פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיהור, quantitating, אפיון שלפוחית תאיים (EVs) / exosomes מ שאינם חסיד / mesenchymal תאים אפיתל החלב ועל השימוש בהם כדי להעביר את בלוטת החלב יוצרי היכולת לתאי אפיתל החלב לומינל. EVS / exosomes נגזר גזע כמו תאי אפיתל החלב יכול להעביר תכונה זו התא לתאים לבלוע EVs / exosomes.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
העברת בלוטת החלב ביצירת יכולת בין תאי אפיתל בסל החלב תאים לומיני החלב באמצעות שלפוחיות תאיים / אקסוסומות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים יכולים לתקשר באמצעות אקסוסומים, ~ 100 ננומטר שלפוחית תאיים (EVs) המכילים חלבונים, שומנים וחומצות גרעין. Non-חסיד / mesenchymal תא אפיתל החלב (NAMEC), שודד שלפוחית תאיים יכול להיות מבודדים בינוני NAMEC באמצעות ultracentrifugation דיפרנציאלי. בהתבסס על הצפיפות שלהם, EVs ניתן לטהר באמצעות ultracentrifugation ב 110,000 x גרם. ההכנה EV מן ultracentrifugation ניתן להפריד עוד באמצעות שיפוע צפיפות מתמשכת כדי למנוע זיהום עם חלבונים מסיסים. EVs מטוהרים לאחר מכן ניתן להעריך עוד באמצעות ניתוח nanoparticle מעקב, אשר מודד את הגודל ואת מספר שלפוחית בהכנה. שלפוחית תאיים עם גודל הנעים בין 50 ל 150 ננומטר הם exosomes. NAMEC הנגזרות EVs / exosomes ניתן לבלוע על ידי תאים אפיתל החלב, אשר ניתן למדוד על ידי cytometry הזרימה מיקרוסקופיה confocal. כמה תכונות תא גזע החלב ( למשל, יכולת בלוטת החלב יוצרת) יכוליועברו מן NAMECs דמויי גזע לתאי אפיתל החלב באמצעות NAMEC הנגזרות EV / exosomes. מבודד EpCAM היי / CD49f לו תאים luminal החלב epithelial לא יכול ליצור בלוטות החלב לאחר השתלתם לתוך רפידות שומן העכבר, בעוד EpCAM lo / CD49f היי תאים אפיתל החלב הבסיס החלב טופס בלוטות החלב לאחר ההשתלה. ספיגה של NAMEC הנגזרות EV / exosomes על ידי EpCAM היי / CD49f Lo לומינאלי תאים אפיתל החלב מאפשר להם לייצר בלוטות החלב לאחר השתלת לתוך רפידות שומן. ה- EVS / exosomes נגזר כמו תאי גזע כמו אפיתל החלב העברת בלוטת החלב יוצרת יכולת APCAM היי / CD49f lo לומינלית תאים אפיתל החלב.
מבוא
Exosomes יכול לתווך תקשורת סלולרית על ידי העברת חלבונים ממברנה cytosolic, שומנים, ו RNAs בין התאים 1 . תקשורת Exosome בתיווך הוכח להיות מעורב בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים ( כלומר, מצגת אנטיגן, התפתחות סובלנות 2 , התקדמות הגידול 3 ). Exosomes לעתים קרובות יש תוכן דומה לאלה של תאים המקור לשחרר אותם. לפיכך, exosomes יכול לשאת מאפייני תאים ספציפיים מתאי המקור ולהעביר תכונות אלה לתאים לבלוע אותם 4 .
Exosomes הם 50 עד 150 ננומטר כפול שכבת קרום שלפוחית ו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל המחקרים העוסקים בבעלי חיים עמדו בפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים.
1. שלפוחית תאיים / בידוד exosome ו Validation
- תאים NAMECs 4 , עם מדיום טרי, ללא סרום, עשוי 500 מ"ל של MCDB 170, pH 7.4 + 500 מ"ל של DMEM / F12 עם סודיום ביקרבונט (0.2438%); EGF (5 ng / mL); Hydrocoritisone (0.5 מיקרוגרם / מ"ל); אינסולין (5 מיקרוגרם / מ"ל); תמצית יותרת המוח (BPE, 35 מיקרוגרם / מ"ל); ו GW627368X (1 מיקרוגרם / מ"ל) ב 15 ס"מ מנות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מאז הוכח כי חסימת PGE 2 / EP 4 איתות מפעילה EV / שחרור exosome מתאי גזע דמויי הבסיס החלבני 4 , עבודה זו מציגה שיטה לבידוד EVs המושרה / exosomes מתרבות תא אפיתל החלב (NAMEC) החלב. מאז NAMECs הם מתורבת בינוני ללא סרום, אין קיימים EV / exosomes נגזר 13 בסרום. עבור תאים מתורבת בינוני המכיל בסרום, exosomes מראש קיים במדיום יש לנקות מראש על ידי ultracentrifugation ב 110,000 xg לפני המד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Exosomes לעתים קרובות לשאת מאפיינים של התאים ששחררו אותם, ואת כמות exosomes שוחרר יכול להיגרם על ידי גירויים 4 . המדיום התרבות של תאים ניתן לאסוף ונתונה ultracentrifugation דיפרנציאלי עבור EV / אוסף exosome ( איור 1 ). אין כרגע הסכמה כללית על שיטה אידיאלית לבודד EVS / exosomes. השיטה האופטימלית הנהוגה כאן נקבעה על ידי היישום במורד הזרם 14 . Ultracentrifugation היא שיטה מהירה יחסית לבידוד EV / exosomes, א.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לחקר הבריאות (05A1-CSPP16-014, HJL) וממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | תרמו | 1250062 | |
| אופטימה L-100K אולטרה-צנטריפוגה | בקמן | 393253 | |
| SW28 Ti רוטור | בקמן | 342204 | |
| SW41 רוטור | בקמן | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) |
| אופטיפרפ | Sigma-Aldrich | D1556 | תמיסה של 60% (w/v) של יודיקסנול במים (סטרילי). |
| נוגדן CD81 | GeneTex | GTX101766 | 1:1,000 ב-5% w/v חלב יבש ללא שומן, 1x TBS, 0.1% Tween 20 ב-4 & deg; C, לילה |
| נוגדן CD9 | GeneTex | GTX100912 | 1:1,000 ב-5% w/v חלב יבש ללא שומן, 1x TBS, 0.1% Tween 20 ב-4 & deg; C, לילה |
| נוגדן CD63 | Abcam | Ab59479 | 1:1,000 ב-5% w/v חלב יבש ללא שומן, 1x TBS, 0.1% Tween 20 ב-4 מעלות; C, לילה |
| נוגדן TSG101 | GeneTex | GTX118736 | 1:1,000 ב 5% w/v חלב יבש ללא שומן, 1x TBS, 0.1% Tween 20 ב 4 & deg; C, לילה |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6,000 ב 5% w/v חלב יבש ללא שומן, 1x כף, 0.1% טווין 20 ב 4 & מעלות; C, לילה |
| CFSE (קרבוקסיפלואורסצין סוקסינימידיל דיאצטט אסטר) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | מנתח תאים פלואורסצנטיים | |
| קולגנאז סוג IV | תרמו | 17104019 | |
| טריפסין | תרמו | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | תערובת של אינסולין אנושי רקומביננטי, טרנספרין אנושי ונתרן סלניט |
| אקוטאז | ebioscience | 00-4555-56 | תערובת אנזימים טבעית עם פעילות אנזימים פרוטאוליטיים וקולגנוליטיים |
| dispase | STEMCELL | 7913 | 5 מ"ג/מ"ל = 5 U/mL |
| נוגדן נגד CD49f | Biolegend | 313611 1:50 | |
| נוגדן נגד EpCAM | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| תאי אפיתל של חלב אנושי (תאי HMLE, NAMECs) | מתנות מד"ר רוברט ויינברג | ||
| permount | תרמו פישר סיינטיפיק | SP15-500 | |
| נתרן ביקרבונט | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| הידרוקוריטיזון | סיגמא-אולדריץ' | SI-H0888 | |
| אינסולין | סיגמא-אולדריץ' | SI-I9278 | |
| BPE (תמצית יותרת המוח של בקר) | Hammod Cell Tech | 1078-ניו זילנד | |
| GW627368X | קיימן | 10009162 | |
| צלחת תרבית 15 ס"מ | פלקון | ||
| צנטריפוגה שולחנית | Eppendrof | צינור צנטריפוגה 3415R | |
| אולטרה-צנטריפוגה | בקמן | 344058 | |
| PBS (מי מלח חוצץ פוספט) | קורנינג | 46-013-CM | |
| BCA בדיקת חלבון | תרמו פישר מדעי | 23228 | |
| מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים | היטאצ'י | HT7700 | |
| ג'לטין | STEMCELL | 7903 | |
| צלחת תרבית 10 ס"מ | בז | ||
| צלחת תרבית 353003 6 בארות | Corning | 3516 | |
| נקבה C57BL/6 עכברים | NLAC (המרכז | ||
| FBS (סרום בקר עוברי) | BioWest | S01520 | |
| גנטמיצין | תרמו פישר מדעי | ||
| עט/סטרפטוקוקוס | קורנינג | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| איזופלואורן | Halocarbon | NPC12164-002-25 | |
| פורמלדהיד | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (אתנול) | J.T. Baker | 800605 | |
| חומצה אצטית קרחונית | Panreac | 131008.1611 | |
| אלומיניום אשלגן גופרתי | סיגמא-אולדריץ' | 12625 | |
| קסילן | Leica | 3803665 | |
| 0.22 μ m ממברנות | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP קליפים פצועים, 9 מ"מ | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP קליפ פצע Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ אדום עמוק | תרמו פישר מדעי | C10046 | כתם קרום פלזמה |
מקורות
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
