Method Article

קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor

DOI:

10.3791/55659

⸱

April 17th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biotherapeutics Discovery, Immune Modulation and Biotherapeutics Discovery, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc., 2The Fu Foundation School of Engineering and Applied Science, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן פרוטוקולים לשקילה-אנטיגן הנוגדן מחייבת זיקת קינטיקה באמצעות פלטפורמות biosensor ארבע נפוצות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לייבל ללא חיישנים אופטיים הם כלים רבי עוצמה גילוי סמים לאפיון של אינטראקציות biomolecular. במחקר זה, אנו מתארים את השימוש ארבע פלטפורמות biosensor בשימוש שיגרתי במעבדה שלנו להעריך את הזיקה ואת קינטיקה המחייבות של עשרה נוגדנים חד שבטיים בעלי אפיניות (מבז) נגד סוג Kexin סבטיליזין convertase האנושי proprotein 9 (PCSK9). בעוד הן Biacore T100 ו ProteOn XPR36 נגזרים תהודת Plasmon Surface והמבוססת (SPR) טכנולוגיה, יש לשעבר ארבעה תאי זרימה המחוברים באמצעות תצורת זרימת סדרתי, ואילו המתנות האחרונות 36 נקודות תגובה במקביל באמצעות שתי וערב מאולתר 6 x 6 תצורת ערוץ microfluidic. איביס MX96 גם פועל על בסיס טכנולוגיית חיישן SPR, עם תכונת הדמיה נוספת המספקת איתור באורינטציה המרחבית. טכניקה לגילוי זה בשילוב עם Microspotter הזרימה הרציף (CFM) מרחיבה את התפוקה באופן משמעותית על ידי דוארnabling הדפסת מערך מולטיפלקס וזיהוי של 96 ספורט תגובה זמנית. לעומת זאת, אוקטט RED384 מבוסס על Interferometry BioLayer (BLI) העיקרון אופטי, עם בדיקות סיבים אופטיים מתנהגות כמו biosensor לזהות תבנית התאבכות משנה על מחייב אינטראקציות על פני שטח הקצה. בניגוד פלטפורמות מבוססות SPR, מערכת BLI אינו מסתמך על fluidics זרימה רציפה; במקום, עצות החיישן לאסוף קריאות בזמן שהם שקועים פתרונות אנליטי של microplate 384-היטב במהלך תסיסה מסלולית.

כל אחד פלטפורמות biosensor הללו יש יתרונות וחסרונות משלה. כדי לספק השוואה ישירה של היכולת המכשירים הללו כדי לספק נתונים הקינטית איכות, בפרוטוקולים המתוארים להמחיש ניסויים להשתמש באותו פורמט assay ואת ריאגנטים איכותיים באותו לאפיין קינטיקה-אנטיגן נוגדן שמתאים 1 הפשוט: מודל האינטראקציה המולקולרי 1 .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רכישת פרמטרים קינטיים אמינים לאפיון אינטראקציות נוגדנים-אנטיגן היא מרכיב חיוני בתהליך הגילוי והפיתוח של התרופה1. חיישנים ביולוגיים של תהודה פלזמונית משטחית אופטית (SPR), "תקן הזהב" לזיהוי בזמן אמת של אינטראקציות אלה, שימשו במשך כשני עשורים כדי לאפשר בחירה מוקדמת של מועמדים לנוגדנים טיפוליים העומדים בקריטריונים2,3. בנוסף למתן דירוג זיקה של מועמדים לנוגדנים על ידי סינון קשירה מהיר של סופרנטנטים גולמיים4, וקביעות קבועות קינטיות קפדניות של תכשירים מטוהרים5, חיישנים ביולוגיים יכולים להבדיל עוד יותר את הפעילות התפקודית של מועמדים מובילים באמצעות מחקרי שילוב אפיטופים6,7.

כדי לענות על הביקוש הגובר למוצרים מבוססי נוגדנים להתוויות טיפוליות שונות8, פותח בשנים האחרונות מגוון רחב של מכשירי ביו-חיישנים חדשניים המגבירים את היעילות של זיהוי ואפיון מועמדים9,10. מכשירים אלה נבדלים זה מזה בתכנון תצורת התעלה המיקרופלואידית ו/או בעקרונות האופטיים המעורבים בזיהוי אינטראקציות ביו-מולקולריות. באופן ספציפי, ה-Octet RED38411, ProteOn XPR3612, ו-IBIS MX967 הרחיבו את מספר האינטראקציות שנמדדו במחזור כריכה יחיד ל-16, 36 ו-96 בהתאמה, המייצגים שיפורים משמעותיים בתפוקה לעומת פלטפורמת Biacore המסורתית. למרות שפלטפורמות החיישנים הביולוגיות השונות הללו מספקות כולן נתונים קינטיים חיוניים לאפיון אינטראקציות נוגדנים-אנטיגן, הן נבדלות זו מזו בהגדרת הניסוי ובנהלים התפעוליים עקב שינויים בתצורות האינסטרומנטליות. לדוגמה, בפלטפורמת מערך ההדמיה SPR של IBIS MX96, שלב הקיבוע של ליגנד המולטיפלקס מבוצע במצב לא מקוון במכשיר הדפסה חיצוני נפרד מהגלאי7,13; לעומת זאת, שלוש פלטפורמות החיישנים הביולוגיות האחרות משתמשות במערך "הכל-באחד", שבו הוספת הרכיב על פני השטח של החיישן, בין אם זה מגיב ההפעלה, הליגנד או האנליט, נרשמת בזמן אמת ובאמצעות פקודות מתוכנתות מראש בסדר עוקב. ב-Octet RED384, מאפיין ייחודי של פלטפורמה מבוססת אינטרפרומטריית BioLayer (BLI) זו הוא הזמינות של חיישנים ביולוגיים של סיבים אופטיים מצופים מראש עבור <שימוש מיידי ב-"טבילה וקריאה" class='xref'>14, ומבטל את הצורך בהכנת משטח ליגנד ושלבי אתחול/מיזוג הנדרשים לעתים קרובות עבור שבבי החיישנים בפלטפורמות מבוססות SPR. העיצוב נטול הנוזלים של מכשיר זה גם מפשט את המכניקה ומונע חששות סתימה וזיהום בעת התמודדות עם דגימות גולמיות. עם העיצוב הנוזלי החדשני של 6 x 6 ב-ProteOn XPR36, ניתן ליישם גישה קינטית "חד-פעמית" על ידי החלפת ערוצי הזרימה בין כיוונים אופקיים ואנכיים ליצירת 36 נקודות אינטראקציה15. במקום להעריך קינטיקה מחייבת ריכוז ליגנד או אנליט אחד בכל פעם, כפי שנעשה בפלטפורמת Biacore T100 המסורתית של זרימה טורית, גישה זו מציעה את היכולת לנטר עד 36 אינטראקציות שונות בו זמנית במחזור כריכה יחיד.

למרות ההבדלים ביניהן, ארבע פלטפורמות החיישנים הביולוגיים הללו נמצאות כולן בשימוש נרחב על ידי מעבדות רבות ברחבי העולם. עבור משתמשים חדשים עם ניסיון מעשי מועט בחיישנים ביולוגיים, ההחלטה באיזה מכשיר להשתמש יכולה להיות משימה מאתגרת בהתחשב בהבדלים בתכנון האינסטרומנטלי. כדי לקבוע את המכשיר המתאים ביותר למטרות המחקר שלהם, יש לקחת בחשבון באופן קולקטיבי גורמים כגון איכות הנתונים, עקביות הביצועים, התפוקה, קלות התפעול וצריכת החומרים. בעוד שמספר מחקרי בנצ'מרק חקרו את השונות של קבועי קצב קינטי שהתקבלו ממספר מעבדות וביו-חיישנים5,16, מחקר השוואה ראש בראש שפורסם לאחרונה מתייחס עוד יותר לגורמים השיטתיים המשפיעים על אמינות הנתונים מנקודת מבט של ביצועים אינסטרומנטליים17,18. הפרוטוקולים המופיעים בסרטון זה מתמקדים בפירוט במערך הניסוי ובנהלים, ומלווים במאמר המחקר שכותרתו "השוואה בין פלטפורמות חיישנים ביולוגיים בהערכת קינטיקה של קשירת נוגדנים-אנטיגנים בעלי זיקה גבוהה"17. פרוטוקולים אלה נועדו לא רק לעזור למשתמשי חיישנים ביולוגיים חדשים ליישם מכשירים אלה למטרות המחקר שלהם, אלא גם לספק תובנות נוספות למשתמשי חיישנים ביולוגיים נוכחיים לגבי אתגרים טכניים ושיקולים בעיצובים ניסיוניים להערכת אינטראקציות נוגדנים-אנטיגן בעלות זיקה גבוהה.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. חלבונים ונוגדנים

  1. לייצר ולטהר את סבטיליזין convertase proprotein האנושי Kexin הסוג 9 (PCSK9) ועשר מבז אנטי PCSK9 הנגזר עכבר כפי שתואר לעיל 17.
  2. להעריך את הטוהר של המוצרים המטוהרים על ידי ברצף הזרקת 10 מיקרוגרם של כל דגימה לתוך הדרת גודל אנליטי (SEC) טור באמצעות מערכת UPLC 19.

2. מדידות קינטי ב T100 Biacore

  1. כלי והכנה מגיב
    1. לאזן את שבב חיישן CM5 בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    2. להפשיר שני 200 aliquots μL של 200 1-אתיל-3 מ"מ (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide הידרוכלוריד (EDC) ושני 200 aliquots μL של 50 מ"מ N-hydroxysuccinimide (NHS) בטמפרטורת החדר.
    3. הכן בקבוק 1-L של 1x HBS-EP (10 HEPES מ"מ [pH 7.4], 150 מ"מ NaCl, 3 מ"מ EDTA, ו 0.005% P20 polysorbate v / v) הפעלת המאגר ידי diluting פתרון המניות 10x HBS-EP + במים.
    4. הכן 1 מ"ל של חלבון / G ב 30 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב אצטט נתרן 10 מ"מ (pH 4.5) ו 500 μL של כל דגימה מב ב 0.063 מיקרוגרם / מ"ל ​​במאגר ריצה HBS-EP. להפשיר בקבוקון קפוא של PCSK9 האנושי על הקרח.
    5. בשנת תוכנת הבקרה, לחץ על "כלים | הוצא צ'יפ", למקם את שבב החיישן לתוך הנדן וקרוב. לחץ על "כלים | קבעה טמפרטורה", זן "25" מעלות צלזיוס כפי טמפרטורת הניתוח "10" מעלות צלזיוס כפי הטמפרטורה בתא.
  2. קיבוע Surface
    1. בשנת תוכנת הבקרה, לחץ על "קובץ | Open / ניו אשפית תבניות" ובחר "קיבוע" מהרשימה בלוח השמאלי.
    2. לחץ על "חדש" כדי להיכנס לחלון ההתקנה וקיבוע. בחר "CM5" כסוג השבב ובחר "1" תא זרימה למחזור.
    3. סמן את התיבה לצד זה "תא זרימה לשתק 1/2/3/4" כדי ACTIVAte האופציות. "כוון לרמה משותקת" בחר "אמין" כשיטה לכל תאי הזרימה.
    4. זן "30 מיקרוגרם / מיליליטר ProA / G" כפי ליגנד, להבטיח כי רמת היעד מוגדרת "10,000" יחידות תגובה (RU) עבור כל תאי הזרימה.
    5. בדוק "ממשלה לפני הריצה", ולחץ על "הבא". בחר "מגיב Rack 2", מגדיר את המיקום עבור ריאגנטים פיפטה לתוך צלוחיות מדגם בודדות בהתאם. הכנס את מתלה בחזרה לתוך המכשיר, ולאחר מכן לחץ על "התחל" והזן שם ניסוי כדי להינצל להתחיל בטווח.
  3. אנליטי כריכה מחזורי התחדשות
    1. לחץ על "קובץ | Open / שיטה חדשה", בחר "20140812 hu אנטי PCSK9 IgGs מחייב PCSK9 hu" ולפתוח את השיטה. סקור את הפרמטרים בשיטה.
    2. ב "Assay שלבים", להבטיח ישנם 10 מחזורים בהם "hu PCSK9" הוא השם עם "לדוגמא" הנבחר "purpOSE". מספר לשכפל מוגדר '1'.
    3. "סוגי מחזור", קבע את הזמן קשר אל "220" ים עבור לכידת 1 מעל נתיב הזרימה "2", "110" ים עבור לכידת 2 מעל נתיב הזרימה "3", ו "55" ים עבור לכידת 3 מעל נתיב הזרימה "4". קצב הזרימה הוא "10" μL / דקה עבור כל מחזורי ללכוד.
    4. בחר "לדוגמא 1", לבדוק "פתרון לדוגמא" כמשתנה. הגדר את הקשר הזמן "600" ים והזמן ניתוק כדי "2700" של מעל נתיב הזרימה "1, 2, 3, 4". קצב הזרימה מוגדר "30" μL / דקה.
    5. בחר "התחדשות 1", הזן "גליצין-HCl pH 1.5" בתחום פתרון ולהגדיר את זמן המגע כדי "20" של מעל נתיב הזרימה "1, 2, 3, 4".
    6. ב "הגדרות משתנה", הזן 2-לקפל titrating ריכוזים של "100 ננומטר - 6.25 ננומטר" עבור מחזור 1-3, "50 ננומטר - 3.12 ננומטר" עבור מחזור 4-8, ו "5 ננומטר - 0.323 ננומטר" fאו מחזור 9-10.
    7. ב "Run Setup", לבחור את נתיב זרימת זיהוי "2-1, 3-1, 4-1", לחץ על "הבא", לבדוק "ממשלה לפני הריצה", ולחץ על "הבא".
    8. בחר "לדוגמא מגיבה Rack 1", מגדיר את המיקום עבור ריאגנטים פיפטה לתוך צלוחיות מדגם בודדות בהתאם. הכנס את מתלה לתוך המכשיר, ולאחר מכן לחץ על "התחל" והזן שם ניסוי כדי להינצל להתחיל בטווח.
  4. ניתוח נתונים באמצעות BiaEvaluation
    1. לחץ "קינטיקס / זיקה | Surface מאוגד", לבחור FC "2-1", "3-1", או "4-1" בנפרד ולבדוק כל העקומות מוצגות מהריכוזים אנליטי השונים כמו גם את "אפס" ריכוז ריק.
    2. לחץ על "הבא" כדי להשיג את חסר החיץ עקום מופחת. לאחר מכן לחץ על "קינטיקס," לבחור את: דגם "1 כריכה 1", ולחץ על "התאם" כדי להשיג את parame הקינטית המצוידters.
    3. תמורת המדידות הגלובליות של משטחים מב מרובים, לחץ על "מקסימום R מרובה" בתחתית ולהוסיף העקומות מחייבות מן FCS האחר מאותה מב לרשימה.
    4. לחץ על "הבא" כדי להשיג את כל הקימורים המחייבים מופחתים הריקים חיץ. לאחר מכן לחץ על "קינטיקס," לבחור "1: 1 הכריכה" מודל, ולבחור "להתאים מקומי" לכל היותר R בפרמטרים כדי להשיג את הפרמטרים הקינטית הגלובלי המצוידים.

3. מדידות קינטי ב XPR36 ProteOn

  1. כלי והכנה מגיב
    1. לאזן שבב חיישן GLM ובקבוק 2-L של PBS-T-EDTA (PBS [pH 7.4], 0.005% Tween-20, ו 3 מ"מ EDTA) הפעלת המאגר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    2. בשנת תוכנת הבקרה, לחץ על "הוצא" ולאחר מכן להכניס את שבב GLM. כוון את טמפרטורת השבב ל "25" מעלות צלזיוס וטמפרטורת autosampler כדי "10" מעלות צלזיוס.לחץ "גליצרול אתחול" ופעל בהתאם להוראות תתבקש לאתחל את השבב.
    3. לחץ על "קובץ | פתח" פרוטוקול נפשי מראש מהרשימה, להכין פתרונות לתוך צלחת 96-היטב. לאחר מכן לחץ על "הפעלה", בחר את הפרוטוקול ולחץ על "התחל".
    4. ההפשרה אחד 1 aliquot מ"ל של 400 מ"מ EDC ואחד 1 aliquot מ"ל של 100 מ"מ N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) בטמפרטורת החדר.
    5. הכן 2 מ"ל של חלבון / G ב 60 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב אצטט נתרן 10 מ"מ (pH 4.5) ו 500 μL של כל דגימה מב ב 0.25 מיקרוגרם / מ"ל, 0.125 מיקרוגרם / מ"ל, ו- 0.063 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב PBS-T -EDTA הפעלת המאגר. להפשיר בקבוקון קפוא של PCSK9 האנושי על הקרח.
  2. קיבוע, אנליטי כריכה והתחדשות
    1. לחץ על "קובץ | חדש | ניו פרוטוקול". ב "תצורת", להזין את שם הניסוי, בחר שבב "GLM", בחר "microplates", והזן "2.2" נפח מ"ל.
    2. בחר"הפרוטוקולים | דוגמאות", מגדירים "EDC / sulfo-NHS" כמו "Activator" בבארות H1-H6, "חלבון / G" כמו "ליגנד" ב G1-G6, "Ethanolamine" כמו "Deactivator" ב F1-F6 , "גליצין" כמו "Regenerator" ב E1-E6, PBS-T-EDTA "כמו "Blank" ב D1-D6, "מדגם X מב" כמו "ליגנד" ב C1-C6, ו "PCSK9 אנושי" כמו" אנליטי בבארות H1-H6 בתוך צלחת 96-היטב שנייה.
    3. בחר "צעדים", "קיבוע" לחיצה כפולה על "עורך הפרוטוקול", הצעדים כוללים שלוש זריקות אופקיות הבאות של EDC / sulfo-NHS, חלבון A / G, ו 1 M ethanolamine כל בכל קצב זרימה של "30" μL דקות / ו זמן מגע של ים "300".
    4. לחץ "להתחדש", להזריק שלוש "18" -s פולסים של גליצין (pH 1.5) בשעה "100" μL / min הן בכיוונים אופקי ואנכי, ואחריו שני "60" -s פולסים של PBS-T-EDTA ב "25" μL / minגם בשני הכיוונים.
    5. לחץ "ליגנד", להזריק מב 1 מב 2 בכיוון האנכי באמצעות קצב זרימה של "25" μL / דקת איש קשר זמן של "160" ים.
    6. לחץ "אנליטי", להזריק חמישה ריכוזים של PCSK9 האנושי (100 ננומטר ל 6.25 ננומטר 2 דילולי סדרתי) וכרית ריקה מעל 6 ערוצים אופקיים בו זמנית, ב "40" μL / דקה עבור "600" ים של זמן עמותה אחריו על ידי "2700" של זמן ניתוק.
    7. לחץ "להתחדש", להזריק שני "18" -s פולסים של גליצין (pH 1.5) בשעה "100" μL / min בשני הכיוונים אופקי ואנכי.
    8. חזור על השלבים לעיל לאחר כל מחזור מחייב מהבז הנותר.
      הערה: בנוסף ננומטר 100 - 6.25 ננומטר סדרת ריכוז אנושי PCSK9, 25 ננומטר - 1.56 ננומטר 5 ננומטר - 0.313 ננומטר ריכוז סדרה משמשת.
    9. הכן את הדגימות ריאגנטים בשתי צלחות 96-היטב על פי עמדות ריאגנטשהוגדר בשלב 3.2.2, ולאחר מכן לחץ על הכרטיסייה "Run", לבחור את ניסוי הפרוטוקול / ולחץ על "התחל".
  3. ניתוח נתונים באמצעות מנהל ProteOn
    1. לחץ "לוח סוג" ובחר "אנליטי". לאחר מכן לחץ על "שלב פרוטוקול" ובחר את כל הקימורים מחייבים ברשימה.
    2. לחץ "תהליך אוטומטי", ולחץ על "תהליך | הפניית ערוץ | Interspot". לאחר מכן לחץ על "תהליך | הפניה זוגית | שורה | A6".
    3. לחץ על "צור מערך נתונים" כדי לחסוך מערכי נתונים נפרדים עבור כל מב בכלל שלושה משטחים לניתוח קינטית.
    4. לחץ "ניתוח בסיס נתונים", להדגיש כל מערך נתונים מב ולחץ על "ניתוח | קינטי". בחר מודל "לנגמיואיר" ו "ka / KD סימולטני" ולחץ על "הבא".
    5. להדגיש את העמותה ואת טווח ניתוק בכושר, לבחור מקסימום R "מקומי", ולחץ על "הבא" כדי לבצע את ההתאמה להשיגהפרמטרים הקינטית המצוידים.
    6. חזור על השלב שלעיל, אך בחר מקסימום R "מקובצת" תמורת המדידות להשיג את ערכי מקסימום R ניסיוני לחישוב פעילות המשטח ליגנד.

4. מדידות קינטי של השמינייה RED384

  1. מגיב הכנת פלייט לדוגמא
    1. הכן 50 מ"ל של 1x KB (Buffer קינטי המכיל PBS pH [7.4], 0.02% Tween-20, 0.1% אלבומין, ו אזיד הנתרן 0.05%) על ידי דילול פתרון המניות 10x ב PBS.
    2. מחלקים את KB 1x לתוך צלחת 96-היטב על 200 μL לכל טוב. טיפים biosensor אנטי אנושי מימה 48 ללכוד (AHC) בבארות בודדים אלה עבור דק '10 לפחות.
    3. הכן מדגם מב ב 20 מיקרוגרם / מ"ל, 10 מיקרוגרם / מ"ל, ו 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב 1x KB, כמו גם PCSK9 האנושי ב 7 ריכוזים טיטרציה מ 100 ננומטר עד 1.56 ננומטר 2 דילולים סדרתי.
    4. טען את דגימות מב לתוך microplate מוטה-קרקעית 384-היטב (Referred בתור צלחת מגיב) ואת הפתרונות PCSK9 האדם לתוך אחר microplate 384-היטב (המכונה פלייט לדוגמא) בשעה 90 μL לכל טוב.
    5. סדרת טען של 1x KB גליצין (pH 1.5) פתרונות בבארות בתוך פלייט לדוגמא.
      הערה: בארות KB 1x אלה משמשות נפשיים מראש שבב, ייצוב בסיס, לבין ניתוק אנליטי. פתרון גליצין משמש התחדשות.
  2. הגדרת שיטת הניסוי
    1. בשנת תוכנת רכישת נתונים, לחץ על "ניסוי | אשף ניסוי חדש | ניסוי קינטיקס חדש | קינטיקס בסיסי".
    2. ב "פלייט Definition", בצע את השלבים הבאים כדי להגדיר את סוגי מדגם ועמדות.
      1. בחר ערוצים "16" ו "384-היטב" פורמט.
      2. הגדר את מיקומי המדגם ריאגנט בתצוגת הצלחת על ידי החזקת מקש Shift בעת הלחיצה שמאלה ליד הבאר כדי להדגיש 16 בארות בכל פעם.
      3. קליק ימני עלבארות המכילות דגימות מב ובחר "טען" כדי לסמל את השלב שבו מבז נטען (או נתפס) על חיישני AHC. הזן את שמות מב וריכוזי בטבלה בצד ימין.
      4. קליק ימני על הבארות המכילות את PCSK9 האנושית ובחר "דוגמא" כדי לציין את הצעד שבו החיישנים-שנתפסו מב הם טבלו ואת האינטראקציות המחייבות נמדדות. הזן את ריכוז הטוחנת המתאים בטבלה בצד ימין.
      5. הגדר את הבארות המכילות 1x KB כמו "חוצץ" או "נטרול", ואת הבארות המכילות גליצין כמו "התחדשות".
    3. ב "הגדרת Assay", בצע את השלבים הבאים כדי להגדיר את הגדרת הניסוי:
      1. לחץ על "הוסף" ובחר "Baseline", "התחדשות", "איזון", "טוען", "אגודה", ו "דיסוציאציה" צעדים לרשימה עם זמנים של ים "30", "30" s, "18" של "200" של "500" ים, ו "1800" של, בהתאמה. מהירות שייק היא "1000" סל"ד.
      2. כדי להוסיף את הצעדים כדי "Assay שלבי רשימה", תחילה לחץ על צעד, ואז ללחוץ על הבארות ממוקמות בשני המדגם או צלחת המגיב. השלבים הם כדלקמן:
        1. איזון-התחדשות: תנאי מוקדם חיישני AHC ידי שלושה מחזורים של -s מטבלים "15" ב גליצין (pH 1.5), לסירוגין עם "15" -s מטבלים 1x KB.
        2. טוען: ללכוד את הדגימות מב על חיישני AHC עבור ים "200".
        3. Baseline: להקים את אות BLI עבור ים "60" לפני צעד העמותה.
        4. אגודה: לטבול החיישנים לתוך בארות המכילות ריכוזים שונים של PCSK9 האנושית לתקופת "500" עמותה -s.
        5. דיסוציאציה: לטבול החיישנים נכנסים PCSK9 לתוך בארות חדשות של 1x KB לתקופת דיסוציאציה "1800" -s.
        6. התחדשות: טובלים את מב-PCSK9 Bound חיישנים לתוך בארות של גליצין (pH 1.5) עם שני "18" -s פולסים בין כל מחזור מחייב.
    4. ב "ניסויים סקירה", להחליק לאורך השלבים ולבצע שינויים במידת הצורך על ידי חזרה אל הכרטיסיות הקודמות.
    5. ב "להריץ ניסויים", להזין "60" של עיכוב זמן ולנער את צלחת המדגם בזמן ההמתנה. כוון את טמפרטורת הצלחת כדי "25" מעלות צלזיוס ולחץ על "GO".
  3. ניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים של ForteBio
    1. לחץ "בחירת נתונים | טעון נתונים | קינטיקס | נוגדנים PCSK9 מחייב PCSK9 7.23.14"
    2. ב "עיבוד", לעבד את הנתונים כדלקמן:
      1. בשלב 1: לחץ על "בחירת חיישן" כדי להדגיש חיישני H1-H6, קליק ימני על אותם ולחץ על "סוג חיישן שינוי | הפנית חיישן."
      2. בשלב 2, לבדוק "חיסור" ובחר "חיישני הפניה ממוצעים"; כדי לחסר כל חיישן מדגם פעיל מן הממוצע של חיישני חיץ 6 ריק.
      3. בשלב 3, לחץ על "יישור ציר Y" ובחר "Baseline" ליישר כל העקומות מחייבות לשלב בסיס לפני העמותה.
      4. בשלב 5, לבדוק "סביצקי-Golay סינון" להחליק את העקומות מחייבות ידי הגדלת יחס אות לרעש, ולחץ "לעבד נתונים!".
      5. בשלב 6, לחץ על "תוצאות מעובד" כדי להציג את עקומות מחייב מעובד.
      6. בשלב 7, לסקור את הארבעה לוחות מימין מוצג עקומים מחייב לאחר כל שלב עיבוד, ולחץ על "שמור נתונים מעובדים".
    3. ב "ניתוח", לבדוק "האגודה ודיסוציאציה" ובחרו: מודל "1 1".
    4. סמן את העקומות המחייבות עבור "גלובל (מלא)" בכושר לקבץ אותם לפי "צבע". השתמש "מקס R המקושר" כדי לבצע את הקבוצה הולמת על חיישנים צופה באותו מריכוז Ab להשיג את ערכי מקסימום R ניסיוני לחישוב פעילות המשטח ליגנד, ו "R מקסימום צמוד על פי חיישן" כדי לבצע התאמה הגלובלית על חיישנים מצופים ריכוזי מב מרובים.
    5. לחץ "Curves Fit" כדי להשיג את פרמטרי קינטיקה המצוידים. שמור את התוצאות בסוף כל ניתוח מתאים.

5. מדידות קינטי ב MX96 IBIS

  1. כלי והכנה מגיב
    1. לאזן שבב COOH-G בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    2. הכן בקבוק 1-L של חיץ ריצה של מערכת (PBS [pH 7.4], 0.01% Tween-20) ואת חיץ וקיבוע (אצטט נתרן 10 מ"מ [pH 5.0], 0.01% Tween-20).
    3. הכן לכל מב מ 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ל 0.16 מיקרוגרם / מ"ל ​​ידי דילולים סדרתי 2-לקפל בשני למאגר פועל המערכת ואת אצטט נתרן (5.0 pH) חיץ וקיבוע.
    4. מחלק את הדגימות מב לשתי ספטמברarate היטב 96 צלחות שבו כל מב תופסת 8 בארות אנכיות בריכוזי טיטרציה ב 200 μL לכל טוב.
    5. aliquots ההפשרה של 400 מ"מ EDC ו 100 מ"מ sulfo-NHS בטמפרטורת החדר.
    6. הכן 300 μL של חלבון / G ב 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של נתרן אצטט (pH 5.0) חיץ וקיבוע פיפטה אותו לתוך בקבוקון.
    7. כן 200 μL של PCSK9 אדם מן 100 ננומטר ל 0.39 ננומטר ידי דילולים סדרו 2-לקפל במערכת הפעלת מאגר. פיפטה אותם לתוך צלוחיות נפרדות.
  2. קינטיקה Multi-מחזור עם מערכי נוגדן מצמידים אמינים
    1. מערבבים את EDC / sulfo-NHS (400 מ"מ / 100 מ"מ) aliquots ולחלק את התערובת לתוך 48 בארות גבי צלחת 96-היטב החדש 200 μL לכל טוב.
    2. מניחים את צלחת מקור מב (מדולל אצטט נתרן [pH 5.0]) במצב 2 ו צלחת מגיב EDC / sulfo-NHS בעמדה 1 בתוך המדפסת.
    3. התקן את שבב חיישן לתוך CFM. פתח את "2.0 CFM" softwarדואר, ולאחר מכן לחץ על "טען הגדרות | 96 אמין זוג". 10 x 8 מערך הנוגדן נוצר כדלקמן:
      1. לספק את EDC / sulfo-NHS במחצית העליונה של צלחת מגיב לחיישן באמצעות 48 microchannels, ואת מחזור אותם מעל פני החיישן עבור דקות "5".
      2. למסור את הדגימות מב במחצית העליונה של צלחת המקור לחיישן ואת המחזור אותם על פני המשטחים מופעלים על דק "10".
      3. לספק את החיץ וקיבוע מן צינור חרוטי 50 מ"ל מעל פני השטח נוגדן עבור דקות "5".
      4. חזור על התהליך המתואר לעיל עבור דגימות מב שנותרו בחצי התחתון של צלחת מקור.
    4. עגן את שבב חיישן המודפס לתוך המכשיר. בשנת תוכנת הבקרה, לחץ על "קובץ | Connect | מדידת Open | מדידה קיימת" ובחר "2014/08/15".
    5. בתיקים "כללי", בחר "G - מערכת ראש" תחת "תסריט מערכת מלא". לאחר מכן בחר "G - QuEncח" כדי לבטל את המשטחים מב ידי הזרקת 150 μL 1 M ethanolamine.
    6. לחץ "מצלמה" כדי להמחיש את מערכי מב ולהתאים את הניגוד במידת הצורך. מקם את תיבות כיכר האדומות כדי להקיף את הנקודות מב, ולהעביר את התיבות מרובעות הירוקות אל interspots הממוקם בין כתמי מב הפעילים בגין התייחסות.
    7. ב "מחזור הניתוח", בחר "A - הפעלה הרגילה AP" תחת "סקריפטים IBIS". גדר 1.0 דק 'לטובת עקרונות בסיס, 10.0 דקות עבור עמותה, ו 90 צעדים עבור ניתוק ב 8 מהירויות של μL /.
    8. בתוך "מחזורים", להזריק PCSK9 האנושי ריכוז אחד בכל פעם הבאה חמש זריקות חיץ. מחדש את המשטחים מב עם גליצין pH 2.0 בין כל מחזור מחייב.
  3. קינטיקה Single-מחזור עם מערכי נוגדן-שנתפס Fc
    1. התקן שבב חיישן חדש לתוך CFM. חזור על שלבים 5.2.3 עד 5.2.5 לעיל על ידי החלפת דגימות מב עם חלבון A / G.
    2. הסר אתשבב חיישן מן MX96 ולהכניס אותו בחזרה לתוך המדפסת CFM.
    3. לספק את מבז במחצית העליונה של הצלחת אל פני שטח חיישן החלבון A / G באמצעות 48 microchannels, ואת מחזור אותם על פני השטח באמצעות זרימה דו כיוונית עבור 10 דקות.
    4. חזור על השלב הנ"ל עבור הדגימות מב שנותרו בחצי התחתון של הצלחת.
    5. עגן את שבב חיישן המודפס לתוך מכשיר MX96. בתוכנה הקליטה הנתונים, לחץ על "קובץ | Connect | מדידת Open | מדידה קיימת | בא" ובחר "חלבון A + G מחייב kinetic7.30.14".
    6. לחץ "המצלמה" כדי להמחיש את מערכי מב ולהתאים את הניגוד במידת הצורך. מקם את תיבות כיכר האדומות כדי להקיף את הנקודות מב, ולהעביר את התיבות מרובעות הירוקות אל interspots הממוקם בין כתמי מב הפעילים בגין התייחסות.
    7. ב "מחזור הניתוח", בחר "A - הפעלה הרגילה AP" תחת "סקריפטים IBIS". הגדר "1.0 דקות" לטובת עקרונות הבסיס, "10.0דקות" עבור עמותה, ו '10' צעדים דיסוציאציה ב '8 μL / sec' מהירות.
    8. בתוך "מחזורים", להזריק PCSK9 האנושי ריכוז אחד בכל פעם הבאה חמש זריקות חיץ. אין התחדשות מתבצעת בין כל הזרקה אנליטי.
  4. ניתוח נתונים באמצעות ספרינט ו Scrubber
    1. בשנות ה תכנה SprintX, לחץ על "קובץ | קובץ משולש פתוח", לבחור את כל זריקות מדגם ברשימה, ולבדוק "קובץ שמור SprintX," "כיול", ו "נחישות RLL" לפני לחיצה על "נתח".
      הערה: ערכי RLL מתייחסים לרמות מב המשותקות / שנתפסו על פני החיישן.
    2. בדוק "הפניה" ובחר "מקומי" כדי להשתמש כתמי התייחסות הסמוכים. כמו כן לבדוק "יישר" על הזריקה הראשונה ולאחר מכן לחץ על "התחל אוטומציה."
    3. בלשונית הסידורית, בחר "צג סרגלים בסרגל הכלים," להתאים אותםכדי לבחור אזור קטן של הבסיס מייד לפני הזרקת המדגם הראשונה, ובחר "אפס."
    4. יצירת קובץ .IBMX לניתוח בבית Scrubber ידי בחירת "ייצא ibmx קובץ" ולאחר מכן לחץ "התחל אוטומציה."
    5. השקת Scrubber וטען את הקובץ .IBMX. הזן "100N" כמו "קונצרט כלשהו מניות" ו- "2" "גורם דילול".
    6. נתונים יבול, להסיר את כל הבסיס לפני תחילת הזרקה, וליישר את העקומות מחייבות בתחילת העמותה.
      הערה: עבור ניסוי קינטיקה חד מחזור, לא ליישר את העקומות.
    7. לכו ללשונית "קינטיקס", להתאים את השליט בפעם סוף זריקה, בחר "k ד" ובכושר, אז "לתקן k ד." בחר "K a k ד" ו להתאים אותו שוב.
    8. Float בעמודה d k ולהשתלב שוב כדי לחדד את ההתאמה נוספת.
      הערה: תמורת המדידות של עקומות מחייב חד מחזור, לחץ על "בוחר" ובטל "פחת," ולאחר מכן בחר "פרד" לצוף בעמודה "בגין inj" כדי להתאים את פרופילי העמותה חזרה ממוצא בסיס תיאורטי.
    9. סקור את פרמטרי קינטיקה המצוידים בלשונית התוצאות.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מציג את תמונת מערך נוגדנים מן CFM ואת רמות מב זוהו ע"י שתי שיטות הקיבוע, ואיור 2 מראה את sensorgrams מחייב המקביל שנוצר MX96 מן-מחזור הרב הקינטית מדידות הקינטית חד המחזור על מערכים מב אלה . זמן האמת מחייב עקומות מצוידות kinetically ממשטחים נוגדנים מצופים מרובים שנוצרו פלטפורמות biosensor הארבע מוצג איורי 3 - 6. איור 7 מציג ההשוואה בין שיעורי הקינטית הסופיים והקבועים מחייב איזון שהתקבלו מהניתוח הגלובלי של עקומות המחייבות אלה. עמותת הפרט (k א), דיסוציאציה (K ד), ועל שיווי המשקל (K D) הקבועים מחייב מוצגים בטבלת 1. כדי להדגים את ההשתנות של מערכי נתונים שנוצרו בתוך אותו המכשיר, של k, k ד, ו K D בצפיפויות משטח מב שונים, ואיור 9 עוד משווה את הפעילויות מחייבות המחושבות של המשטחים מב ברחבי פלטפורמות biosensor.

figure-results-1
איור 1. Multiplex ליגנד מערכים של אמין מצמידים (א) ו- FC-בשבי (B) משטחי נוגדני הדפסת CFM ב MX96 IBIS. תמונות של המערכים המודפסים מוצגות לוחות השמאל, שבו השטחים האפורים מוקפים ריבועים אדומים מצביעים על הנוכחות של נוגדנים. Interspots הכהה הממוקם בין כתמי נוגדן הפעילים משמש חיסור הפניה. כל עמודה מכילה נוגדן מודפס על ריכוזי טיטרציה שמופיעות למטה ולצד שמאל של התמונה. הסכומים של הנוגדנים מודפסים לכמת על ידי חישוב difference במשמרות בתפזורת בין המקומות הפעילים ועיון מוצג הלוחות התקינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
השוואת איור 2. בזמן אמת כריכה Sensorgrams מן מולטי-מחזור (א) ו- Single-מחזור (B) ניסויים קינטי ב MX96 IBIS. הזריקות הרציפות של PCSK9 האדם להגדיל ריכוזים ברחבי 10 x 8 מערכי נוגדן מצוינות מעל כל קטע sensorgram מקביל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
עליונים), בינוני (לוחות ביניים), ובצפיפות נמוך (לוחות למטה) משטחים בצפיפות. הקווים השחורים החלקים המעולפים מייצגים את ההתאמה הקינטית של אותות התגובה מחייבים בריכוזי PCSK9 אדם שונים (קווים צבעוניים) עד 1: מודל אינטראקציה 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 4. כריכה Sensorgrams של נוגדנים שנתפסו אינטראקציה עם PCSK9 אנוש 1: 1 קינטי דגם Fit שכבות של ProteOn XPR36. האינטראקציות מוערכות מעל גבוהה (לוחות עליונים), Medium- (לוחות הביניים), ובצפיפות נמוכה (לוחות למטה) משטחים בצפיפות. הקווים השחורים החלקים המעולפים מייצגים את ההתאמה הקינטית של אותות התגובה מחייבים בריכוזי PCSK9 אדם שונים (קווים צבעוניים) עד 1: מודל אינטראקציה 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5
איור 5. כריכה Sensorgrams של נוגדנים שנתפסו אינטראקציה עם PCSK9 אנוש 1: 1 קינטי דגם Fit שכבות של שמיניית RED384. האינטראקציות מוערכות מעל גבוהה (לוחות עליונים), בינוני (לוחות ביניים), ובצפיפות נמוך (לוחות למטה) משטחים בצפיפות. הקווים האדומים המעולפים מייצגים את ההתאמה הקינטית של אותות התגובה מחייבים בריכוזי PCSK9 אדם שונים (קווים צבעוניים) עד 1: מודל האינטראקציה 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-6
איור 6. כריכה Sensorgrams של האמין מצמידים (א) ו- FC-בשבי (B) נוגדנים אינטראקציה עם PCSK9 אנוש 1: 1 קינטי דגם Fit שכבות של MX96 IBIS. הפרופילים המחייבים מאורגנים כמו 10 x 8 לוחות באים במפת צלחת מערך באיור 1. הקווים השחורים מייצגים את האותות בתגובה המחייבים רשמו בריכוזי PCSK9 אדם שונים, ואת הקווים האדומים המעולפים לייצג את העקומות המצוידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7" src = "/ files / ftp_upload / 55,659 / 55659fig7.jpg" />
איור 7. השוואת איגוד k א (א), ד יא דיסוציאציה (B), ואת שיווי משקל K D (C) קבועים עקידת שנוצר על ידי פלטפורמות biosensor ארבע. הפרמטרים הקינטית נגזרים ניתוח הגלובלי של העקומות מחייבות איורים 3 - 6. המכשירים מיוצגים כלהלן: Biacore T100 (כחול), ProteOn XPR36 (ירוק), אוקטט RED384 (אדום), IBIS MX96, אמין מצמידים (סגול), ו IBIS MX96, FC-בשבי (כתום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-7
השוואת איור 8. של העקביות של קבועי קצב קינטי במהלך צפיפות Surface נוגדן מרובה BIAC עפרות T100 (א), ProteOn XPR36 (B), אוקטט RED384 (C), IBIS MX96, מצמידים-אמין (D), ואת IBIS MX96, FC-בשבי (E). הפרמטרים הקינטית k A (לוחות-משנה עליון), k ד (לוחות-משנה באמצע), ו- K D (לוחות-תת קרקעיים) נגזרים מניתוח הקבוצה ב צפיפות משטח נוגדן פרט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-8
איור 9. פעילויות עקידת משטחי הנוגדן וסטיות תקן שלהם (ברי שגיאה) בפלטפורמות biosensor ארבע. הערכים מחושבים באמצעות משוואות המתוארות במאמרי המחקר 17.large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

k a k d K D
(M -1 s -1) (ים -1) (ננומטר)
מב 1 11.7 (7.8) x 10 5 4.89 (4.18) x 10 -5 0.052 (0.05)
מב 2 1.53 (0.28) x 10 5 1.30 (1.54) x 10 -5 0.092 (0.12)
מב 3 11.4 (8.3) x 10 5 27.6 (11.0) x 10 -5 0.333 (0.20)
מב 4 3.61 (1.6) x 10 5 20.1 (12.3) x 10 -5 0.659 (0.54)
מב 5 0.59 (0.21) x 10 5 3.46 (2.50) x 10 -5 0.663 (0.46)
מב 6 1.19 (0.78) x 10 5 7.21 (3.83) x 10 -5 0.894 (0.64)
מב 7 1.29 (0.53) x 10 5 16.4 (5.63) x 10 -5 1.57 (1.02)
מב 8 4.02 (2.23) x 10 5 22.8 (10.7) x 10 -5 0.768 (0.68)
מב 9 4.20 (2.13) x 10 5 6.67 (4.3) x 10 -5 0.197 (0.16)
מב 10 1.20 (0.49) x 10 5 12.5 (7.64) x 10 -5 1.27 (0.80)

טבלת 1: Kinetic מחירים ואוזן כריכה קבוע של 10 מבז מתקבל על ידי התאמת גלובל של Curves כריכה מתוך ארבעה biosensor מכשירים ל 1: מודל האינטראקציה 1.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראש-בראש מחקר ההשוואה שלנו מראה כי כל אחת מפלטפורמות biosensor יש עוצמות וחולשות משלו. למרות הפרופילים המחייבים של הנוגדנים דומים ידי השוואה ויזואלית (איורים 3 - 6), ואת סדר הדירוג של קבועי קצב הקינטית רכש הם מאוד עקביים המכשירים (איור 7), התוצאות שלנו מראות כי SPR מבוססים מכשירים עם fluidics זרימה הרציף) טוב יותר בפתרון אינטראקציות זיקה גבוהה עם שיעורי ניתוק איטיים. להיסחף כלפי מעלה במהלך שלב הניתוק הוא ציין מערכי נתונים (למשל, מב 2, מב 5, ו מב 9; איור 5) שנוצר על ידי מכשיר fluidics ללא BLI. ממצא זה ניתן לייחס במידה רבה אידוי מדגם לאורך זמן microplate, שהינה מגבלה עיקרית של המערכת. עם ההגבלה הטבועה הזו, בפעם ניסיון גם מוגבלת פחות מ 12 h; ולכן הניסויים תוכנתו עם shפעמי orter (עמותה של 500 ו 30 ניתוק דקות) בהשוואה לאלו של פלטפורמות האחרות (עמותת 10 דקות ו 45 ניתוק דקות). עם זאת, קיצור זמן הניסוי לא הופיע כדי להקטין את ההשפעה של אידוי על נתוני איכות / עקביות, כמו קבועי קצב שנוצר על ידי מכשיר המבוסס BLI להראות פחות ליניאריות כתוצאה מתנודות חלק מחוץ שיעורי (איור 8C ). בנוסף אידוי מדגם, ההבדלים ריאגנטים הלכיד בשימוש אולי תרמו גם להבדלים בתוצאות שהתקבלו. בעוד חלבון A / G שמש בכל שלוש פלטפורמות SPR מבוסס fluidics, חיישני AHC שמשו פלטפורמת BLI הלא fluidics. מאז חלבון A / G הוא עלול להיות בעל זיקה חלשה עבור מהבז מ עושה AHC, משטח biosensor מבוסס נוגדנים, אשראי החוץ-השיעורים במתחם מב-אנטיגן מן משטחי החלבון A / G עשויה להופיע מהר מלאכותית מאלה המתקבל משטח AHC. אפשרות זו נתמכת בy נתוני הניסוי מראים כי הערכים מחוץ השיעור שנוצרו על ידי פלטפורמת BLI היו נמוכים באופן עקבי מאלה המתקבלים מכשירים האחרים (איור 7, קו אדום). אף על פי כן, הפלטפורמה BLI יש יתרונות שונים על פני פלטפורמות אחרות. לדוגמא, הוא גמיש מאוד לגבי בחירת חיישן ותצורת assay בשל החיישנים טרום מצופה השונים לשימוש מיידי. בניסויים שלנו, שימוש בחיישני AHC בטל את הצורך בצעדים וקיבוע ליגנד, צמצום זמן ההכנה. יתר על כן, פלטפורמת BLI דורשת הרבה פחות תחזוקה לעומת פלטפורמות SPR fluidics האחרות, הכוללות תצורות מתג צינורות וערך מסובכות. תכונה זו מהווה יתרון עבור ניסויים הכוללים דגימות גולמיות שיכול לגרום לבעיות סתימה וזיהום.

ככל שהביקוש זיהוי יעיל, מהיר, מדויק של עליות מועמדים טיפולית, את הצורך דותפוקת osensor גם עולה. בין ארבע פלטפורמות biosensor, התפוקה מן biosensor מסוגל 96-ליגנד הדפסת מערך הוא הגבוה ביותר, ואחריו biosensor מצמיד לתבנית 36-ליגנד מזגזגי biosensor המבוסס BLI עם הודעה סימולטני ערוץ 16, אשר בסופו של דבר להגדיל מספר האינטראקציות נמדדו מחזור מחייב יחיד 96, 36 ו 16, בהתאמה. ותפוקה אלה גבוהות משמעותיים מזה של פלטפורמת SPR המסורתית, אשר מוגבלת על ידי בעל תאי זרימה ארבע בלבד מחוברים באמצעות זרימת סדרה יחידה. מאז הניסויים שלנו מעורב סט מדגם קטן יחסית של 10 מבזים העריכו בצפיפויות משטח מרובות עם פעמי ניתוק ארוכות, throughputs אינסטרומנטלי שחק תפקיד מתון בקביעת היעילות של הניסויים. לא היו הבדלים משמעותיים פעמים הניסיוניות של השלוש פלטפורמות תפוקה גבוהה, ובכל מקרי הניסויים הושלמו ביום אחד. מצד השני, ניסויי SPR זרימת סדרתי המסורתיים נדרשים 3 ימים כדי להשלים, למרות אוטומצית הליכה משם רכישת נתונים לאחר התקנה. במחקרים אחרים הכרוכים מספר רב של דגימות (כלומר במאות או אלפי), עבור בדירוג מחוץ שיעור / הקינטית למטרות הקרנה או אפיטופ binning, התפוקה הופכת לגורם קריטי.

למרות התפוקה ב MX96 IBIS היא סדר הגודל גבוהה יותר מזה של החיישנים הביולוגיים האחרים ולכן הוא בחירה אופטימלית עבור מטרות אלה, יש לו כמה חסרונות. בפרט, הדפסת המערך ידי CFM מציגה סתירות משטח גדולות (איור 1) ואת שחזור נתונים מופחת (איור 8D ו 8E). עבור מדידות הקינטית מדויקות, בסכום של ליגנד על פני שטח biosensor הוא פרמטר קריטי כי צריך להיות מבוקרים על מנת להבטיח כי התגובות המחייבות אינן מוטרדות גורמים משניים כגוןהעברה או הפרעה סטרית המונית. עבור Biacore T100 ו ProteOn XPR36, רמות L R האופטימלי נקבעו בהתבסס על חישוב התקן של ערכי מקסימום R הסט כמתואר במאמר המחקר 17. מצד שני, עבור פלטפורמות אוקטט RED384 ו IBIS MX96, רמות ללכוד מב הושגו באופן אמפירי באמצעות סדרה של 2 פי בדילול נוגדנים סדרתי בזמנים קבועים. חוסר ידע או שליטה של הצעד ללכוד הביא משטח בצפיפות גבוהה אותות תגובה מחייבים גבוהים (איור 2) שאולי נפגעת הדיוק של קבועי קצב הקינטית. יתר על כן, ההפרדה של המדפסת ממגלה SPR אתגר גם בעת ביצוע מדידות מחזור מחייב מספר מעורבים regenerations. הדרך היחידה לבצע את התקנת קינטיקה רב מחזור הייתה דרך צימוד אמין ישיר של מבז, להבדיל ללכוד דרך Fc מב ידי חלבון המשותק / Gשטח של פלטפורמות biosensor השלוש אחרים. כתוצאה מכך, ניסוי צופיות התחדשות נוסף נדרש לקבוע את תנאי התחדשות האופטימליים. התוצאה של התקנה זו נמצאה קשורה% ~ 90 פעילות שטח נצפה נמוכות לעומת השיטה ללכוד FC (איור 9), בנוסף לזמן הניסיון כבר. כדי לבצע את השיטה ללכוד FC, גישה הקינטית חלופה חד מחזור אומץ. גישה זו כוללת הזרקה הרציפה של אנליטי להגדיל ריכוזים ללא התחדשות בין כל הזרקה (איור 2). גישה נוחה מאוד זה, אבל פחות מיושם בדרך כלל לא רק קיצרו את זמן הניסוי והפחתה של צריכת מגיב, אלא גם הפיק קבועי קצב הקינטית מאוד דומים לאלה של חיישנים ביולוגיים אחרים (איור 7). לכן, החלת גישת קינטיקה חד מחזור זה מתגבר על מגבלת התצורה גלומה במכשיר ומציגהזדמנות להשגת קבועי קצב הקינטית ברזולוציה גבוהה באופן תפוקה גבוהה.

למרות התפוקה להיות מגבלה עיקרית של Biacore T100, התוצאות שלנו קולקטיביות להראות כי היא הצמיחה את הנתונים העקביים ביותר עם האיכות הגבוהה ביותר. זה היה ואחריו ProteOn XPR36, אשר יש ~ 10 של פי תפוקה גבוהה יותר. יכולתי ליצור נתונים איכותיים הופך יתרון כאשר מאפיינים אינטראקציות גבוהה זיקה-אנטיגן נוגדן שיכול להיות מאתגר מבחינה טכנית כאשר מגבלות זיהוי המכשירים הם הגיעו. בעוד המגבלות השיטתיות מכשור של RED384 אוקטט לעכב מדידה המדויקת של קבועי קצב דיסוציאציה (כלומר, נפילה קצרה של הרגישות לפתור ריקבון אות מספיק איטי מחוץ שיעורים), הן Biacore T100 ו ProteOn XPR36 יכול לספק רגישות ואמינה איתור לבידול.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עמלות פרסום עבור וידאו-במאמר זה שולמו על ידי Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים נח כנ"ל ואדם מיילס לקבלת סיוע טכני על MX96 IBIS.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מערכת Biacore T100Healthcare28975001מערכת T100 שודרגה לשבב חיישן T200
CM5 GE HealthcareBR100012
BIAevaluation GE Healthcareגרסה 4.1
Biacore T100 תוכנת בקרהGE Healthcareתוכנת הבקרה T100 שודרגה לערכת צימוד אמין T200
GE HealthcareBR100050 הוא מכיל: 750 מ"ג 1-אתיל-3-(3-דימתיל-אמינופרופיל) קרבודימיד הידרוכלוריד (EDC), 115 מ"ג N-הידרוקסיסוקסימיד (NHS), 10.5 מ"ל 1.0 מ"ל אתנולמין-הידרוכלוריד pH 8.5 
מאגר HBS-EP+ 10 פעמים;GE HealthcareBR100669פתרון מלאי מרוכז 
בקבוקוני פלסטיק, 7 מ"מGE HealthcareBR100212 
מכסי גומי, סוג 3HealthcareBR100502
בקבוקונים וכובעים מפלסטיק, 11 מ"מGE HealthcareBR100214 
ProteOn XPR36 מערכת מערך אינטראקציה עם חלבוניםBio-Rad1760100
ProteOn Manager תוכנה Bio-Rad1760200גרסה 3.1.0.6
שבב חיישן GLMאמין Bio-Rad1765012
Bio-Rad1762410הוא כולל EDAC (EDC), סולפו-NHS, אתנולאמין HCl 
ערכת התחדשות ומיזוג ומאגריםBio-Rad1762210הוא כולל 1 מכל מאגר גליצין (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), ו-NaOH, SDS, HCl, חומצה זרחתית, NaCl; 50 מ"ל כל תמיסה 
2 ליטר PBS/Tween/EDTA מאגרBio-Rad1762730הוא כולל תמיסת מלח חוצצת הוספט (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 מ"מ EDTA 
Octet RED384 SystemForté
תוכנת ניתוח נתוניםForté גרסת ביו 9.0.0.4
טבילה וקריאה של חיישנים ביולוגיים נגד hIgG Fc לכידת (AHC)Forté ביו18-5060מגש אחד של 96 חיישנים ביולוגיים 
384 צלחת תחתונה מוטה היטב Forté Bio18-5080
מתקן חיישנים ביולוגייםForté Bio18-5016
Kinetics Buffer 10xForté ביו18-1092ריכוז פי 10. מכיל ProClin 300. 
IBIS MX96 SPRi SystemWasatch Microfluidics
Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) מדפסתWasatch Microfluidicsגרסה 2.0
שבב SensEye COOH-GWasatch Microfluidics1-09-04-004
תוכנת ניתוח נתוניםWasatch Microfluidicsגרסה 6.19.3.17
תוכנתניתוח נתונים SPRintWasatch Microfluidicsגרסה 6.15.2.1
מקרצף 2תוכנתגרסה 2
פירס חלבון רקומביננטי A/GThermoFisher Scientific21186
GE GE ערכת צימוד ביולוגית BioLogic

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooper, M. A. Optical biosensors in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).
  2. Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
  3. Davidoff, S. N., Ditto, N. T., Brooks, A. E., Eckman, J., Brooks, B. D. Surface Plasmon Resonance for Therapeutic Antibody Characterization. Label-Free Biosensor Methods in Drug Discovery. , Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3 35-76 (2015).
  4. Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
  5. Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
  6. Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
  7. Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451(2014).
  8. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
  9. Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
  10. Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
  11. Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
  12. Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
  13. Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
  14. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  15. Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
  16. Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
  17. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  18. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
  19. Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Antibody antigen Binding KineticsBiosensor Platform ComparisonSurface Plasmon ResonanceBioLayer InterferometryHigh affinity Monoclonal AntibodiesPCSK9 Binding AnalysisKinetic Data ConsistencyMultiplex Array PrintingContinuous Flow MicrospotterOrbital Agitation Detection

Related Articles