שיטה לבחינת ההשפעה של רמזים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות ב תסיסנית מלנוגאסטר

Summary

אנו מדגימים assay לנתח את רמזים סביבתיים וגנטיים המשפיעים על התנהגות ההזדווגות של זבוב הפירות תסיסנית melanogaster .

Abstract

הדחף המיני של האדם מושפע מגנוטיפ, מניסיון ותנאי סביבה. איך גורמים אלה אינטראקציה כדי לווסת התנהגויות מיניות נשאר מובן. ב תסיסנית melanogaster , רמזים סביבתיים, כגון זמינות מזון, משפיעים על פעילות ההזדווגות המציע מערכת דקדנית לחקור את מנגנונים modulating מינית התנהגות. ב ד melanogaster , רמזים סביבתיים הם חשו לעתים קרובות באמצעות chemosensory gustatory ומערכות חוש הריח. כאן, אנו מציגים שיטה לבחון את ההשפעה של רמזים כימיים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות. Assay מורכב הזירה הזדווגות קטן המכיל בינוני מזון זוג מזדווגים. תדירות ההזדווגות עבור כל זוג הוא פיקוח מתמיד במשך 24 שעות. כאן אנו מציגים את תחולת assay זה כדי לבדוק תרכובות סביבתיות ממקור חיצוני באמצעות מערכת אוויר דחוס כמו גם מניפולציה של רכיבים סביבתיים ישירות בזירה ההזדווגות. USe של מערכת האוויר בלחץ שימושי במיוחד כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות נדיפים מאוד, תוך מניפולציה רכיבים ישירות בזירה ההזדווגות יכול להיות בעל ערך כדי לוודא נוכחות של המתחם. Assay זה יכול להיות מותאם לענות על שאלות לגבי ההשפעה של רמזים גנטיים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות ואת פוריות, כמו גם אחרים התנהגות הרבייה זכר ונקבה.

Introduction

התנהגויות פוריות בדרך כלל יש עלויות אנרגיה גבוהות, במיוחד עבור הנקבות, אשר מייצרים gametes גדול יותר מאשר גברים חייב בזהירות בחר את התנאים להעלות את צאצאיהם המתפתחים. בגלל עלות האנרגיה, אין זה מפתיע כי רבייה קשורה לתנאים תזונתיים. זה נכון ברוב, אם לא כל, חיות כולל יונקים, התבגרות אשר יכול להתעכב על ידי תת תזונה, ואשר דחף מיני יכול להיות מושפעת לרעה על ידי מזון הגבלה ^1.

רפרודוקציה של אורגניזם מודל גנטי תסיסנית melanogaster מושפע גם בתנאים תזונתיים. גברים בבית המשפט ברמה גבוהה יותר בנוכחות מזון נדיפים ² , ונקבה הם יותר מינית פתוח בנוכחות שמרים, מזין עיקרי לייצור ביצים וצאצאים הישרדות ^{3 , 4 , 5} . זֶהאבולוציונית משמרת התגובה הרבייה למזון מציעה הזדמנות ללמוד מנגנונים המחברים זמינות מזון סביבתי כדי רבייה מינית באורגניזם גנטית זמן יעיל. ואכן, עבודה ד melanogaster יש מעורבים את מסלול האינסולין כווסת חשוב של הקשר בין מזון התנהגות ההזדווגות ⁶ . זה הוכיח גם כי מעשה ההזדווגות עצמו משנה את העדפת המזון של הנקבות, כמו גם את הנוירונים chemosensory הקשורים ^{7 , 8 , 9} .

ברור כי רמזים למזון משפיעים על התנהגויות הרבייה ב מלנוגאסטר . תופעות אלה נראים משפיעים בעיקר נשים, במיוחד לאלה שכבר הזדווגו ^5. עם זאת, כדי לבדוק את ההשפעות האלה חריפה של תנאים סביבתיים assay בשימוש קלאסי עבור התנהגות ההזדווגות הנשי עשוילא להיות מתאים מאוד עקב הפרעות ארוכות בין פרקים ההזדווגות. ב assay remating קלאסי, נקבה בתולה הראשון mates עם זכר, והוא מבודד מיד ומוצג עם זכר חדש 24 עד 48 שעות מאוחר יותר. זה assay קלאסי שימש בהצלחה רבה כדי לזהות רכיבים של פליטה זכר לשנות את ההתנהגות הנשית ואת התגובה הנשית ^{12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18} . Assay ההזדווגות מתמשך הוכיח כאן, ולכן, בנוסף מבחני ההזדווגות הקלאסית שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את ההשפעה החריפה של תנאים סביבתיים על התנהגויות הרבייה.

באמצעות assay מתמשך עבור התנהגות ההזדווגות מוסבר כאן, הראינו בעבר כי זוג זבובים חשופים שמרים יהיה remate sאי פעם על פני תקופת תצפית של 24 שעות ^{5 , 19 , 20 , 21} , בעוד זבובים לא חשופים למזון יהיה רק ​​פעם אחת ⁵ . ממצא זה יכול להיות תמוהה לאור חלק גדול של הספרות ד melanogaster המציין כי הנקבות לא remate עבור מספר ימים לאחר הזדווגות הראשונית (נסקרו הפניות ^{10 , 11} ). עם זאת, פער זה יכול בקלות להיות מוסבר על ידי תנאי assay, שבו נקבה מבודדת במשך יום עד כמה ימים לפני הזדמנות ההזדווגות החדשה מסופק. אם הצמד אינו מזדווג במהלך תקופת תצפית זו של שעה, הנקבה מאופיינת כבלתי פתוחה. יתר על כן, תדירות ההזדווגות גבוהה לא צריך להיות מפתיע בהתחשב בנתונים של זבובים נתפס בר להראות כי הנקבות מכילות זרע מ 4 עד 6 זכרים באברי האחסון שלהם; ובכךDicating כי הנקבות באופן טבעי remate מספר פעמים ^{22 , 23} .

כאן, אנו מדגימים את השימוש זה assay הזדווגות מתמשך כדי לפענח כיצד זבובים לאסוף ולשלב מידע על תנאי הסביבה כדי לווסת את תדירות ההזדווגות. Assay זה מאפשר אחד לבחון מספר גדול יחסית של זוגות ההזדווגות עבור מחקרים גנטיים כדי לבדוק את ההשפעה של רמזים סביבתיים נדיפים ולא תנודתיים. Assay בדרך כלל פועל במשך 24 שעות, אבל יכול להיות המורחבת ל 48 שעות, המאפשר בדיקה של רמזים סביבתיים רכיבה כגון מחזור כהה (LD) אור. אנו מדגימים assay זה על ידי בדיקת ההשפעה של רמזים נדיפים מתרבות שמרים בתוך מערכת אוויר בלחץ בשילוב עם הזמינות של מזין שמרים בלתי נדיף מצע מזון.

מערכת האוויר בלחץ ברציפות משאבות רמזים נדיפים לזירת ההזדווגות המכיליםמזון מצע זוג הבדיקה (אשר התנהגות ההזדווגות שלו מנוטר). כדי לקבוע עוד יותר את הפרטים באמצעותם השמרים משפיע על ההזדווגות, אנו בוחנים תרכובת נדיפה גדולה של שמרים, כלומר חומצה אצטית ²⁴ , בשילוב עם חומצת אמינו תוכן המתאים לזה של שמרים במצע מזון, בצורה של פפטון (אמינו חומצות הנובעות מעיכול אנזימטי של חלבונים מן החי). יחד אלה ניסויים להדגים כיצד ההשפעה של רמזים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות של ד melanogaster ניתן לבדוק עם assay זה.

Protocol

1. תיבת הזיווג בשליטת הסביבה

1. כדי להבטיח אזור בדיקה מבוקר וקל לניקוי, הגדרת ארון מטבח נירוסטה של ​​120 ס"מ x 64 ס"מ x 85 ס"מ כפי שמוצג באיור 1A.
   1. מקדחה חור אחד בחלק האחורי של ארון ממש מתחת לתקרה ארבעה סטים של ארבעה חורים לתוך הצדדים, כל אחד עם קוטר של 2 ס"מ. מקדחה את שתי קבוצות הראשון של ארבעה חורים, על כל צד של הקופסה בגובה של 7 ס"מ מהחלק התחתון של התיבה עם 12.5 ס"מ בין חורים. מקדחה את שתי קבוצות אחרות בכל צד של הקופסה בגובה של 35 ס"מ מלמטה.
      הערה: ארבעת הסטים של ארבעה חורים משמשים כבלי חשמל המצלמה צינורות משאבת אוויר להיכנס ולצאת מהארון. החור בגב משמש עבור כבלי החשמל של לוח אור.
   2. בניית לוח אור עם 18 שורות של 40 לסירוגין לבן ואור אדום פולטות דיודות (LED) עם שטח 2.5 ס"מ בין כל light.Mount לבן ואדום LEDs ב circuiלא עם אספקת החשמל. לחבר כל LED בסדרה עם נגד של 560 Ω, 0.25W ו 5% סובלנות.
      הערה: אורכי הפליטה של ​​האור האדום נמתחו מ -590 עד 661 ננומטר עם שיא חד ב -62 ננומטר. עוצמת האור וכתוצאה מכך באזור ניסיוני הוא כ 900 לוקס עם שני האורות על ו 90 לוקס עם רק את האורות האדומים על; זה נמדד באמצעות מד אור חכם הטלפון App.
   3. צרף את לוח האור לחלק העליון של ארון נירוסטה ולהעביר את כבלי החשמל דרך החור מאחור.
   4. חבר את המתאם של נוריות LED הלבנות לשעון בקרת חשמל כדי לאפשר כיבוי הנורית הלבנה במהלך השלב הכהה של הניסוי. חבר את המתאם של האור האדום, אשר זבובים עיוורים עד ²⁵ , כדי לספק כוח רגיל לשמור אותם על כל משך הניסוי.
   5. תקן אחד 110 ס"מ ושני סוגריים מתכת 54 ס"מ, כל אחד עם רוחב של 0.5 ס"מ, על הצדדים הפנימיים של התיבה בגובה 50ס"מ מהחלק התחתון של התיבה. מניחים צלחת דיפוזיה זכוכית פרוסטד (מידות של 119.0 ס"מ x 54.5 ס"מ x 0.5 ס"מ) על סוגריים אלה.
   6. הוסיפו שלוש שכבות של נייר סינון (120 ס"מ x 50 ס"מ) בין לוח האור לבין צלחת הזכוכית כדי לפזר את האור הזוהר והמבליט על פני השטח של זיווג ההזדווגות (המתואר בסעיף 4). הצמד שני גיליונות נייר סינון יחד על הקצה הארוך שלהם על מוטות עץ 120 ס"מ ארוך באמצעות מגנטים (בצד), כדי לתקוע אותם לתוך הקירות של ארון המתכת; לבצע פעולה זו 3 פעמים.
   7. צרף ארבעה מעריצים בצדדי הקופסה כדי ליצור זרם אוויר ברציפות אוורור תיבת ההזדווגות. צרף את המערכה הראשונה של 8 ס"מ אוהדים בין לוח האור ואת צלחת זכוכית, עם כניסת האוויר בצד שמאל ואת הפליטה בצד ימין של התיבה, כדי למזער את בניית החום שנוצר על ידי לוח האור.
   8. צרף את הסט השני של 12 ס"מ אוהדים 25 ס"מ מעל התחתון של הממשלה כדי ליצור זרימת אוויר החוצה כי פתחי אוNside של ארון ו cools אותו יציב 26 ° C. צרף את המעריצים בצד הפליטה אל צינור היניקה ולהוביל את Airstream מחוץ לחדר כדי למנוע רכיבה מחדש של האוויר בארון.
2. הגדר שתי עמדות (כ 48 ס"מ גבוה) רכוב עם שני מלחציים, אחד ב 28 ס"מ ואחד ב 30 ס"מ מבסיס הדוכן. תקן מצלמת אינטרנט על כל אחד מהדקים. חבר את 4 המצלמות למחשב המריץ את תוכנת הניטור.
3. הצב גליונות A4 מתחת לכל מצלמת אינטרנט. השתמש גיליונות לבנים או גיליונות מודפסים עם טרום טבלה ממוספר של 7 על ידי 5 ריבועים עם 4 ס"מ צירים כדי להתאים זיווגים זיווג (המתואר בסעיף 4).
   הערה: מצלמת מצלמת HD עם תצוגת זווית רחבה של 78 מעלות ורזולוציה של 5 מיליון פיקסלים יכולה לכסות שטח של 21 ס"מ x 30 ס"מ המקביל לגיליון A4 ולנטר בין 20 ל -35 זירות זיווג.

2. לטוס אחורה אוסף

1. מקום 20 זכר ו -20 נקבה wild-type קנטון- Sזבובים לתוך זבובים גידול בקבוקים המכילים 45 מ"ל עשיר לטוס מזון בינוני (ראה סעיף 3) במשך שלושה עד ארבעה ימים. מעבירים את אותם מבוגרים שלוש פעמים על ידי הקשה הראשונה אותם ולאחר מכן לתוך בקבוקים טריים.
   1. מניחים את הבקבוקים באינקובטור ב 25 ° C, ו 12 שעות: 12 שעות אור כהה מחזור עם אורות ב 09:00 (Zeitgeber הזמן (ZT) 0). דור חדש יופיע כעשרה ימים לאחר מכן.
2. להרדים את הזבובים החדשים eclosed וכתוצאה מכך על רפידות פחמן דו חמצני לא יותר מ 5 דקות לאסוף אותם לתוך בקבוקונים מזון זבוב באמצעות מברשת צבע.
   1. איסוף בתולה (eclosed לאחרונה) נקבות וזכרים בתולה מן wild-type קנטון- S בקבוקי מניות לתוך 2.5 ס"מ x 9.5 ס"מ טוס בקבוקונים גידול עם 6.5 מ"ל של מזון עשיר לטוס מזון.
3. גיל הזבובים בקבוצות המין זהה של 20 זבובים כל אחד בקבוקונים לגידול טוס במשך 5 עד 8 ימים על 25 מעלות צלזיוס ו 12 שעות: 12 שעות אור כהה מחזור האורות ב 09:00 (ZT 0).
4. Transfאה זבובים כדי צפרדעים טריים לגדל בקבוקונים ביום שלפני הניסוי.

3. הכנה בינונית למזון

1. הכן 1 ליטר של עשיר לטוס בינוני כדלקמן.
   1. יוצקים 1 ליטר של מי ברז כוס 2 ליטר זכוכית עם מגש מערבי מגנטי לשים את הכוס על צלחת חמה מגנטית. שמור על ערבוב ולהפוך את החימום עד 300 מעלות צלזיוס עד הטמפרטורה רותחים הוא הגיע.
      הערה: במהלך זמן ההרתחה הארוך בשלבים הבאים חלק של מים יתאדו, אבל יחד עם המרכיבים הוסיף זה פרוטוקול תוצאות 1 L של בינוני זבוב עשיר כאשר הכן בטמפרטורת החדר של כ 22 מעלות צלזיוס.
   2. מוסיפים את המריחה ל -500 סיבובים בדקה (סל"ד) ומוסיפים את המרכיבים הבאים למים הרותחים: 10 גרם אגר, 30 גרם גלוקוז, סוכרוז 15 גרם, 15 גרם תירס, 10 גרם חיטה, 10 גרם קמח סויה, 30 גרם מולסה, 35 גרם שמרים יבשים פעילים. חכה שמרים קצף במרץ, ואז לדחות את הטבלה צלחת חםבוגר עד 120 ° C.
   3. לאחר 10 דקות להפעיל את צלחת חמה עד 30 מעלות צלזיוס ולתת לתערובת לבחוש עד מקורר ל 48 מעלות צלזיוס. צג הטמפרטורה על ידי הוספת מדחום ישירות לתוך האוכל.
   4. ממיסים 2 גרם של p-hydroxy-benzoic חומצה מתיל אסתר (tegosept, 100%) לתוך 10 מ"ל של 96% אתנול. הוסף זה 5 מ"ל של 1 M חומצה propionic לתערובת. מערבבים במשך 3 דקות.
   5. יוצקים את המדיום מזון זבוב לתוך זירות (המתואר בסעיף 4) כדי ליצור שכבה 0.3 ס"מ עובי בתחתית הזירה.
      1. השתמש כוס 200 מ"ל זכוכית לשפוך. כאשר כמויות המדויק הם חשובים, השתמש פיפטה סרולוגית 10 מ"ל.
2. הכן זבוב בינוני פחות שמרים בדיוק כפי שמתואר בשלב 3.1.1 עד 3.1.5, אבל לעזוב את השמרים בשלב 3.1.2.
3. הכן בינוני עם אגר עם או בלי פפטון על ידי ערבוב 10 גרם אגר ו 35 גרם peptone ב 1 L של מים רותחים ולבצע צעדים 3.1.4 כדי 3.1.5.

4. מאטיןG ארנה הכנה

1. פירס חור כ 0.3 ס"מ קוטר בצד העליון של 3.5 ס"מ x 1.0 ס"מ צלחת פטרי פלסטיק באמצעות מחט הכנה מחוממת (מחומם לאדמומיות מבער בונזן). לחלופין, השתמש מלחם.
2. בעת הכנת בינוני מזון עם תרכובות ריחניות, הראשון פיפטה 30 μL (1% של המדיום הסופי מזון, למשל חומצה אצטית קרחוני 100%) של המתחם הרצוי לתוך המנה למחצית מנות ניסיוני. השאירו את החצי השני של המנות ריקות להשוואה.
   הערה: עם הגדרת המתואר כאן, ניתן לבדוק עד 140 זירות בו זמנית.
3. באמצעות 10 מ"ל פיפטה סרולוגית, לשפוך 3 מ"ל של מדיום מזון בתחתית המנה על גבי המתחם הרצוי. מכסים אותו בבד גבינה כדי למנוע זיהום, ולהשאיר את המדיום כדי לחזק כ 1 שעות בטמפרטורת החדר.
4. מניחים מכסה על הכלים וקלטת כל סגור משני צדדים. הכינו קטן פרפין הסרט plugs כדי לכסות את החורים שלאת הכלים על ידי רולינג חתיכות של סרט פרפין לתוך 0.2 ס"מ לחמניות עבות ולאחר מכן לחתוך אותם 0.5 ס"מ.

5. שמרים תרבות ריח

1. לגדל שמרים פעילים יבשים על שמרים לחלץ פפטון דקסטרוז (YPD) אגר ב 14.0 ס"מ x 2.06 ס"מ צלחת פטרי. ללבוש כפפות כדי למנוע זיהום בשלב זה.
   1. הכינו צלחות אגר YPD על ידי הוספת 10 גרם תמצית שמרים, 20 גרם peptone, 22 גרם גלוקוז (0) + - גלוקוז מונוהידראט) ו 15 אגר (טהור) ל 1 ליטר של מים ultrapure רותחים. שכבת התחתון של צלחת פטרי פעם הכל מומס ולאחסן במהופך במקרר ב 4 מעלות צלזיוס, עד 2 חודשים.
   2. מפזרים כמה גרגרי שמרים מיובשים על צלחת בינונית YPD, לתת להם להתמוסס. לאחר מכן פסים את הצלחת בינוני באמצעות לולאה סטרילית. חנות הצלחת 30 ° C חממה לילה. לאחר מכן, לאחסן את התרבות במקרר לא יותר מ 1 בשבוע.
2. הכן בינוני YPD נוזלי אניN 1 l בקבוקי ידי הוספת 10 גרם שמרים לחלץ, 20 גרם peptone, 22 גרם גלוקוז (0) + - גלוקוז מונוהידראט) ו לערבב ל 1 l ultrapure מים.
   1. החיטוי במשך 25 דקות על 120 מעלות צלזיוס 1 בר הלחץ. לאחר מכן, לאחסן את הבקבוקים על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 חודשים עד לשימוש.
3. הכניסו את מכסה הבקבוקים הפתוחים (4.5 ס"מ) עם מחיצת סיליקון עבה 0.32 ס"מ.
   1. חותכים שני חורים קטנים מחצה כדי להתאים בחוזקה אביזרי מחיצות תיל. צרף את צינור פוליוויניל כלורי (PVC) קטן (בקוטר: 0.8 ס"מ החיצוני 0.5 ס"מ הפנימי) לשני שקעים היוצאים את הבקבוק ורק אחד הכניסה נכנסים לבקבוק. ראה איור 1 ב 'להמחשה.
   2. לעטוף את כובעי מצויד צינורות רדיד אלומיניום החיטוי במשך 25 דקות על 120 מעלות צלזיוס 1 בר לחץ.
4. ללבוש כפפות כדי להגן מפני זיהום בשלב זה. טובלים סטרילית 100 פיפטה μL קצה לתוך אחד המושבות שמרים מהצלחת אגר YPD (דEscribed ב 5.1) ושחרר אותו לתוך בקבוק נוזלי YPD autoclaved.
   1. שווי זה שמרים- inoculated YPD בקבוק נוזלי בינוני, כמו גם בקבוק בקרת YPD בינוני (שמרים לא הוסיף) עם כובעים autoclaved רכוב עם ו - מוצא (המתואר בשלב 5.3). שים את שני בקבוקים על צלחות מגנטי נפרד ומערבב 100 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לפני תחילת הניסוי כדי לאפשר את התרבות שמרים לגדול.
   2. חבר את פתחי הכניסה של שני בקבוקים משאבות אקווריום נפרד לספק את האוויר לתרבות שמרים. הקפד לחבר את השקע של בקבוק שמרים ניסיוני לצינור אוורור ריח שמרים מתוך חדר ניסיוני כדי למנוע הפרעה עם הניסוי.

6. משאבת אוויר הגדרת

1. צרף את צינורות PVC גדול (בקוטר: 1.2 ס"מ חיצוני 0.9 ס"מ פנימי) לאוויר דחוס אספקת ולהוביל אותו דרך שתי כוסות L 1 בקבוקי Erlenmeyer מלאים פחם מופעל ל 800 מ"לכדי לטהר את האוויר. השתמש או אוויר דחוס מסופק בדרך כלל במעבדות כמו אספקת אוויר, או לחבר את הצינורות למשאבת אוויר (האוויר בלחץ שימש כאן).
   הערה: חומר הצינור צריך להיות נבחר על בסיס המאפיינים הכימיים של נדיפים, ונבדק כדי למנוע נדיף מלהידבק רירית הצינור (למשל polytetrafluoroethylene, ניילון או נירוסטה).
2. הפוך שני מפצלי אוויר צינורות 15 מ"ל שלוש עצות פיפטה 1000 μL כל אחד.
   1. לעשות שלושה חורים של ~ 1 ס"מ קוטר. תחילה לשרוף שני חורים, באמצעות מחט הכנה מחומם (אדום מחומם במבער Bunsen), סמוך זה לזה ממש מתחת למכסה של צינור 15 מ"ל. ואז להפוך את החור השלישי על ידי הסרת התחתון של הצינור.
   2. דבק 1,000 טיפים פיפטה μL לתוך החורים עם קצה צר הצבעה החוצה. חותכים את קצה טיפים פיפטה כדי לאפשר זרימת אוויר גבוהה יותר.
3. חבר את צינורות PVC גדול מן השקע של cפחם מלא בקבוק Erlenmeyer כדי קצה פיפטה בתחתית צינור 15 מ"ל. הוסף שקעים צינורות PVC קטן לשני טיפים פיפטה אופקית להוביל אותם לכיוון שליטה בקבוק ניסיוני.
4. כדי למנוע זיהום של המדיום YPD עם מיקרואורגניזמים, לצרף את הצינור הקטן מסנן מזרק סטרילי (0.45 מיקרומטר גודל הנקבוביות) עם דחיפה פלסטיק על מחבר צינור צינור הולך לכיוון המסנן, בורג על מחבר כבל פלסטיק לעזוב את המסנן. ואז, לצרף את צינורות הכניסה של בקבוק תרבות YPD (ראה איור 1B ).
5. כדי למנוע שמרים מוטס מן נסיעה מן הבקבוק תרבות לתוך הזירה הניסויית, לצרף צינור זכוכית (6.5 ס"מ, קוטר חיצוני = 0.5 ס"מ וקוטר פנימי = 0.3 ס"מ) לשקע של כל בקבוק תרבות YPD באמצעות צינורות קטנים. צרף צינורות PVC לצד השני של צינור זכוכית להוביל את זה לעבר החורים התחתון (קדח בכל צד) של תיבת הניסוי.
   1. ממלאים את הצינור עם סיבי זכוכית החיטוי לפני השימוש.
6. מוסיפים צינור נוסף של 15 מ"ל צינור (המתואר בסעיף 6.2) לצינור ה- PVC הקטן, בכל צד של תיבת הניסוי, כדי לקבל שתי צינורות שפועלות לתוך הקופסה, הן בצד הניסויי (הקרוב ביותר למיצוי זרם האוויר של המאוורר, מימין) ואת הצד הבקרה (הקרוב ביותר כניסתו של זרם האוויר אוהד, משמאל).
7. הכן 8x 25 מ"ל פיפטות סרולוגיות כל עם 10 שקעים לבדוק 80 זוגות ההזדווגות באותו זמן, כלומר 40 עבור כל מזגן.
   1. צרוב 10 חורים של ~ 0.8 ס"מ קוטר, 2 ס"מ זה מזה לתוך פיפטה.
   2. חותכים את החלק החיצוני של מזרק 1 מ"ל לתוך שקע קטן (2.5 ס"מ) אחד גדול (5 ס"מ).
   3. דבק אלה שקעים לתוך החורים עם דבק חם.
   4. לעטוף להקה קטנה של סרט פלסטיק פרפין סביב סוף שקעים לצרף פיפטה 1000 μL קצה. קוטר הפתח הוא 0.1 ס"מ. השתמש בעצות נקיות עבור כל ניסוי.
8. צרף שתי פיפטות סרולוגיות, באמצעות מפצל T עם קוטר חיצוני ≤ 0.5 ס"מ ו חתיכות קצרות של צינורות PVC קטן, לכל אחד משני שקעים משני הצדדים. קלטת את טפטפות שטוח על גיליון נייר לבן (מתחת המצלמות בתיבת פלדה).
9. באמצעות צג זרימת האוויר, להגדיר את זרימת האוויר, כך מהירות האוויר ביציאה של 1000 פיפטה μL קצה הוא 0.5 מ '/ ש'. זה מתאים זרימת אוויר של 0.0017 L / s לכל קצה.

7. מעקב אחר התנהגות ההזדווגות

1. השתמש פיפטה הפה (כמתואר בהתייחסות ²⁶ ) למקום נקבה אחת ניסיוני לתוך צלחת פטרי קטן (המתואר בסעיף 4) בשעה 15:00 (ZT 6) ולתת לה 1 h כדי להסתגל לזירה ההזדווגות.
2. הגדר את תיבת הניסוי (המתוארת בסעיף 1) באופן הבא:
   1. להדליק את האורות, כלומר נוריות LED לבן על 12 h: 12 שעות כהה מחזור כהה מחובר טיימר שמפעיל אתאור בשעה 09:00 (ZT0) ו אדום אור רציף נוריות כדי לאפשר ניטור של זבובים במהלך השלב האפל של הניסוי. הפעל את האוהדים כדי להגביל את החימום של הממשלה על ידי מקור האור כדי להבטיח ריחות עודפים הם פרקו מחוץ לאזור הבדיקה.
   2. חיבור מצלמות מצלמת אינטרנט למחשב ולהפעיל אותם עם תוכנת ניטור עבור ניטור תמונה.
   3. עבור כל מצלמה, הגדר את המיקוד, בהירות וזום בתוכנת הניטור.
      1. לחץ לחיצה ימנית על מסך המצלמה, פתח את "מאפייני המצלמה", ו unclick "מיקוד אוטומטי". התאם את "המוקד" כדי להבהיר את הרשת או כל מילה כתובה על גיליון הנייר. אם יש צורך, לשנות את "בהירות" ו "זום".
   4. הגדר את התוכנית של תוכנת ניטור ללכוד 1 תמונה כל 2 דקות. לחץ לחיצה ימנית על כל מסך המצלמה ובחר "ערוך מצלמה" ולאחר מכן את "פעולות" אפשרות. לחץ כדי להתחיל את הפעולות "ב רגיל intErvals "ולשנות את הזמן" 2 דקות ". בחר" צלם תמונה "עבור פעולות לבחור לבצע ולבסוף לחץ על" אישור ".
   5. לחץ לחיצה ימנית על כל מסך המצלמה ובחר "התחל ניטור".
3. לאחר 1 שעה (ב ZT 7), להעביר זכר wildtype לצלחת פטרי באמצעות פיפטה הפה, במקום את הצלחת על גיליונות נייר A4 את מצלמות מצלמת, ולחץ על "התחל ניטור" במשך 24 שעות. עבור הניסוי משאבת אוויר, במקום את המנה בצורה כזו כי שקע פיפטה מחובר חור הכניסה של זיווג ההזדווגות.
4. כדי לנתח את התנהגות ההזדווגות של בני הזוג, בצע את הפעולות הבאות.
   1. בחר ופתח את כל התמונות בתמונה צפייה בתוכנה ואת הדף דרכם בסדר כרונולוגי.
   2. רשום את התאריך, מספר הניסוי, מספר המנה, וזמן הפתיחה לגיליון אלקטרוני באותה שורה. קח את הזמן ההתחלה של כל זירה מרגע זה ממוקם תחת webcaמצלמה. רשום את חותמת הזמן מהתמונות.
   3. סמן את שעת ההתחלה של כל הזדווגות באותה שורה בגיליון האלקטרוני. ספירת הזדווגות כתקרית כאשר הזכר רכוב על הנקבה והזוג נשאר יציב נייח באותה תנוחה לפחות חמש מסגרות רצופות (10 דקות).
      הערה: קריטריון זה מבוסס על האורך המדווח של הזדווגות, בטווח שבין 12 ל 27 דקות בדאל מלנוגאסטר , וההערכה כי הזיווגים של 10 דקות ומעלה הם פורייה ^{27 , 28} .
   4. ספירת מספר הזדווגות עבור כל שורה בגיליון האלקטרוני כדי לקבוע את תדירות ההזדווגות. לחלופין, לחסר את זמן ההתחלה של הניסוי מרגע ההזדווגות הראשונה עבור כל שורה כמדד של חביון ההזדווגות, או להפחית את זמן ההזדווגות הראשונה מהזמן של ההזדווגות השנייה כאמצעי של חביון remating.
      1. כדי לחשב את זמן האחזור הנבחר, ודאלהגדיר את התאריכים של הזיווג הראשון והשני כמו ימים רצופים בתוכנה גיליון אלקטרוני.
   5. לנתח את הנתונים במודלים של אפקטים מעורבים, בהנחה של התפלגות נורמלית של הנתונים ולכלול את תאריך הניסוי כגורם אקראי, תוך שימוש בתוכנה סטטיסטית (ראה טבלת החומרים) כדי לקבוע את המשמעות הסטטיסטית של המשתנים הבלתי תלויים - סוג האוויר, ואינטראקציה-כפי שתוארו לעיל ^5.
   6. בחר את מודל ההסבר הטוב ביותר על ידי ביצוע ביטול לאחור של משתנים עצמאיים שאינם משמעותיים באמצעות בדיקות יחס הסתברות לוגית ומידע Akaike הקשורים. לאחר הפעלת המודל, בחן ויזואלי את שאריות הנתונים כדי לאשר את הנורמליות. לאשר את ההומוגניות של שונות באמצעות מבחן Levene. במקרה של הומוגניות לא שוויונית, השורש הריבועי הופך את הנתונים.

Results

שימוש זה assay רציפה, התנהגות ההזדווגות, תדירות ההזדווגות בפרט, ניתן לקבוע בתנאים סביבתיים ניסיוניים. כדי לשלוט בתנאים סביבתיים, שינינו ארון מטבח נירוסטה לתוך אזור הבדיקה, עם מקור האור שלה דיפוזיה, אשר מבטיח שפע גבוה של אור כמות מינימלית של בוהק מלמעלה של זירות ההזדווגות ( איור 1 א ) . אזור הבדיקה הפנימי הוא עטוף לחלוטין על ידי נירוסטה וזכוכית, אשר מאפשר ניקוי עם ממיסים אורגניים, כגון הקסאן או אתנול. בנוסף, הממשלה מצויד חורים לשמש ...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר assay כדי לבדוק התנהגות ההזדווגות מעל 24 שעות תוך שליטה רציפה על רמזים סביבתיים כי זוג הזדווגות משוער להשתמש כדי לקבוע תדירות ההזדווגות. ניתן להגדיל את תדירות ההזדווגות בתגובה האוויר שמרים נמסר באמצעות מערכת אוויר בלחץ כאשר המדיום מכיל שמרים גם ( איור 2 ב ). בנוסף, תגובה דומה בתדירות ההזדווגות ניתן לראות עם מדיום מזון פשוט המכיל רק אגר, פפטון, ריח חומצה אצטית ישירות במדיום ( איור 3 ב )

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>ארון
ארון מטבח נירוסטה	Horecaworld	7412.0105
נוריות לבנות	Lucky Light	ll-583wc2c-001	לבן קר, 20 mAmp ו-2 V
נוריות אדומות	Lucky Ligt	ll-583vc2c-v1-4da	אורך גל בין 625 ננומטר, 20 mAmp ו-6 V
נגד	Royal Ohm	CFR0W4J0561A50	560 אוהם, 0.25 וואט, 250 וולט ו-5% סובלנות
אפליקציית מד אור לסמארטפון	פטריק ג'ודיצ'לי		אור / לוקס מטר חינם, גרסה 1.1.1
טיימר כוח	Alecto	TS-121
סוגרי			זווית חדה 5 על 5 מ"מ,   2 x 5450 ואורך 1 x 1100 מ"מ
צלחת			1190 x 545 x 5 מ"מ
נייר סינון יריעות	מסנני LEE	220	כפור לבן
מאוורר קטן	Nanoxia שקט עמוק	4260285292828	80 מ"מ מאוורר מחשב שקט במיוחד, 1200 סל"ד
מאוורר גדול	Nanoxia שקט עמוק	4260285292910	120 מ"מ מאוורר מחשב שקט במיוחד, מצלמת מצלמת אינטרנט 650-1500 סל"ד
	Logitech	950270	B910 HD WEBCAM OEM, זווית: 78 מעלות, רזולוציה: 5 מיליון פיקסלים
תוכנת מצלמה	DeskShare		צג אבטחה pro
שם	חברה	מספר קטלוגי	>Comments
Fly rearing
bottles	Flystuff	32-130	6oz מלאי Drosophila בקבוק
Flypad	Flystuff	59-114
זבובים			Canton-S
בקבוקוני גידול זבובים	דומיניק דוצ'ר	789008	צינורות דרוזופילה צרים 25x95 מ"מ
אינקובטור	Sanyo	MIR-154
פלטה חמה מגנטית	Heidolph	505-20000-00	MR Hei-Standard
Agar	Caldic רכיבים B.V.	010001.26.0
גלוקוז	גזונד & wel	1019155	דקסטרוז / Druivensuiker
סוכרוז	ואן גילזה		סוכר מגורען
קמח תירס	זבוב	62-100
נבט חיטה	Gezond & 1017683
קמח סויה	Flystuff	62-115
מולסה	Flystuff	62-117
שמרים יבשים פעילים	Red Star
Tegosept	Flystuff	20-258	100%
פפטון (בקטו)	BD	211677
חומצה אצטית	Merck	1000631000	קרחון, 100%
פטרידיש	קטן גריינר ביו-וואן		627102 35 x 10 מ"מ עם פתחי אוורור
סרט פרפין	Bemis NA		Parafilm
Name	Company	Catalog Number	Comments
>שמרים ואוויר בלחץ
גוסלין	ביג פטיריש	BP140-01	140 x 20.6 מ"מ
מים טהורים במיוחד	MiliQ של תאגיד
	BD	212750
אגר (טהור)BD		214530
בקטו גלוקוז (0(+)-גלוקוז מונוהידרט)	Merck	18270000004
Open caps	Schott	29 240 28	GL45
מחיצת סיליקון	VWR	548-0662
אביזרי מחיצה דוקרניים	Nalgene	6149-0002
צינורות			גדולים: חיצוני 1.2 ס"מ ופנימי 0.9 ס"מ
צינורות			קטנים: חיצוני 0.8 ס"מ ופנימי 0.5 ס"מ
צינור 15 מ"ל	משאבת אקווריום פלקון
	דיוק	סרה	Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 הרץ, 3 W ולחץ >100 mbar
פחם פעיל	Superfish	A8040400	Norit פחם פעיל
יחידת מסנן חד פעמית	Whatman	10462100
פיפטות סרולוגיות	VWR	612-1600
מזרק	BD פלסטיפק	300013
דבק חם	Pattex
מסנן מזרק	Whatman		FP 30/נקבוביות גודל 0.45 מ"מ CA-S
שם	חברה	Catalog	Comment
Analysis
Statistics תוכנה	R		lme4