פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
כלי הדם מספקים חמצן וחומרים מזינים בכל הגוף, ויצירת רשת כלי הדם נמצאת תחת שליטה התפתחותית הדוקה. הדמיה יעילה של vivo של כלי הדם ואת כימות אמין של המורכבות שלהם הם המפתח להבנת ביולוגיה ומחלות של הרשת כלי הדם. כאן, אנו מספקים שיטה מפורטת לדמיין כלי דם עם צבע פלורסנט זמין מסחרית, פלזמה אנושית acetylated צפיפות נמוכה lipoprotein DiI מורכבים (DiI-AcLDL), וכמות המורכבות שלהם tropis Xenopus . כלי דם יכול להיות מתויג על ידי הזרקת פשוטה של DiI-AcLDL לתוך הלב פועם של העובר, וכלי הדם העובר כולו יכול להיות צילמו עוברי לחיות או קבוע. בשילוב עם הפרעות גנטיות על ידי המיקרו-זרקור הממוקד של חומצות גרעין ו / או יישום אמבט של ריאגנטים פרמקולוגיים, תפקידים של גן או של מסלול איתות על התפתחות כלי הדם יכולים להיות inveStigated בתוך שבוע מבלי להזדקק חיות מתוחכמות מהונדסים גנטית. בגלל מערכת ורידים מוגדרת היטב של קסנופוס ואת אנגיוגנזה סטריאוטיפית שלה, הנבטה של כלי קיים מראש, מורכבות כלי ניתן לכמת ביעילות לאחר ניסויים ההפרעה. זה פרוטוקול פשוט יחסית צריך לשמש כלי נגיש בקלות בתחומים מגוונים של מחקר לב וכלי דם.
מבוא
Vasculogenesis, היווצרות של כלי דם חדשים תאים אנדותל שנולדו לאחרונה, אנגיוגנזה, היווצרות של כלים חדשים מן הכלים הקיימים מראש, הם שני תהליכים שונים המעצבים את כלי הדם עובריים 1 . כל dysregulation בתהליכים אלה גורמת למחלות לב שונות וחריגות מבניות של כלי שיט. יתר על כן, הגידול קשורה לצמיחה כלי בלתי מבוקרת. ככזה, מנגנונים מולקולריים שבבסיס וסקולוגנזה ואנגיוגנזה הם נושא לחקירה אינטנסיבית 2 .
Xenopus דג הזברה הם מודלים חוליות אטרקטיבי עבור vasculogenesis ומחקרים אנגיוגנזה, מכמה סיבות. ראשית, העוברים שלהם קטנים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים עמדו בפרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת יונסי קולג 'לרפואה טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדות.
1. הכנת Xenopus tropicalis עוברים
הערה: Xenopus עוברי tropicalis הופקו כפי שתואר לעיל 10 , עם שינוי קל. Xenopus עוברי tropicalis היו מבוים על פי השולחנות של Nieuwkoop ו פבר 11 .
- אינדוקציה של הביוץ
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ציר הזמן של ניסויים (תרשימים 1 ו -2)
זמן קצר לאחר ההפריה, ממוקד microinjection יכול להתבצע כדי לווסת ביטוי גנים. לדוגמה, antisense MO אשר נקשר ספציפית קודון חניכה של mRNA Tie2 אנדוגני יכול להיות מוזרק, מעכב את התרגום של mRNA היעד Tie2 ידי מכשול סטרי. מו יכול להיות מצומדות כדי פלואורסצין עבור הקרנה חזותית קלה של עוברי מוזרק בהצלחה. לחלופין, mRNA נותב (.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול שהוצג כאן פותח לראשונה על ידי עלי H. Brivanlou ועמיתיו לחקור אירועים התפתחותיים במהלך היווצרות כלי הדם ב Xenopus laevis 4 , אבל, כפי שמוצג בכתב יד זה, זה יכול להיות מיושם על בעלי חיים קטנים אחרים. הזרקת דיו לתוך הלב הוא פשוט לבצע, ואת הרשת כלי הדם כולו יכול להיות צילמו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי פלואורסצנטי, כמו גם מיקרוסקופ confocal. אם הצבע מוזרק ללב במהלך פיתוח כלי שיט, הדינמיקה של כלי השיט ואת הסתעפות יכול להיות צילמו בזמן אמת
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה קיבל השראה מעבודתו של לוין ואח '. , אשר תיאר שיטה זו ניסיוני וסיפק תיאור מקיף של פיתוח כלי הדם ב Xenopus laevis. אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על הקלט שלהם. מחקר זה נתמך על ידי יוזמת המחקר המובילה של Yonsei University for Future of 2015 (2015-22- 0095) ותוכנית פיתוח הטכנולוגיה הביו-רפואית של הקרן הלאומית למחקר (NRF) הממומנת על ידי משרד המדע, ICT & תכנון עתידי ( NRF-2013M3A9D5072551)
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת פטרי 35 מ"מ | SPL | 10035 | מסגרת תבנית סילגארד |
| 60 מ"מ צלחת פטרי | SPL | 10060 | מגש העלאת עוברים |
| בורוסיליקט זכוכית | מכשיר סאטר | B100-50-10 | מחט להזרקה |
| BSA | Sigma | A3059-10G | מגיב ציפוי |
| CaCl2D.S.P.GR | מגיב | 0.1x MBS רכיב | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | להדמיה קונפוקלית |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | תמיסת צביעת כלי |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | לאחסון אשך |
| סיבים אופטיים תאורה | עולמית מכשירים מדויקים | Z-LITE-Z | LIGHT |
| Ficoll | Sigma | F4375 | מאגר הזרקה |
| חולץ מיקרופיפטה בוער / חום | סאטר | P-97 | חולץ מחט הזרקה |
| מלקחיים | כלי מדע עדין | 11255-20 | לבקיעת עובר ו חיתוך קצה מחט |
| זכוכית צלחת תחתונה | SPL | 100350 | להדמיה קונפוקלית |
| hCG | MNS קוריאה | לתחול של צפרדעים | |
| HEPES | Sigma | H3375 | חומר חציצה |
| חממה | . נלווה | ILP-02 | לגידול עוברים |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS רכיב |
| L15 בינוני | Gibco | 11415-114 | לאחסון אשך |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | מגיב ג'לי |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | לאחסון אשך |
| MS222 | Sigma | E10521 | אבקת הרדמה |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS רכיב |
| NaOH | Sigma | S-0899 | מגיב התאמת pH |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | מקבעים |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | מאגר להדמיית |
| נייר pH | Sigma | P4536-100EA | לאישור pH |
| PICO-ליטר מזרק | Waner מכשירים | PLI-100A | להזרקה |
| פין | Pinservice | 26002-10 | לחתך |
| מחזיק סיכה | Scitech קוריאה | 26016-12 | לחתך |
| סטריאו זום מיקרוסקופ משקפת | עולם מכשירים מדויקים | PZMIII | להקרנה חזותית |
| מיקרומניפולטור בקרה ידנית סטנדרטית | מכשירי Waner | W4 64-0056 | למיקרו-הזרקה |
| SYLGARD 184 ערכת | דאו קורנינג | להזרקת DiI | |
| העברת פיפטה | קוריאה אייס סיינטיפיק ושות'. | י.מ. B78-400 | לאיסוף ביצים ו עוברים |
מקורות
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascu....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
