הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת השושלת chondrogenic מן הדם ההיקפי האנושי (PB) באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה (iPSCs) בשיטה ללא אינטגרציה, הכוללת גבריות הגוף (EB) היווצרות, הרחבת תאים fibroblastic, אינדוקציה chondrogenic.

תקציר

במחקר זה, השתמשנו בתאי דם היקפיים (PBCs) כתאי זרע כדי לייצר chondrocytes באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה (iPSCs) בשיטה ללא אינטגרציה. לאחר גדילה של הגוף (EB) והתפשטות תאים fibroblastic, iPSCs הם המושרה עבור בידול chondrogenic במשך 21 ימים תחת סרום ללא תנאים ללא xeno. לאחר אינדוקציה chondrocyte, פנוטיפים של התאים מוערכים על ידי ניתוח מורפולוגי, immunohistochemical, וביוכימי, כמו גם על ידי כמותי בזמן אמת PCR בדיקה של סמנים בידול chondrogenic. את chondrogenic pellets להראות חיובי alcian כחול כחול toluidine מכתים. אימונוהיסטוכימיה של קולגן II ו- X מכתים הוא גם חיובי. תכולת ה- glycosaminoglycan (sGAG) וה- chondrogenic differentiation markers, COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 ו- AGGRECAN מוגברות באופן משמעותי ב- chondכדורי rogenic לעומת hiPSCs ותאי fibroblastic. תוצאות אלו מראות כי PBCs ניתן להשתמש בתאי זרע כדי ליצור iPSCs עבור תיקון הסחוס, שהוא החולה ספציפי וחסכוני.

מבוא

רקמת הסחוס יש יכולת ירודה מאוד לתיקון עצמי התחדשות. התערבויות כירורגיות שונות וטיפולים ביולוגיים משמשים כדי לשחזר סחוס פונקציה משותפת, עם תוצאות לא מספקות. הפיתוח האחרון של טכנולוגיית תא גזע עשוי לשנות את השדה תיקון סחוס כולו ¹ . תאי גזע שונים נחקרו כתאי זרע, אך תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) להיראות הבחירה המבטיחה ביותר, כפי שהם יכולים לספק סוגים רבים של תאים ספציפי חולה מבלי לגרום לתגובות דחיית ^2. יתר על כן, הם יכולים להתגבר על הטבע השגשוג המוגבל של תאים בוגרים ולשמור על התחדשות עצמית ויכולות pluripotent שלהם. יתר על כן, מיקוד גנטי יכול לשמש כדי לשנות את הגנוטיפ כדי לקבל סוגים מסוימים של chondrocytes.

Fibroblasts כבר בשימוש נרחב כדי ליצור iPSCs כי הפוטנציאל שלהם תכנות מחדש יש גם נחקרו היטב.עם זאת, יש עדיין כמה מגבלות שיש להתגבר, כגון ביופסיה כואבת מן המטופלים ואת הצורך הרחבה במבחנה של fibroblasts, אשר עלול לגרום מוטציות גנים ³ . לאחרונה, PBCs נמצאו להיות יתרון עבור תכנות מחדש ⁴ ; יתר על כן, הם היו בשימוש נפוץ מאוחסן בשפע. זה אפשרי כי הם עשויים להפנות את המחקר להתמקד מן העור. עם זאת, למיטב ידיעתנו, ישנם כמה דוחות על תכנות מחדש PBC ואחריו בידול לתוך chondrocytes.

במחקר הנוכחי, אנו משתמשים PBCs כמקור חלופי על ידי תכנות מחדש אותם לתוך iPSCs ולאחר מכן הבדל iPSCs לתוך השושלת chondrogenic באמצעות מערכת התרבות גלולה על מנת לחקות היווצרות chondrocyte.

פרוטוקול

פרוטוקול הדור של hiPSCs מ PBCs ניתן למצוא במחקר הקודם שלנו ⁵ . המחקר אושר על ידי המוסד לביקורת מוסדית של המוסד שלנו.

1. גבריות גוף (גיבוש) גיבוש

1. בצע 50 מ"ל של המדיום hiPSC: נוקאוט Dulbecco השתנה בינוני בינוני (DMEM) בתוספת 15% החלפת נוקאאוט בסרום (KSR), 5% בסרום שור עוברית (FBS), 1 × חומצות אמינו לא חיוניות, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 2 מ"מ L - glutamine, ו 8 ng / mL בסיסי fibroblast גורם הצמיחה (bFGF).
2. הפוך 50 mLof בינוני היווצרות EB: DMEM בתוספת KSR 15%, 5% FBS, 1x חומצות אמינו חיוניות, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, ו 2 מ"מ L- גלוטמין.
3. הפוך 50 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית: DMEM בתוספת 20% FBS, 1 × חומצות אמינו לא חיוניות, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, ו 2 מ"מ L- גלוטמין.
4. הכן 10 מ"ל של פתרון dispase, 1 מ"ג / מ"ל ​​ב נוקאאוט DMEM.
5. CultuRe hiPSCs על 60 מ"מ צלחות תרבות רקמה עם תאים מזין ( כלומר, monolayer של תאים עובריים fibroblast עובריים עכבר). כאשר התאים הם 80-90% confluent, disassociate התאים עם dispase ומעבר hiPSCs 1: 3 כל 4-5 ימים. מניחים את התאים לתוך 37 ° C ו 5% CO ₂ חממה.
6. לנתח את מושבות hiPSC לא מובחן לחתיכות קטנות יותר (כ 50-100 מיקרומטר בקוטר) באמצעות מחט זכוכית מצוירת באש כאשר iPSCs הם 80-90% ומחוברות. בדרך כלל, להשתמש מושבות hiPSC בצלחת 60 מ"מ לייצר EBS צלחת 100 מ"מ פטרי.
   1. תרבות פחות מ 100 חתיכות קטנות של מושבות צלחת 100 מ"מ, לא חסיד פטרי המכיל 10 מ"ל של המדיום היווצרות EB. מניחים את הכלים לתוך 37 ° C ו 5% CO ₂ חממה.
7. החלף כ 25% של המדיום הראשוני עם כמות שווה של המדיום התרבות הבסיסית כל 2 ימים. להטות את המנה לתת EBs להתיישב. הסר בזהירות 3 מ"לשל המדיום העליון ומוסיפים 4 מ"ל של מדיום בינוני טרי. אין להפריע EBS.
   הערה: EBs מאופיינים מורפולוגית על ידי פיסות המושבות, לוקח על מראה עגול עם הגבולות החלקים מתחת למיקרוסקופ.
8. לאחר 10 ימים של תרבות בצלחת פטרי לא חסיד, מעיל חדש 100 מ"מ צלחת רקמה תרבות עם 4 מ"ל של ג'לטין 0.1% למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
9. מעבירים את המדיום בתוספת EBS מ 100 מ"מ, צלחת פטרי חסין לצינור חרוטי 15 מ"ל. תן משקעים EBS במשך 4-5 דקות. לשאוב supernatant בזהירות ולהשאיר פחות מ 0.5 מ"ל של מדיום בתוספת EBS
10. זרע פחות מ -100 EBS על 100 מ"מ, צלחת גלאטין מצופה רקמות תרבות עם 10 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית. מניחים את הכלים לתוך 37 ° C ו 5% CO ₂ חממה.

2. תא גלולה גיבוש בידול chondrocyte

1. הפוך 10 מ"ל של 0.25% טריפסין / ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). הפוך 80 מ"ל של basאל תרבות בינוני: DMEM בתוספת 20% FBS, 1x חומצות אמינו חיוניות, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, ו 2 מ"מ L- גלוטמין.
2. הפוך 10 מ"ל של המדידה בידול chondrogenic: DMEM (גלוקוז גבוהה) בתוספת 10% אינסולין- transferrin- סלניום פתרון (ITS), 0.1 מיקרומטר dexamethasone, 1 mM חומצה אסקורבית, 1% pyruvate נתרן, ו 10 ng / mL שינוי גורם הצמיחה, בטא 1 (TGF-β1).
3. רענן את המדיום עם 10 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית לאחר 48 שעות. לאחר מכן, לרענן את המדיום כל שלושה ימים עם 10 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית.
   הערה: לאחר 10 ימים בתרבית, תאי תאים fibroblastic צריך התרחב EBS.
   1. סמל 100 מנות מ"מ עם 4 מ"ל של ג'לטין 0.1% למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. מחק supernatant התא לשטוף את התאים עם Dulbecco של פוספט שנאגרו מלוחים (DPBS) פעם אחת.
   2. לעכל את התאים עם 3 מ"ל של 0.25% טריפסין / EDTA ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לנטרל עם 4 מ 'L בינוני בינוני.
4. לנתק את התאים לתוך תאים בודדים על ידי pipetting מעלה ומטה 5-10 פעמים והעברת אותם דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר. צנטריפוגה ההשעיה התא ב XG 200 במשך 5 דקות. Re- זרע התאים על 100 מ"מ חדש, צלחת גלאטין מצופה רקמות תרבות עם 10 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית.
5. רענן את המדיום עם 10 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית לאחר 48 שעות. לאחר מכן, לרענן את המדיום כל שלושה ימים עם 10 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית.
   הערה: התאים לרכוש מורפולוגיה הומוגנית, דמוי fibroblast.
6. כאשר ~ 90-100% מפגש הוא הגיע ( כלומר, כ 5-7 ימים), למסוק את התאים עם 3 מ"ל של 0.25% טריפסין / EDTA ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל עם 4 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית. לנתק את התאים לתוך תאים בודדים על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. השתמש hemocytometer לספור את מספר התא.
   1. מקום 3 x 10 ⁵ תאים בצינור פוליפרופילן 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 200 xgבמשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). Re- להשעות את התאים 1 מ"ל של המדידה בידול chondrogenic.
7. מחדש צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 3 דקות ולשמור על התאים בצורת גלולה קטנה. שים את הצינור לתוך 37 ° C ו 5% CO ₂ חממה במשך 21 ימים. אין לדפוק את המכסה בחוזקה ולאפשר את החלפת הגז.
8. החלף 3/4 של המדיום תרבות כל שלושה ימים עם בינוני בידול chondrogenic טריים.
   הערה: לאחר 21 ימים בתרבות, hiPSC-chondrogenic pellets (hiPSC-Chon) צריך להיווצר. תאי גזע mesenchymal האדם, כמו שליטה חיובית, נאספים גם תרבותי במדיום בידול chondrogenic במשך 21 ימים כדי ליצור כדורי chondrogenic (hMSC-Chon).

3. ניתוח של דיפרנציאציה chondrogenic

1. הכן 10 מ"ל של 10% נייטרלית שנאגרו פורמלין.
2. הכן 50 מ"ל של מגיב כחול alcian 0.1% ו 50 מ"ל של מגיב 1% toluidine כחול.
3. יחסי ציבורEpare 1 מ"ל של הנוגדנים העיקריים: נוגדנים פוליקלוניים ארנב נגד קולגן II (1:50) או נוגדנים עכבר מונוקלונליים נגד קולגן X (1:50). כמו כן, להכין אנטי ארנב או נוגדנים משניים העכבר.
4. הפוך 1 מ"ל של פתרון papain: 10 U / מ"ל ​​ב PBS עם 0.1 M אצטט אצטט, 2.4 מ"מ EDTA, ו 5 מ"מ L- ציסטאין.
5. הפוך 100 מ"ל dimethylmethylene כחול (DMMB) פתרון צבע: 100 μL של 16 מ"ג / L 1,9-dimethylmethylene כחול, 40 מ"מ גליצין, 40 מ"מ NaCl, ו 9.5 מ"מ HCL; PH 3.0.
6. הערכת בידול chondrogenic ידי כתמים כחולים alcian ו toluidine כתמים של קטעים גלולה.
   1. תקן אחד hiPSC-chon גלולה או hMSC-Chon גלולה ב 1 מ"ל של 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין במשך 24 שעות.
   2. מעבירים את גלולה ל 1 מ"ל של 70% אתנול ב H ₂ O. להתייבש גלולה עם 1 מ"ל של סדרת אתנול מדורגים ( כלומר, 25, 50, 75, 90, 95, 100, ו 100%, 3 דקות כל אחד).
   3. להבהיר את גלולה ב 1 מ"ל של קסילן 100% שלוש פעמים. מסתנןדואר גלולה עם פרפין עבור 1 שעות בתנור 65 מעלות צלזיוס. הטבעת את גלולה בלוקים פרפין עם 7 x 7 x 5 מ"מ ³ עובש הבסיס, לאחר הליכים היסטולוגיים שגרתית ⁶ .
   4. הפוך סעיפים סמוכים על ידי microtome עם עובי של כ 4 מיקרומטר ⁷ . דבק את החלקים על גבי שקופיות זכוכית.
   5. יבש את השקופיות עבור 2 שעות ב 60 מעלות צלזיוס בתנור. Deparaffinize הסעיפים בשלושה מחזורים (3 דקות כל אחד) באמצעות 100% xylene.
   6. השתמש בסדרה אלכוהול הפחתת עבור התייבשות ( כלומר, 100, 100, 95, 95, 70, 50, ו 25% H ₂ O, 3 דקות כל אחד) ולאחר מכן לבצע שטיפה הסופי עם מים deionized במשך 5 דקות.
   7. הכתם את הסעיפים עם 0.1% alcian כחול מגיב או 1% מכתים toluidine כחול במשך 4-5 שעות ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים מזוקקים.
   8. להתייבש עם סדרת אתנול מדורגת ( כלומר, 25, 50, 75, 90, 95, 100, ו 100%, 3 דקות כל אחד) ואחריו שלושה ברציפות רחובEps של הבהרה ב 100% xylene. הרכוב שקופיות לדמיין אותם תחת מיקרוסקופ.
7. לבצע אימונוהיסטוכימיה.
   הערה: חלקים נוספים גלולה מוערכים נוספת על ידי אימונוהיסטוכימיה.
   1. לאחר deparaffinization ו rehydration, להביא את השקופיות לרתיחה ב 1 מ"מ EDTA, pH 8.0 (עמיד למים במים מבושל על ידי החיטוי). תן להם לשבת במשך 8 דקות בטמפרטורה רותחים תת ולאחר מכן לאפשר את השקופיות להתקרר ב RT.
   2. יש לשטוף את השקופיות עם מים deionized 3 פעמים. דגירה הסעיפים ב 3% H ₂ O ₂ פתרון מתנול ב RT במשך 15 דקות לחסום פעילות peroxidase אנדוגני.
   3. שוטפים את השקופיות עם מים deionized ו לטבול אותם DPBS במשך 5 דקות. החל 50-100 μL של נוגדן ראשוני בדילול נאות (1:50) העיקרי על החלקים על השקופיות ולאחר מכן דגירה אותם בחדר humidified ב RT עבור 1 שעות.
   4. לשטוף את השקופיות 3 פעמים (5 דקות כל אחד) עם DPBS. דגירה saדגימות עם נוגדנים המשניים המקביל ( כלומר, נגד ארנבת או עכבר) במשך 15 דקות ב RT.
   5. לשטוף את השקופיות 3 פעמים (במשך 5 דקות כל אחד) עם DPBS. בצע זיהוי DAB תחת מיקרוסקופ.
   6. לשטוף את השקופיות עם DPBS 3 פעמים (2 דקות כל אחד). Counterstain גרעיני התא על ידי שקוע את השקופיות hematoxylin במשך 1-2 דקות. להתייבש עם סדרת אתנול מדורגת (25, 50, 75, 90, 95, 100, ו 100%, 3 דקות כל אחד) ואחריו שלושה שלבים רצופים של הבהרה עם קסילן. לבסוף, הר שקופיות לדמיין אותם תחת המיקרוסקופ.
8. זיהוי תוכן sGAG.
   1. לעכל כדורי chondrogenic בפתרון papain ב 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
   2. קביעת תוכן ה- DNA באמצעות ערכת assay dsDNA ומערכת fluorometer. למדוד את התוכן sGAG על ידי ערבוב זה עם פתרון DMMB צבע תחת מדידה absorbance ב 525 ננומטר ⁸ .
   3. חישוב הריכוז של sGAG נגד עקומת תקן שלכריש גופרית כונדרואיטין.
9. בצע את ניתוח ה- PCR בזמן אמת של סמנים בידול chondrogenic ב hiPSC-chon pellets.
   1. קציר 3-4 של כדורי chondrogenic אותו על ידי הוספת 500 μL של מגיב החילוץ הקרה לצינור אחד. וורטקס ביסודיות. דגירה המדגם במשך 5 דקות ב RT.
   2. הוסף 0.1 מ"ל של כלורופורם. וורטקס המדגם עבור 15 ים ו לדגור אותו RT למשך 3 דקות. צנטריפוגה המדגם במשך 15 דקות ב XG 12,000 ו 4 ° C. מעבירים את השלב מימית העליון (כ 250 μL) לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל חדש.
   3. הוסף 25 μL של אצטט נתרן ו 1 μL של גליקוגן למדגם. להאיץ את RNA על ידי ערבוב זה עם 250 μL של אלכוהול איזופרופיל. מערבבים היטב. דגירה המדגם ב RT במשך 10 דקות.
   4. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 XG ו 4 ° C. הסר את supernatant לחלוטין. לשטוף את גלולה רנ"א פעמיים עם 500 μL של 75% אתנול.
   5. צנטריפוגה 5 דקותב 7,500 XG ו 4 ° C. הסר את כל אתנול שאריות האוויר יבש את גלולה RNA עבור 5-10 דקות. ממיסים את רנ"א 10 μL של מים ללא nuclease.
   6. המרת RNA לתוך cDNA באמצעות מערכת transcriptase הפוכה. נושא דגימות cDNA ל- PCR בזמן אמת באמצעות שילוב QPCR מאסטר הורים (2x) ומערכת PCR בזמן אמת ⁹ .
      הערה: רצפי הפריימר הם:
      H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGGGAGGCCCC;
      H AGGRECAN -R: TCGAGGGTTAGTGTTAGAGAGAA;
      H β- ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      H β- ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
      H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      H SOX9 -F: AGCGAACGACATCAAGAC;
      H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      H COL10- F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      שעה COL10 -R: GGTAGTGGGTTTATGCCT.

תוצאות

בידול Chondrogenic של hiPSCs:

EB בינוני בינוני בינוני בינוני שימשו כדי להבדיל את hiPSCs לתוך השושלת mesenchymal. שיטה רב תרבותית שלב שימש ( איור 1 ). ראשית, hiPSCs נבדלו באופן ספונטני באמצעות היווצרות EB במשך 10 ימים (D10, איור 2 א ). שנית, תאים נעלמו מן EBS עוד 10 ימים (D10 + 10). במהלך שני ...

דיון

כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי ליצור chondrocytes מ PBCs באמצעות iPSCs. מכיוון שתוכניות PBC נפוצות יותר ונמצאות בשימוש נרחב בתחום הקליני, הן מוצגות כחלופה פוטנציאלית לתכנות מחדש. במחקר זה, נוקבים וקטורים (EV) שימשו כדי לתכנת מחדש PBCs לתוך iPSCs, בעקבות השיטה שנקבעה על ידי ג 'אנג et al. ¹¹ . גישה זו נטולת אינטגרציה אינה כוללת שילוב של גנוטוקסיטיזם הקשור לנגיף, אשר מאמינים כי יש לו השפעה רחבה בתחום הקליני ^{12 ,}

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Knockout DMEM	Invitrogen	10829018	מדיום בסיסי המשמש לתרבית hiPSC ומדיום היווצרות EB
החלפת סרום נוקאאוט (KSR)	Invitrogen	10828028	תוסף בינוני מוגדר יותר, נטול FBS, המשמש לתרבית hiPSC ומדיום היווצרות EB
סרום בקר עוברי (FBS)	Hyclone	sh30070.03	משמש לתרבית hiPSC ומדיום היווצרות EB, מציע ערך מצוין לתאים תרבית
חומצות אמינו לא חיוניות	Chemicon	TMS-001-C	משמש כתוסף גדילה בכל מדיום תרבית התאים, להגברת צמיחת התאים וחיוניותם
L-גלוטמין	Invitrogen	TMS-002-C	חומצת אמינו הנדרשת לתרבית תאים
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)	Peprotech	100-18B	A ציטוקין המשמש לשמירה על הפלוריפוטנטיות והחידוש העצמי של hiPSCs
Dispase	Invitrogen	17105041	משמש לדיסוציאציה של hiPSC לתת-תרבות
DMEM	Gibco	C11960	מדיום בסיסי המשמש לתרבית MSC
מדיום 0.1% ג'לטין	Millipore	ES-006-B	משמש לחיבור תאים על הכלים
0.25% טריפסין/EDTA	Gibco	25200072	משמש לדיסוציאציה של
תאים DPBS	Gibco	14190250	תמיסת מלח מאוזנת המשמשת לשטיפת תאים או ריאגנט להכנת
2-mercaptoethanol	invitrogen	21985023	משמש כתוסף גדילה בכל מדיום תרבית התאים.
ITS	invitrogen	41400045	תמיסת אינסולין, טרנספרין, סלניום.משמש להתמיינות כונדרוגנית.
חומצה אסקורבית	Sigma	4403	ידוע בשם ויטמין C. זה עוזר בצמיחה פעילה ובעל תכונות נוגדות חמצון.
נתרן פירובט	גיבקו	11360070	נוסף למדיום תרבית תאים כמקור אנרגיה בנוסף לגלוקוז.
גורם גדילה טרנספורמטיבי-בטא 1	Peprotech	AF-100-21C	A ציטוקין המווסת את התפשטות התאים, צמיחה והתמיינות כונדרוגנית.
נוגדנים רב-שבטיים של ארנב נגד קולגן II	Abcam	ab34712	נוגדן זה מגיב עם קולגנים מסוג II, שהוא ספציפי לרקמות סחוסיות.
נוגדנים חד שבטיים של עכבר לקולגן X	Abcam	ab49945	נוגדן זה מגיב עם קולגן מסוג X, שהוא תוצר של כונדרוטוציטים היפרתרופיים.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	להרכבה ואחסון לטווח ארוך של שקופיות
Toluidine blue	Sigma	89640	משמש לזיהוי פרוטאוגליקנים.
Alcian blue	Amresco	#0298	משמש לזיהוי גלוקוזאמינוגליקנים.
פפאין	סיגמא	P4762-25MG	משמש לעיכול כדורים כונדרוגניים.
דימתילן כחול	סיגמא	341088-1G	משמש לכימות גליקוזאמינוגליאנים
כונדרויטין סולפט מלח נתרן מסחוס כריש	סיגמא	C4384-250MG	משמש לשרטוט העקומה הסטנדרטית למדידת תכולת sGAG.
ערכת בדיקת Qubit dsDNA HS	Invitrogen	Q32851 (100)	משמש לקביעת תכולת ה-DNA
TRIzol	Invitrogen	15596018	משמש לבידוד RNA מתאים
מערכת טרנסקריפטאז הפוך	Promega	A3500	משמש להמרת RNA ל-cDNA
SYBR FAST ערכת qPCR Master Mix	Kapa	KK4601	משמש ל-PCR בזמן אמת