפורת בעזרת המלקחיים. ולהפסיק עם המספריים. לבצע הניקוב הלב על ידי בקפידה החדרת מחט מזרק לתוך הלב הפועם ולאט לאט מתחילים לחזור בו הבוכנה.
    2. לאיסוף דם מיטביים, השתמש הבוכנה של המחט לחקות את פעולת השאיבה של הלב ואף להימנע מהדפסת מהר מדי.
      הערה: בדרך כלל כ 1 מ"ל של דם ניתן לאסוף.
    3. לאחר השלמת איסוף דם, להפיג את הדם לתוך צנטריפוגה צינור והשלך המזרק לתוך המיכל שרפ.
    4. לאחר הניקוב הלב מבוצע, לבצע המתת חסד על-ידי הסרת הקבצים המצורפים חיבור הלב.
      הערה: הפארין, אנטי מקריש, לא נוסף את המזרק בהליך זה לפני הניקוב הלב כדי לאפשר את הדם והקרשה לאוסף סרום במחקר ספציפי זה. עם זאת, אם החוקר רצה למנוע קרישת דם כדי לאסוף פלזמה, הפארין היתה אפשרות להוסיף את המזרק לפני הניקוב הלב.
  4. אם המחקר כרוכה genotyping של העכבר, לגזור חלק האוזן עם המספריים ומניחים לתוך שפופרת צנטרפוגה עבור אימות גנוטיפ.

3. החילוץ הלבלב

  1. אתר בבטן בצד שמאל של העכבר. בגין בעדינות (כדי למנוע קריעה) הפרדת הלבלב הקיבה, התריסריון באמצעות מלקחיים שני.
    הערה: בעת ניתוק הלבלב הקיבה, המעיים, חשוב מאוד כי המלקחיים משמשים בעדינות כדי להנחות את רקמת הלבלב מן האברים וכדי לא למעוך או לקרוע את הלבלב עם המלקחיים.
    1. להמשיך להפריד בין הלבלב מן הסעיפים מעי ו המעי הדק, ולבסוף החל caecum של המעי הגס.
  2. ב caecum, מיקום מחדש של המלקחיים ולהמשיך ההפרדה של הלבלב לאורך המעי הגס הנותרים לקראת בחלחולת.
    הערה: בשלב זה, זה נוח לחתוך ולהסיר את החלק מן הקיבה לאזור של המעי הגס מיד לפני החלחולת.
  3. לאתר הלבלב ומצורפת הטחול. החלק הלבלב כלפי הצד הימני של העכבר. להפריד את החיבורים שנותרו בין הלבלב חלל בית החזה עם המלקחיים להתנתק לחלוטין לבלב וטחול מחודשים, נוחים ומרווחים.
  4. להסיר את הלבלב, להפיץ את זה לבדיקה. השאר הטחול קשור הלבלב למטרות זיהוי.
    1. הסר כל רקמת חיבור, רקמת שומן, מצע המעי העליון מן הלבלב.
      הערה: זה רקמות לבן בצבע, ולכן ניתן בקלות להבחין בין רקמת לבלב זה pinker בצבע. הדבר חשוב במיוחד אם הלבלב כל צריך להיות מוסר. לדוגמה, אם הלבלב צריך להיות שקל, לעומת משקל הגוף או בין קבוצות של בעלי חיים. ב- Ptf1a cre / +; LSL-קראס G12D / + דגם העכבר, במיוחד בחודשים בוגרים, קשה סיבי רקמת הלבלב יכול להיות נוכח. במקרה זה, הסרת זהיר של הלבלב שחייבת להתנהל כמו המעיים יכול להיות שזורה ברקמת הגידול. במקרים מתקדמים, הטחול לא תקין ואת רקמת הכבד עשוי גם להיות נוכח.
  5. במידת הצורך, מסירים איברים אחרים בשלב זה.

4. איסוף נתונים ואחסון

  1. לאחר החילוץ של האיברים, מעביר את הדגימות לאזור לאחר הניתוח לשימור.
  2. שוקל כל איבר ואיבר ולמקם אותם לתוך המבחנה קריוגני בהתאמה שלהם.
    הערה: לאורך שנינותh המסה של כל דגימה, חריגות צריך להיות מוקלט לשימוש עתידי.
  3. לאחר ששקלת את האיברים, למקם אותם לתוך החנקן הנוזלי עבור הצמד לקפוא.
  4. אחרי הצמד קופאים, לאחסן את האיברים ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך-
  5. למקם את הדגימות פורמלין המאוחסנים על גבי ספסל בן לילה, למחרת בבוקר לשנות את הפתרון שלהם פורמלין אתנול 70%-
    הערה: הדוגמאות האלה צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך-
  6. לאחסון לטווח ארוך, להקפיא את האגרוף דם ועל אוזנו ב-80 º C. אוסף נסיוב מהדם, לאפשר את הדם מצב של קרישת חסר במשך 30 דקות ולאחר מכן centrifuge את זה. להסיר את החלק סרום באמצעות פיפטה ולאחר מכן אחסן ב-80 מעלות צלזיוס

5. ניקוי

  1. Sanitize כל הקרע כלים עם המחיקות לחיטוי. מכסה הצינורית הרצוף של איזופלוריין ספוג כרית כירורגי. החלף משטח כירורגי על לוח מוקצף עם כרית כירורגי טריים. תשליך את החלקים של העכבר לא אסף לכל המתקן ' מדיניות לרשות בעלי חיים s.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג סקירה של האזור סביבת ההפעלה, איור 2 מציג את אזור הפעולה פוסט. כאשר הגדרה זו מספקת את כמות מינימלית של ציוד, מעצבים, אנשים יכולים לבחור לשנות את זה בצורה הטובה ביותר לצרכים בודדים. הפרוטוקול צריך להיות מוטבת בהתאם לצרכים הספציפיים של הניסוי. ההליך זה מתנהל בצורה שמסיים את חייו של עכבר, הדורשים euthanization תקין9. כאשר החוקר מוכן, העכבר ימוקם תא הרדמה עם הידיות ספוג איזופלוריין (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

משמעות לגבי שיטות קיימות
בעוד אחרים קטעי וידאו לא רשמי של העכבר והניתוחים קיימים, המאמר וידאו מספק לאיכות המקצועית הראשונה, עמית שנסקרו, הדגמה ויזואלית של כל השלבים מפורט הנדרש לחילוץ קצירת בלבלב עכבר על-ידי דיסקציה10 . הקל להיות איבר הראשי עבור פעילות חילוף החומרים, אינסולין ייצור, חיתוך, קציר של הלבלב מאפשר השימור של ה הפיזיולוגיות11. על-ידי בידוד הלבלב, ניתוח עתידי יכול שיתקיים על הדגימה. הליך זה מאפשר להשוואה ולמידה של אינטראקציות בין רקמות אחרות בתו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

MAK מודה תמיכה עבור עבודה זו של מכוני הבריאות הלאומיים / מכון הסרטן הלאומי מעניק מספר - 1R15CA152985-01A1. פרויקט זה נתמך גם על ידי מיאמי באוניברסיטה לתואר ראשון מחקר פרס התוכנית, אוניברסיטת מיאמי דוקטורט-הסמכה הזדמנויות למילגות, של אוניברסיטת מיאמי מלומדים קייטנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צנצנת זכוכית קורנינג3140-150צנצנת הזכוכית ששימשה בסרטון הופסקה.  זה התחליף שלו.
מכסה צנצנת זכוכיתקורנינג9985-150מכסה צנצנת הזכוכית ששימש בסרטון הופסק.  זה התחליף שלו.
15 מ"ל צינורות פלקוןפישר סיינטיפיק339650
מספריים כירורגייםפישר סיינטיפיק9201
בקבוק לחיצה פישר סיינטיפיק03-409-10DD
100% אתנולפישר סיינטיפיק22-032-103
פורמליןפישר סיינטיפיק245-684
לוחות קצףTherapak562908
מלקחייםפישר סיינטיפיק200205SHN
1 מ"ל 21 גרם מזרקיםBD Biosciences309624
50 מ"ל צינורות פלקוןפישר סיינטיפיק339652
2.0 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה פישר סיינטיפיק02-681-258
רפידות כירורגיותפישר סיינטיפיקS67011
אורך:  2 אינץ' מוצרי חנות מתקדמיםX32T-05
מגבוני עיקורמקצועיים חד פעמיים בינלאומיים בע"מQ85084
מיכל חדפישר סיינטיפיק14-827-122
איזון אנליטימרשל סיינטיפיקME-AE200
4L דיוארטיילור-וורטון4LD
פה רחב רדוד דיוארפישר סיינטיפיקF3087-V
מתלה מיקרו-צינורות צףVWR60986-100
בקבוקון קריוגני 1.2 מ"ל, SterileFisher Scientific10-500-25
איזותזיה (איזופלורן) הנרי שיין בריאות בעלי חיים050033
חנקן נוזליהאחים רייטNIT-60-XX
עכבר זן קראסמעבדת ג'קסוןOO8179
עכבר Cre StrainMMRRCOOO435-UNC

מקורות

  1. Fesinmeyer, M. D., Austin, M. A., Li, C. I., De Roos, A. J., Bowen, D. J. Differences in Survival by Histologic Type of Pancreatic Cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 14 (7), 1766-1773 (2005).
  2. Jackson-Grusby, L. Modeling cancer in mice. Oncogene. 21 (35), 5504-5514 (2002).
  3. Heid, I., et al. Early requirement of Rac1 in a mouse model of pancreatic cancer. Gastroenterology. 141 (2), 719-730 (2011).
  4. Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer cell. 4 (6), 437-450 (2003).
  5. Shi, C., et al. KRAS2 Mutations in Human Pancreatic Acinar-Ductal Metaplastic Lesions Are Limited to Those with PanIN Implications for the Human Pancreatic Cancer Cell of Origin. Mol Cancer Res. 7 (2), 230-236 (2009).
  6. LaConti, J. J., et al. Distinct serum metabolomics profiles associated with malignant progression in the KrasG12D mouse model of pancreatic ductal adenocarcinoma. BMC Genomics. 16 (1), 1-10 (2015).
  7. Ludwig, M. R., et al. Surveying the serologic proteome in a tissue-specific kras(G12D) knockin mouse model of pancreatic cancer. Proteomics. 16 (3), 516-531 (2016).
  8. Taylor, D. K., Mook, D. M. Isoflurane Waste Anesthetic Gas Concentrations Associated with the Open-Drop Method. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 61-64 (2009).
  9. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  10. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  11. Auer, H., et al. The effects of frozen tissue storage conditions on the integrity of RNA and protein. Biotech Histochem. 89 (7), 518-528 (2014).
  12. Ma, J., Leung, L. S. Limbic System Participates in Mediating the Effects of General Anesthetics. Neuropsychopharmacology. 31, 1177-1192 (2006).
  13. Ijichi, H., et al. Aggressive pancreatic ductal adenocarcinoma in mice caused by pancreas-specific blockade of transforming growth factor-β signaling in cooperation with active Kras expression. Genes Dev. 20 (22), 3147-3160 (2006).
  14. Abiatari, I., et al. Moesin-dependent cytoskeleton remodelling is associated with an anaplastic phenotype of pancreatic cancer. J Cell Mol Med. 14 (5), 1166-1179 (2010).
  15. Goodpaster, A. M., Romick-Rosendale, L. E., Kennedy, M. A. a Statistical significance analysis of nuclear magnetic resonance-based metabonomics data. Analytical biochemistry. 401, 134-143 (2010).
  16. Yadav, D., et al. Idiopathic Tumefactive Chronic Pancreatitis: Clinical Profile, Histology, and Natural History After Resection. Clin Gastroenterol Hepatol. 1 (2), 129-135 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים