מאמר שיטה

Reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה Neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית

DOI:

10.3791/55697

⸱

13 ביוני 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, Montreal Neurological Institute, 3Ananda Devices

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך זה מתאר כיצד במהירות ליזום, להרחיב ולחבר neurites מאורגן בתאי microfluidic באמצעות poly-D- ליזין מצופה חרוזים קבוע micropipettes כי מדריך התארכות neurite.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגיעה במוח ובחוט השדרה עלולה להוביל למוות ולמוות קבועים, משום שעדיין לא ניתן ליצור מחדש נוירונים על פני מרחקים ארוכים ולחבר אותם במדויק עם מטרה מתאימה. הנה הליך המתואר במהירות ליזום, להאריך, בדיוק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים ארוכים. שיעורי ההארכה שהושגו להגיע מעל 1.2 מ"מ / שעה, 30-60 פעמים מהר יותר מאשר את שיעורי vivo של האקסונים הצומחים במהירות ממערכת העצבים ההיקפית (0.02-0.44 מ"מ / שעה) 28 ו 10 פעמים מהר יותר מאשר דיווח בעבר סוג נוירונים בשלב מוקדם יותר של התפתחות 4 . ראשית, אוכלוסיות מבודדות של נוירונים בהיפוקמפוס חולדה גדלים במשך 2-3 שבועות במכשירים microfluidic למיקום המדויק של התאים, המאפשר micromanipulation קל וניבוי ניסיוני. הבא, חרוזים מצופה poly-D- ליזין (PDL) ממוקמים על neurites כדי ליצור דבק contמעשים ו micromanipulation פיפטה משמש להזיז את החרוז שנוצר neadite חרוז. כמו חרוז הוא זז, זה מושך neurite חדש שיכול להיות המורחבת על מאות מיקרומטר מחובר תפקודית לתא היעד בתוך פחות מ 1 שעות. תהליך זה מאפשר שחזור נסיוני וקלות של מניפולציה תוך עקיפת אסטרטגיות כימיות איטיות יותר כדי לעודד צמיחה neurite. מדידות ראשוניות המוצגות כאן מדגימות קצב גידול עצבי הרבה מעבר לפיזיולוגיה. שילוב החידושים הללו מאפשר הקמה מדויקת של רשתות עצביות בתרבות עם מידה חסרת תקדים של שליטה. זוהי שיטה חדשנית שפותחת את הדלת שפע של מידע ותובנות שידור אות תקשורת בתוך הרשת העצבית כמו גם להיות מגרש משחקים שבו לחקור את גבולות הצמיחה העצבית. יישומים פוטנציאליים וניסויים נפוצים עם השלכות ישירות על טיפולים שמטרתם להתחבר neuronaמעגלים לאחר טראומה או במחלות נוירודגנרטיביות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פציעות במערכת העצבים המרכזית הבוגרת (CNS) עלולות להוביל לנכות קבועה בשל מנגנונים מרובים המגבילים את הצמיחה מחדש של הצירים. בעקבות פציעה, רבים אקסונים CNS לא יוצרים קונוס צמיחה חדשה להיכשל תגובה משובי יעיל 2 . יתר על כן, נזק ורקמת צלקת סביב נגעים CNS לעכב באופן משמעותי צמיחה axonal 1 , 2 , 3 . טיפולים הנוכחי כדי לקדם התחדשות CNS לאחר הפציעה התמקדו בשיפור פוטנציאל הצמיחה המהותי של הנוירון הפצוע ועל מסיכה את מעכבי הארכת סיבי המשויך פסולת מיאלין צלקת גלייה 1 , 3 . למרות זאת, היכולת ליצור מחדש את האקסונים הארוכים למטרות רחוקות וליצור סינפסות פונקציונאליות מתאימות נותרה מוגבלת מאוד 4 , 5 , 6 , 7 .

בעבודה הנוכחית, microbeads, micromanipulation פיפטה, והתקנים microfluidic משמשים ליזום במהירות, להאריך, בדיוק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים ארוכים. עבודה קודמת הראתה כי poly-D- ליזין מצופה חרוזים (PDL חרוזים) לגרום הידבקות קרום ואחריו אשכולות של קומפלקסים שלפוחית ​​סינפטי ויצירת boutons presynaptic תפקודית 8 . זה הוכח גם כי כאשר חרוז PDL הוא משך מכנית משם לאחר הבחנה presynaptic, אשכול חלבון סינפטי הבא חרוז, ייזום neurite חדש 9 . ההליך הבא מנצל עובדה זו יחד עם היכולת התרבות נוירונים בהיפוקמפוס עובריים של חולדות לאזורים מאורגנים על coverslip באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS) מכשירים microfluidic כדי בדיוק rewire נוירוניםמעגל חשמלי.

אלה מכשירים PDMS microfluidic אינם רעילים, שקוף אופטית מורכבת משני חדרים מחוברים על ידי מערכת של microchannels. לאחר התאספו על coverslip, כל התקן משמש עובש להנחות צמיחה העצבית ולשמור על תרבויות עצביות בריאים על דפוסים מדויקים במשך יותר מ 4 שבועות במבחנה .

כאן, במסגרת מוצג במסגרתו לחקור את גבולות הארכה ופונקציונליות של neurite החדש. חדש, neurites תפקודית נוצרים וממוקמים לשליטה (re) רשתות נוירונים. שיעורי ההארכה מושגת הם מהר יותר מ 20 מיקרומטר / דקות על פני מרחקים בקנה מידה מילימטר קשרים פונקציונליים נקבעים. תוצאות אלה מראות, באופן בלתי צפוי, כי היכולת הפנימית של אלה neurites להארכה היא הרבה יותר מהר ממה שחשבו בעבר. גישה מכנית מוצעת זו עוקפת אסטרטגיות כימיות איטיות ומאפשרת חיבור מבוקר ליעד מסוים. תהיא טכניקה פותחת אפיקים חדשים למחקר חוץ גופית של טיפולים חדשניים כדי לשחזר את הקישוריות העצבית לאחר הפציעה. זה גם מאפשר מניפולציה ו rewiring של רשתות נוירונים לחקור היבטים בסיסיים של עיבוד אותות עצביים תפקוד העצבית במבחנה .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים המפורטים להלן אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת מקגיל ועמדו בקווים המנחים של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים.

1. סטנדרטיזציה של תרבויות עצביים באמצעות התקנים Microfluidic: הרכבה המכשיר

  1. בחר מכשיר מתאים microfluidic לניסוי הרצוי. כדי לחבר נוירונים בתוך אותה האוכלוסייה, להשתמש התקנים נוירו ( איור 1 ) ו לחבר נוירונים באוכלוסיות שונות להשתמש Co- תרבות התקנים ( איור 6 ).
  2. נקו ולהכין את המספר הרצוי של coverslips סטרילי או מנות התחתונה זכוכית. לקבלת התוצאות הטובות ביותר על משטחי פלסטיק להשתמש 35 מ"מ מנות, על זכוכית לשימוש coverslips 25 מ"מ, או 35 מ"מ מנות התחתונה זכוכית. בחר עובי זכוכית בהתאם למערכת ההדמיה, למשל 0.15 מ"מ.
  3. מעילים את הכלים או coverslips עם 0.5-1 מ"ל של 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​PDL עבור 2 שעות או לילה במזג החדרAt.5.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולחדש את היום הבא אם תרצה בכך. Furthemore, מנות יכול להיות מצופה עם PDL חיץ PDL בדילול, פולי- L- ליזין (PLL), laminin או כל תא אחר הידבקות מולקולה.
  4. לשטוף את הכלים פעמיים עם מים (לא להשתמש מלוחים פוספט מלוחים (PBS) כמו גבישי מלח עשוי לחסום את הערוצים), להסיר את כל הנוזל ולתת לו להתייבש בסביבה סטרילית כגון ארון biosafety עבור 5-10 דקות או עד המשטח יבש לחלוטין.
    הערה: היזהר כדי להבטיח כי coverslips הם יבשים לחלוטין, כמו כל הנוזל הנותר יפריע דבקות של מערכות microfluidic.
  5. מניחים התקנים microfluidic עם דפוס פונה כלפי מעלה תחת אור UV בסביבה סטרילית (ארון biosafety) במשך 10 דקות. הקפד לעקוב אחר נהלים סטריליים בעת עבודה בממשלה biosafety 10 .
  6. באמצעות פינצטה במקום מכשיר microfluidic עם דפוס פונה למטה במגע עם coversl נקיIp / צלחת. השתמש פינצטה ללחוץ בשקט את המכשיר כך שהוא דבק הזכוכית.
    הערה: השקיפות של האזור הדבק תהיה גלויה כאשר מסתכלים מול האור. ודא שכל הפינות פונות אל הזכוכית. לעשות את זה לכל התקנים microfluidic. ראה איור 1 א .
  7. כדי למלא את המכשיר אוכלוסייה אחת עם בינוני, הצבע פיפטה לכיוון הערוצים ולהוסיף 50 μL של המדיום התא להשלים בתוספת B- 27 (יחס נפח 1:50 נפח) ו 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​פניצילין / סטרפטומיצין / גלוטמין (ביחד הנקרא NBM) אל הזכות העליונה טוב, ולאחר מכן להוסיף עוד 50 μL אל היטב שוכב באלכסון אליו. האם זה עבור כל המכשירים, ולוודא כי המדיום זורם בין בארות. לאחר מכן, להוסיף 50 μL של המדיום הנותר 2 בארות. ראה איור 2 א .
    1. כדי למלא את המכשיר האוכלוסייה מרובים עם בינוני, הצבע פיפטה לכיוון הערוצים ולהוסיף 30 μLשל NBM מלא לבארות הנכון, עיין בתרשים 6 א . האם זה עבור כל המכשירים, ולוודא כי המדיום זורם בין בארות. לאחר מכן, להוסיף 50 μL של המדיום הבא 4 בארות.
  8. מניחים את ההתקנים בצלחת גדולה יותר עם צלחת פתוחה עם מים autoclaved (קאמרית רטובה) ומקום בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו לחות 95%) במשך 1-2 שעות תוך הכנת התרבות התא. ראה איור 2 ב .

2. ציפוי נוירונים במערכות microfluidic

  1. בעקבות הפרוטוקול המפורט ב Ref. 8 , לקבל ניתוק נוירונים בהיפוקמפוס או קליפת המוח מ עוברי עכברוש Sprague Dawley (או מין).
  2. Resuspend נוירונים עובריים ב NBM בריכוז של 1-2 מיליון נוירונים / מ"ל. אימות ריכוזי התא במיקרוסקופ באמצעות hemocytometer ואת ההתייחסות הבאה 8 . התאם את התא ריכוז תאG לצפיפות התאים הרצויה. כדי להגדיל את הסיכוי להשגת אקסונים יחיד בהיפוקמפוס לכל ערוץ, צלחת 10,000 נוירונים לכל מכשיר. כדי לקבל מספר אקסונים באותו ערוץ, צלחת 60,000 נוירונים לכל מכשיר.
    הערה: מספרים אלה משתנים בהתאם לסוג העצבית בשימוש.
  3. הסר את המדיום מן המכשירים microfluidic מבלי לרוקן את הבארות. השאירו כ 5 μL בכל.
  4. כדי לצבוע תאים במכשיר האוכלוסייה אחת, להוסיף 50 μL של NBM לימין התחתון. בשלב זה המדיום זורם על ידי עצמו כדי למלא את השני נמוך יותר. הוסף 20 μL של הפתרון תא מרוכז לתוך הזכות העליונה גם של המכשיר microfluidic, כפי שצוין באיור 1b .
    1. לתאים צלחת בהתקן האוכלוסייה מרובים להוסיף 20 μL של הפתרון תא מרוכזים לתוך כל הבארות הנכון בתרשים 6 א .
  5. בדוק את המיקרוסקופ אם תאיםהם בתוך החדרים ומכניסים את ההתקנים בחממה במשך 15-30 דקות כדי לקדם את מצורף התא אל המצע.
  6. בדוק את המיקרוסקופ אם יש מספיק תאים בתאי. אם יש צורך יותר, חזור על שלבים 2.4 ו -2.5.
  7. הוסף 50 μL של NBM על 2 בארות העליון של המכשיר האוכלוסייה אחת 20 μL של NBM לתוך אותו היטב כמו התאים הוזרקו בהתקן האוכלוסייה מרובים. התקשורת בולטת מעט כדי ליצור מניסקוס חיובי נותן את הבארות היבט העליון מאפין. שוב, ראה איור 2 א .
  8. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו לחות 95%.

3. שמירה על תרבויות העצבית

  1. הסר NBM (בערך 30 μL עם פיפטה) מהתאים וליישם מראש NBM מראש מחומם ביום הבאים ההקדמה שלהם התקנים (כלומר 1 ד לאחר שלב 2).
  2. בדוק כל 2 ימים אם יש מספיק מדיום בכל ערוץ. אם t מאפיןOp הוא נמוך רק להוסיף בינוני יותר בארות העליון.
  3. תאים תרבותיים לפחות 7 ד לפני הסרת התקנים microfluidic. התאים יכולים לשרוד בהתקנים אלה במשך מספר שבועות. הסר את המכשירים 1-2 ימים לפני ביצוע ניסויים על דגימות.

4. הסרת התקנים Microfluidic

  1. 1 - 2 ד לפני הסרת התקנים microfluidic, להוסיף 2 מ"ל של preMmed NBM ל 37 מעלות צלזיוס לכל צלחת מדגם, להציף את החדרים, ולשמור על התקנים בחממה.
  2. השתמש פינצטה סטרילית עצה אחת כדי להסיר את המכשירים microfluidic מן coverslips עוזב תצורה בדוגמת של נוירונים. השתמש קצה להחזיק את coverslip במקום ואת פינצטה כדי לאחוז את קצה המכשיר בפינה השמאלית התחתונה של הבאר. בעדינות להחיל פיתול, מרימה את המכשיר עם פינצטה כך שהוא מקלף את coverslip. ראה איור 2 ג - 2 ד .
  3. כל 2-3 ימים, להחליף חהאם NBM עד המדגם משמש ניסויים.
  4. לפני ביצוע ניסויים rewiring על המדגם, לוודא כי neurites בערוץ יחיד אוכלים האוכלוסייה ואת האוכלוסייה נוירונים בהתקן האוכלוסייה מרובים מבודדים על ידי בחינת פערים ביניהם מיקרוסקופ כדי להבטיח שאין נימים המקשר אוכלוסיות נוירונים.

5. הכנת PDL מצופים חרוזים

  1. הוסף 2 x 50 טיפות μL של 4 או 10 או 20 מיקרומטר פוליסטירן חרוזים בדילול במים (1: 500) ל 1 מ"ל של PDL (100 מיקרוגרם / מ"ל). השאירו לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולחידושו למחרת.
  2. צנטריפוגה הפתרון ב 8,820 XG במשך 1 דקות. הסר בזהירות supernatant מבלי להפריע חרוזים שנצברו בתחתית המיכל.
  3. לשטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של 10 מ"ל HEPES סטרילי pH 8.4 פתרון.
  4. Resuspend חרוזים PDL מצופים 200 מ"ל של 10 מ"מ HEPES pH 8.4פִּתָרוֹן.

הכנת Micropipettes

  1. הכן טפטפות מן צינורות נימי זכוכית (1 מ"מ קוטר פנימי, 1.5 מ"מ קוטר חיצוני) באמצעות חולץ אלקטרודה אופקי. להתאים את ההגדרות כך קצה החיצוני של micropipette משך הוא ~ 2-5 מיקרומטר. לפני משיכה, להבטיח את צינורות זכוכית נקיים.
  2. תקן פיפטות לשקופיות זכוכית לאחסון, ולוודא כי קצה לא ליצור קשר עם פני השטח של השקופית כמו קצה שביר. חנות בטמפרטורת החדר במיכל מכוסה כדי להגן מפני אבק. השתמש טפטפות באותו יום הם משכו.

7. PDL חרוז הדבקה לנוירונים

  1. הוסף 40-60 μL של חרוזים PDL מצופה מוכן בשלב 5 לתרבות תאים מוכן בשלב 4. מרכז קצה פיפטה על הנוירונים, אשר נראים לעין על coverslip, ולהוסיף את חרוזים (ראה איור 3 ).
  2. החזרת המדגם לחממה במשך 1 שעות כדי לקדם את היווצרות של סאיקשרים נטיים 8 , 9 .
  3. לאחר הדגירה, להסיר את כל החרוזים unhered ידי שטיפת בעדינות את התרבות עם NBM מראש מחומם.

8. הכנת תמיסת מלוחים פיזיולוגיים (עבור ניסויים טמפרטורת החדר)

  1. הכן תמיסה מלוחים פיזיולוגיים על ידי שילוב של המרכיבים המפורטים בהפניות 7 , 8 . זה כדי לווסת את הסביבה התא מחוץ לחממה.
  2. אמת רמות osmolarity ו pH כפי שצוין בהפניות 7 , 8 .
  3. ברציפות להחדיר פתרון עם O 2 כדי למזער תנודות ה- pH בעת ביצוע ניסויים.
  4. מחממים לטמפרטורת החדר.
  5. הגדרת מערכת זלוף על ידי החדרת קצה אחד של צינור פלסטיק (מידות אופציונלי) ב O 2 פיסיולוגיים פתרון חד פעמי ותיקון e אחריםNd למחט מוכנס בעל המדגם. מניחים את הצינור ואת הפתרון גבוה יותר המדגם (ראה איור 4 ).
    1. נתק את הצינור מהמחט לחבר אותו מזרק. השתמש במזרק להפעיל לחץ לצייר נוזל, מילוי הצינור. חותם עם מהדק הרים ולחבר מחדש את המחט.

9. חרוז מיקרו-מניפולציה

  1. התקן מדגם במערך ניסיוני, כך שניתן לגשת לתאים מלמעלה על ידי שני micropipettes רכוב micromanipulators לגשת אופטית להלן, למשל עם המטרה 40X שלב (צמצם המספרי של 0.6) של מיקרוסקופ אופטי הפוכה. בתצורה זו, הר מצלמה CCD לכידת תמונה על היציאה בצד של המיקרוסקופ. חבר כל פיפטה מזרקים 1 מ"ל באמצעות צינורות פלסטיק. בשלב זה, להחליף NBM עם תמיסת מלוחים פיזיולוגיים (1-2 מ"ל) (ראה איור 4 ).
  2. במהלך התנסותMents, תאים perfuse ברציפות עם תמיסת מלוחים פיזיולוגיים מוכן בשלב 8 בקצב של 0.5-1 מ"ל / דקה.
  3. בחר חרוז PDL לא מחוברת נוירון בתחום התצוגה. יישר את החרוז עם קצה micropipette ידי התמקדות על חרוז ואז עד micropipette. תביא את קצה קרוב ככל האפשר כדי חרוז על ידי ניטור זה דרך המיקרוסקופ.
  4. החל לחץ שלילי עם מזרק 1 מ"ל מחובר פיפטה להרים את החרוז. לשמור על לחץ שלילי במהלך הניסוי.

10. משיכת Neurites

  1. בחר חרוז PDL המצורפת נוירון בתחום התצוגה וצרף אותו micropipette השני באמצעות יניקה כמתואר צעדים 9.3-9.4.
  2. משוך את PDL חרוז מורכבים נוירון על ידי לאט (~ 0.5 מיקרומטר / min) נעים או micromanipulator או את השלב המדגם על ידי 1 מיקרומטר ולהשהות במשך 5 דקות כדי לאפשר חניכה neurite.
  3. חזור על שלב 10.2 פעמיים.
    הערה:# 181; מ 'צריך להיות משוך לאט מאוד כדי להבטיח הצלחה ניסיונית, אשר מתרחשת מעל 95% מהמקרים.
  4. משוך את PDL חרוז מורכבים נוירון על ידי לאט (~ 0.5 מיקרומטר / min) נעים או micromanipulator או את השלב המדגם על ידי 2 מיקרומטר ולהשהות במשך 5 דקות כדי לאפשר התארכות neurite.
  5. לאחר חניכה מוצלחת הרחבת neurite עבור 5 מיקרומטר הראשון, למשוך את neurite ב 20 מיקרומטר / דקות על פני מרחקים בקנה מידה מילימטר.
    הערה: ניתן לבצע רציפה ברציפות או בשלבים ובשיעורים משתנים. ראה איור 5 ב -5 ג .

11. חיבור נוירונים

  1. בחר אזור עשיר neurites ולהוריד את PDL-bead-neurite מורכבים כך שהוא מגע פיזי זה. השתמש חרוזים אחרים כדי למדוד גובה קצה מעל coverslip פני השטח. ראה איור 5 ד .
  2. השאירו את PDL-bead-neurite מורכבת במגע עם neurite היעד תוך מניפולציה micropi השניפטה. להנמיך את פיפטה השני עם השני PDL חרוז על גבי neurite שנוצר לאחרונה על 20 מיקרומטר הטופס חרוז הראשון. השתמש השני חרוז PDL לדחוף את נימה neurite חדש לכיוון תא המטרה.
  3. החזק את שני החרוזים במקום למשך שעה אחת לפחות. ודא את היעדר נפיחות מוקד, עיבוי של neurites פנייה חרוז, עם מיקרוסקופ 16 .
  4. במהלך תקופה זו, להשתמש זלוף לאט לשנות את המדיום של המדגם מלוחים פיזיולוגיים מראש מחומם, CO 2- equilibrated NBM.
  5. שחרר את החרוז מן פיפטה השני על ידי שחרור יניקה. אם החדש neurite נשאר מחובר, לשחרר את החרוז הראשון גם כן. ראה איור 5 ה .
  6. הסר בעדינות פתרון מלוחים להחליף עם NBM (~ 2 מ"ל).
  7. בזהירות במקום המדגם בחזרה בחממה כדי לחזק את הקשר העצבית עבור ניסויים עתידיים. חיבור זה יציב במשך 24 שעות 7

12. אימות הפונקציונליות של חיבור חדש באמצעות תא שלם התאמת התיקון Clamp הקלטות

  1. עקוב אחר הפניות 7 , 18 , 19 . כדי להרכיב הגדרת electrophysiology.
  2. עיין בהמלצות 7 . כדי להכין את האלקטרודות מראש ו postsynaptic.
  3. איסוף נתונים מהדק תיקון, שוב בעקבות הפניות 18 , 19 .
  4. השווה את התוצאות לאירועים המתרחשים באופן טבעי 7 כדי לקבוע את סוג החיבור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עובריים עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס הם מתורבת במכשירים microfluidic כדי לאפשר מיקום מדויק של תאים, PDL חרוזים micromanipulators. הצעד הראשון הוא כראוי להרכיב את המכשיר microfluidic על coverslip זכוכית או צלחת. זה חיוני כי המכשיר microfluidic להיות מחובר היטב המצע, כדי למנוע תאים היוצאים מן החדרים נעים מתחת לחלקים של המכשיר כי צריך להיות אטום ( איור 1 א ). כדי לשמור על תרבויות בריאות במשך מספר שבועות, חשוב למנוע אידוי בי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות micromanipulation רגיל ומכשירים microfluidic חדשניים, טכניקה חדשה פותחה כדי ליזום במהירות, להאריך ולדויק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים גדולים. פיפטה micromanipulation הוא כלי נפוץ ביותר במעבדות המוח 4 , 13 . האתגר האמיתי להשגת תוצאות לשחזור ואמינה היה סטנדרטיזציה של תרבויות נוירונים בריאים, הממוקמים במדויק במשך תקופת הניסוי (אשר יכול להיות על פי סדר של שבועות) באמצעות פיתוח של התקנים microfl...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מרגרט H Magdesian הוא מנכ"ל אננדה התקנים המייצרת מכשירים המשמשים במאמר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו רוצים להודות יואיצ'י Miyahara על דיונים מועילים רבים תובנות. MA ו PG להכיר מימון NSERC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
התקני קו-תרביתAnanda Devicesזמינים מסחרית ב-http://www.anandadevices.com
NeuroDevices Ananda Devicesזמינים מסחרית ב-http://www.anandadevices.com
מס' 1 כיסוי זכוכית 25 מ"מ עגולWarner Instruments64-0705
35 מ"מ תחתית זכוכית צלחות #0, לא מצופה,תאגיד MatTexP35G-0-20-C
צלחת תרבית תאים 35 מ"מ, לא פירוגנית,צלחת פטרי430165
95 מ"מ x 15 מ"מ, מכסה ניתן להחלקה, פוליסטירן סטריליפישרברנדFB0875714G
צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל עם סימונים מודפסים וכובעים שטוחיםVWR89039-656
צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ"ל, סגנון 17 x 120 מ"מ, לא פירוגני, בז סטרילי
Neurobasal MediumLife Technologies21103-049תמיסה חוץ-תאית
(50X),תוסף B-27 ללא סרום (50X), ללא סרום17504044תמיסה חוץ-תאית
פניצילין, סטרפטומיוצין, גלוטמיןתרמו פישר סיינטיפיק 11995-065פתרון חוץ-תאי
200 μ L PipettorsVWR89079-458
2 - 20 μ L פיפטוריםטיפים עמידים לתרסיס2149P
BD Falcon 3 מ"ל פיפטות העברה [לא סטריליות]BD Falcon357524
גלוקוזGibco15023-021תמיסה חוץ-תאית
HEPESSigma7365-45-9תמיסה/חרוזים חוץ-תאיים
NaClSigma-Aldrich7647-14-5תמיסה
חוץ-תאיתKClSigma-Aldrich7447-40-7תמיסה חוץ-תאית
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4תמיסה חוץ-תאית
MgCl2Sigma-Aldrich7786-30-3פתרון חוץ-תאי
#5 פינצטה Dumont Dumostar 11 ס"ממכשירי דיוק עולמיים500233
כלי דיסקציהבראון, Aesculap
Poly-D-lysine HydrobromideSigma-AldrichP6407
מיקרו חלקיקים המבוססים על פוליסטירן, 10 μ mSigma-Aldrich72986
צינורות בורוסיליקטKing Precision Glass, Inc.14696-2
אופקי חולץ פיפטהSutter Instrumentsמיקרומניפולטורים P-97
מכשירי SDמסדרת PCS-5000MC7600R
מזרק 1 מ"לBD Luer-Lok309628
מיקרוסקופ הפוךאולימפוס IX71
אובייקטיביאולימפוסUIS2, LUCPLFLN 40X
CCDמצלמה פוטומטריתמפל II: 512
לייבוביץ (1x) L-15 MediumLife Technologies11415-064Rat Dissection
Typsin-EDTA (0.05%), פנול אדוםLife Technologies25300054דיסקציה
של חולדותDMEM (1x) מדיום נשר מעובד של Dulbecco [+4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, + L-גלוטמין, + 110 מ"ג/ליטר נתרן פירובט]Life Technologies11995-065דיסקציה של חולדות
HBSS (1x) תמיסת המלח המאוזנת של האנק [- סידן כלורי, - מגנזיום כלוריד, - מגנזיום גופרתי]Life Technologies14170-112דיסקציה של חולדות
בהקרנת גמא סטרילית 352097 תוסף B-27 חומים-בוערים,

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
  3. Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
  4. Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
  5. Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
  6. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  7. Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
  8. Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
  9. Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
  10. General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
  11. Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
  12. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  13. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  14. Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
  15. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  16. Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
  17. Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925(2010).
  18. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358(2015).
  20. Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
  21. Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
  22. Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
  23. Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
  24. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  25. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  26. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
  27. Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
  28. Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. , Oxford University Press, USA. (1995).
  29. Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
  30. Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDLWhole Cell Patch Clamp

מאמרים קשורים