מאמר שיטה

ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג'ל, ו Electroelution

DOI:

10.3791/55738

⸱

1 ביוני 2017

 , 
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את ההפרדה של מיטוכונדריאלי תפקודי שרשרת התחבורה אלקטרונים מתח (Cx) IV ו supercomplexes מהם באמצעות אלקטרופורזה יליד לחשוף מידע על הרכבה שלהם המבנה. ג'ל הילידים יכול להיות נתון immunoblotting, מבחני ג'ל, וטיהור על ידי electroelution כדי לאפיין עוד קומפלקסים בודדים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רשת ההולכה המיטוכונדריאלית (ETC) מייצרת את האנרגיה הנגזרת מהתפלגות של דלקים שונים למטבע הביו-אנרגטי של התא, ATP. ה- ETC מורכב מ -5 מתחמי חלבון מסיבי, אשר גם להרכיב סופר קומפלקסים הנקראים respirasomes (CI, C-III, ו- C-IV) ו synthasomes (קורות חיים) המגבירים את היעילות של התחבורה אלקטרונים הייצור ATP. שיטות שונות שימשו במשך למעלה מ -50 שנה כדי למדוד את הפונקציה ETC, אבל פרוטוקולים אלה אינם מספקים מידע על הרכבה של קומפלקסים בודדים supercomplexes. פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה של ג 'ל הילידים polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (PAGE), שיטה ששונה לפני יותר מ -20 שנה ללמוד מבנה מורכבים ETC. יליד אלקטרופורזה מאפשר הפרדה של מתחמי ETC לתוך צורות פעיל שלהם, ואז קומפלקסים אלה ניתן ללמוד באמצעות immunoblotting, מבחני ג'ל (IGA), וטיהור על ידי electroelution. על ידי שילוב מחדשSults של ג 'ל הילידים PAGE עם אלה של מבחני המיטוכונדריה אחרים, ניתן להשיג תמונה completer של פעילות ETC, הרכבה דינמי שלה פירוק, וכיצד זה מווסת מבנה המיטוכונדריה ותפקוד. עבודה זו תדון גם במגבלות של טכניקות אלה. לסיכום, הטכניקה של הילידים PAGE, ואחריו immunoblotting, IGA, electroelution, המוצגת להלן, היא דרך רבת עוצמה לחקור את הפונקציונליות ואת ההרכב של supercomplexes המיטוכונדריה ETC.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנרגיה מיטוכונדריאלית בצורה של ATP אינה חיונית רק להישרדות התא, אלא גם להסדרת מוות התא. הדור של ATP על ידי זירזון חמצוני דורש שרשרת תובלה אלקטרונית תפקודית (ETC, Cx-I ל- IV) ו synthase ATP המיטוכונדריה (Cx-V). מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי אלה קומפלקסים חלבונים גדולים מאורגנים supercomplexes, נקרא respirasomes ו synthasomes 1 , 2 . זה מאתגר לנתח את הרכבה, דינמיקה, ויסות הפעילות של אלה קומפלקסים מסיבי supercomplexes. בעוד מדידות צריכת חמצן שנלקחו עם אלקטרודה חמצן מבחני אנזים שנערכו באמצעות ספקטרופוטומטר יכול לתת מידע בעל ערך על פעילות מורכבים ETC, מבחני אלה לא יכולים לספק מידע לגבי נוכחות, גודל, הרכב הרכב משנה של קומפלקס חלבון או supercomplexes המעורבים. עם זאת, פיתוח של יליד כחול ברור (BN ו- CN, בהתאמה) עמוד 3 יצרה כלי רב עוצמה לחשוף מידע חשוב על הרכב מורכבים הרכבה / פירוק ועל הרגולציה הדינמית של הארגון supramolecular של אלה מתחמי הנשימה חיוני בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים 4 .

הרכבה של קומפלקסים אלה לתוך supercomplexes בסדר גבוה יותר נראה להסדיר מבנה המיטוכונדריה ותפקוד 5 . לדוגמה, הרכבה respirasome מגביר את היעילות של העברת אלקטרונים ואת הדור של כוח המניע פרוטון על פני קרום פנימי המיטוכונדריה 5 . בנוסף, הרכבה של synthasomes לא רק מגביר את היעילות של ייצור ה- ATP והעברת שווי אנרגיה לתוך הציטופלסמה 2 , אבל זה גם עובש את הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלי לתוך cristae 6 צינורי ,/ Sup> 7 . מחקרים של הרכבה supercomplex במהלך התפתחות הלב בעוברים עכבר עולה כי הדור של Cx-I המכילים supercomplexes בלב מתחיל בערך ביום עובריים 13.5 8 . אחרים הראו כי כמות supercomplexes המכיל Cx-I פוחתת בלב עקב הזדקנות או איסכמיה / reperfusion פציעות 9 , 10 או יכול לשחק תפקיד בהתקדמות של מחלות ניווניות 11 .

פרוטוקול זה מתאר שיטות ג 'ל הילידים PAGE שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הרכבה ופעילות של מתחמי ETC ו supercomplexes. המשקל המולקולרי המשוער של supercomplexes המיטוכונדריה ניתן להעריך על ידי הפרדת מתחמי חלבון CN או BN polyacrylamide ג'לים. CN PAGE גם מאפשר הדמיה של הפעילות האנזימטית של כל מתחמי המיטוכונדריה ישירות הג'ל (ב-מבחני ג'ל;IGA) 12 . עבודה זו מדגימה את הפעילות של respirasomes על ידי הדגשת היכולת של Cx-I לחמצן NADH דרך IGA ואת נוכחות של synthasomes בשל פעילות ATP- hydrolyzing של CX-V על ידי IGA. קומפלקסים מרובים supercomplexes המכילים Cx-I ו CX-V יכול גם להיות הוכח על ידי העברת חלבונים על גבי קרומי ניטרוצלולוזה וביצוע immunoblotting. היתרון של גישה זו היא כי BN או CN PAGE בדרך כלל מפריד מתחמי חלבון על פי גודל פיזיולוגי שלהם הרכב; ההעברה לקרום משמרת תבנית זו של להקות. ניתוח מתחמי חלבון בדף BN או CN יכול להיעשות גם באמצעות 2D-PAGE (ראה Fiala et al 13 להפגנה) או על ידי צנטריפוגה צפיפות סוכרוז 14 , 15 . כדי לנתח עוד להקה ספציפית, זה יכול להיות נכרת מן דף BN, ואת החלבונים ממכלול חלבון זה יכול להיות purifieד על ידי electroeluting אותם בתנאים הילידים. Electroution יליד יכול להתבצע בתוך כמה שעות, אשר יכול לעשות הבדל משמעותי דיפוזיה פסיבית (כמו בשימוש הפניה 16) של חלבונים מן ג'ל לתוך חיץ הסובבים.

לסיכום, שיטות אלה מתארות מספר גישות המאפשרות את אפיון נוסף של supercomplexes משקל מולקולרית גבוהה ממברנות המיטוכונדריה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בוצעו באמצעות לבבות מ C57BL / 6N עכברים (סוג בר). עכברים היו מורדמים עם CO 2 לפני פריקה צוואר הרחם, וכל ההליכים בוצעו בהתאם קפדנית עם המחלקה של מעבדה לבעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר ועל פי החוק המדינה, החוק הפדרלי, ואת מדיניות NIH. הפרוטוקול אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש של אוניברסיטת רוצ'סטר (ועדת האוניברסיטה על בעלי חיים משאבים).

1. CN ו- BN PAGE

הערה: כל הציוד המשמש עבור BN ו- CN PAGE חייב להיות נטול חומר ניקוי. כדי להבטיח זאת, לשטוף את כל הציוד עם חומצה הידרוכלורית 0.1 M, ואחריו שטיפה בהרחבה עם H 2 O deionized.

  1. הכנה
    1. הכן חיץ באנודה בהיקף של 25 מ"מ imidazole, pH 7.0, ב 4 ° C; חנות ב 4 ° C.
    2. הכן חיץ קטודה עבור CN או BN PAGE.
      1. עבור CN PAGE, השתמש 7.5 mM imidazole ו 50 מ"מ טריסין; מוסיפים 0.5 גרם של נתרן deoxycholate ו 0.2 גרם של maltoside lauryl לליטר חיץ. להתאים את ה- pH ל 7.0 ב 4 ° C ולאחסן ב 4 ° C.
      2. עבור BN PAGE, השתמש 7.5 mM imidazole ו 50 מ"מ טריסין ולהתאים את ה- pH ל 7.0 ב 4 מעלות צלזיוס. חנות ב 4 ° C.
      3. עבור חיץ כחול BN כחול BN, להשתמש 7.5 מ"מ imidazole ו 50 מ"מ טריסין. להתאים את ה- pH ל 7.0 ב 4 ° C ולהוסיף 20 מ"ג של קומאסי לליטר חיץ. חנות ב 4 ° C.
    3. הכן חיץ מיצוי (EB) עם 50 מ"מ NaCl, 50 מ"מ imidazole, 2 מ"מ חומצה aminocaproic, ו 1 מ"מ EDTA. להתאים את ה- pH ל 7.0 ב 4 ° C ולאחסן ב 4 ° C.
    4. הכן חיץ ג 'ל 3x (המשמש BN ו- CN ג'ל) עם 75 מ"מ imidazole ו 1.5 M חומצה אמינאקפרואית. להתאים את ה- pH ל 7.0 ב 4 ° C ולאחסן ב 4 ° C.
    5. הכנת חיץ טוען (LB) של 0.01 גרם של Ponceau S, 5 גרם של גליצרול, ו 5 מ"ל של H 2 O. חנות בחדרטֶמפֶּרָטוּרָה.
    6. הכן קומאסי כחול על ידי הוספת 50 מ"ג של קומאסי ל 1 מ"ל של 500 מ"מ 6-aminohexanoic חומצה. להתאים את ה- pH ל 7.0 ב 4 ° C ולאחסן ב 4 ° C.
    7. הכן 20 מ"מ ו 200 מ"מ lauryl maltoside ב H 2 O. לעשות aliquots של 200 μL ולאחסן אותם קפואים. להפשיר את חומר הניקוי לפני השימוש.
3% עד 8% (מיני) 4% עד 10% (מקסי)
0.5 ג 'ל (אור) 0.5 ג'ל (כבד) 0.5 ג 'ל (אור) 0.5 ג'ל (כבד)
AAB (mL) 0.42 1.3 2.5 7.7
CN / BN חיץ (מ"ל) 1.6 1.6 8.5 8.5
H 2 O (mL) 2.7 1.4 14 6.3
גליצרול (ז) 0 0.47 0 2.5
נפח (מ"ל) 4.72 4.77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

טבלה 1: כמויות של החומרים הדרושים לשפוך 1 מיני או Maxi-PAGE. הכרכים המשמשים בטבלה זו מחושבים עבור 1 מיני או 1 מקסי ג 'ל, 1.5 מ"מ עובי. נפח AAB מבוסס על פתרון המניות 40%. אור וכבד מתייחסים לריכוזיון של AAB. APS ו TEMED מתווספים לאחר כל עמודה של מערבל שיפוע מלא פתרון AAB.

  1. לשפוך ולהפעיל ג'לים
    הערה: השתמש 3-8% או 4-10% acrylamide / bisacrylamide (AAB) שיפוע עבור CN או BN ג'ל, בהתאמה. טבלה 1 מסכמת את כמויות של חיץ, AAB, H 2 O, גליצרול, ammoniumpersulfate (APS) ו tetramethylethylenediamine (TEMED) המשמש מיני ג'ל (85 מ"מ רוחב x 73 מ"מ גבוה x 1.5 מ"מ עובי) או מקסי ג 'ל (160 מ"מ רוחב x 200 מ"מ גבוה x 1.5 מ"מ עובי). הרכבות של צלחות זכוכית עם ג'ל CN או BN ניתן קירור בשקית עם כמה מ"ל של חיץ 1x ג'ל או עטוף במגבת נייר הרטובות עם חיץ 1x ג'ל לאחסון. הג'לים יציבים לשימוש עד שבוע.
    1. כדי לשפוך את הג'ל, במקום מערבל שיפוע על צלחת מערמת מוגבה על מנת להבטיח כי ג'ל יזרום על ידי כוח הכבידה לתוך החדר ג'ל מוכן.
    2. ממלאים את החדר outflow של מערבל שיפוע עם 4.77 / 25 מ"ל (מיני / מקסי) של הפתרון הכבד (עם ריכוז גבוה יותר של AAB).
    3. בעדינות לפתוח את הזין להפסיק את הקשר בין החדר הכבד האור לאפשר טיפה של פתרון לעבור לצד השני.
      הערה: זה דוחף בועות אוויר מן הצינור המחבר ואת הזין להפסיק, אשר ימנע זרימה בין שני החדרים. זה לא יכול להיעשות אם שני הצדדים כבר מלאים, כי הלחץ שווה ימנע את הבועה לעבור.
    4. ממלאים את החדר השני של מערבל שיפוע עם 4.72 / 25 מ"ל (מיני / מקסי) של הפתרון האור.
    5. מניחים בר במערב בתא החוצה עם פתרון כבד להתחיל לערבב. השתמש מהירות מערבל בר זה לא גורם מבעבע.
    6. להוסיף במהירות APS ו TEMED לכל חדר ליזום פילמור.
    7. פתח את החיבור בין שני החדרים של מערבל שיפוע ולאפשר ערבוב במשך כמה שניות לפני פתיחת החדר יצוא לשפוך את הג'ל.
      הערה: כוח הכבידהLl לתרוקן בשני החדרים באופן שווה, ערבוב של אור לתוך הפתרון הכבד יהיה לאט להקטין את הצפיפות acrylamide מלמטה עד החלק העליון של הג'ל. השתמש בתוכן כולו כי הוא מערבל שיפוע לשפוך את הג'ל.
      1. בסוף, בזהירות הר מסרק, עם הבארות בתוך הג 'ל, כדי למנוע בועות שכבת ערבוב.
    8. מיד לשטוף את מערבל שיפוע עם אתנול לשטוף את כל הג'ל. יש לשטוף במים ולשפוך את הג'ל השני. בואו ג 'לים לפזר (בדרך כלל פחות מ 20 דקות נדרש מיני ג'לים).
    9. כדי להפעיל את ג 'לים, הר אותם לתוך מהדק הרכבה אלקטרודה ולמלא את החדר / החדר העליון עם CN או כחול בהיר BN cathode חיץ. המתן כמה דקות כדי לבדוק דליפות לפני הוספת חיץ באנודה לתא החיצוני / התחתון.
      1. בעדינות לשלוף היטב מסרקים לשטוף את הבארות עם חיץ קטודה באמצעות מזרק או פיפטה.
      2. הפעל את הג'לים בחדר קר (4 מעלות צלזיוס) או ארוז לחלוטין בקרח.
        1. עבור CN mini-PAGE, השתמש 100 V עבור השעה הראשונה ו 200 V עד סיים, בדרך כלל נוסף 1-1.5 ח. לחלופין, הפעל את CN-mini PAGE ב 30-40 V למשך הלילה.
          הערה: ההתמקדות כאן היא על מורכבות חלבון מולקולרית גבוהה, כך מתחמי חלבון עם משקל מולקולרי של פחות מ 140 kDa ייגמר של הג'ל. זמני ריצה קצרים יותר עבור אלקטרופורזה ניתן להשתמש כדי לשמור על מתחמי משקל נמוך מולקולרי.
        2. עבור BN maxi-PAGE, השתמש 100 V ולהפעיל את הג'לים לילה (כ -18 שעות).
          הערה: הנוכחי יהיה נמוך מאוד (<15 mA), ולכן ספק כוח שיכול להתמודד עם תנאים אלה נדרשת. בשלב זה, ג 'ל ניתן להשתמש IGA או immunoblotting. במקרים מסוימים, להקות או נתיבים ניתן לחתוך מתוך ג'לים באמצעות סכין גילוח על צלחת זכוכית עבור electroelution.
  2. הכנת דוגמאות
    הערה: יש לחילוץ מלקטורי סופר-קומפלקסים של המיטוכונדריהקרום מיטוכונדריאלי פנימי. כדי לשמור על supercomplexes המיטוכונדריה, להשתמש או מיטוכונדריה מבודדים טרי או דגימות כי הוקפאו והפשר רק פעם אחת. החישובים / כרכים להלן ניתנים מיני ג'ל (היטב של מסרק היטב 10-ב ג'ל 1.5 מ"מ עובי מחזיק עד 35-40 μL) ו maxi- ג'לים (היטב מסרק 15-היטב מחזיקה עד 200 μL). בנוסף, שמור aliquot של כל מדגם (בדרך כלל 10 μL), כדי להיות מופעל על ג'ל SDS denaturing לאיתור של ערוץ אניון תלוי מתח (VDAC), כבקרה טוען.
    1. מניחים את הכמות המתאימה ( למשל, 10-50 מיקרוגרם של חלבון מיני ג'ל ו 50-200 מיקרוגרם עבור מקסי ג'ל) של המיטוכונדריה מבודד או homogenate רקמות microtubes ו צנטריפוגות ב XG 17,000 במשך 10-15 דקות ב 4 ° C.
      הערה: שלב זה מסיר חלק מטריקס המיטוכונדריה מסיסים ו / או חלבונים cytosolic.
    2. לשאוב ולזנוח supernatant ולהוסיף חיץ החילוץ לסכום הרצויכדי לטעון על הג'ל. בעדינות resuspend המשקע על הקרח. אם תרצה, להוסיף תערובת מעכב פרוטאז כללי בשלב זה.
      הערה: בהתבסס על הציוד המשמש כאן, 30 μL שימש מיני ג'ל ו 100 μL עבור מקסי ג'ל, הגבלת יחס חלבון / חיץ לא יותר מ 2 מיקרוגרם של חלבון ל 1 μL של חיץ.
    3. הוסף חומר ניקוי ( למשל, 2 מיקרוגרם של maltoside lauryl / 1 מיקרוגרם של חלבון, לראות את תוצאות נציג ודיון לקבלת מידע נוסף).
      הערה: בדרך כלל, lauryl maltoside משמש, אבל digitonin עשוי לשמש גם.
    4. דגירה על קרח במשך 20 דקות. מערבבים בעדינות בהתחלה ומדי פעם במהלך הדגירה על ידי triturating ו / או agitating את הצינור.
    5. צנטריפוגה ב XG 17,000 במשך 10 דקות על 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר כל שברים רקמות קרום.
    6. מעבירים את supernatant לצינור חדש. עבור דגימות CN, להוסיף 1 μL של LB עבור כל 10 μL של נפח המדגם; את הנפח הכולל של המדגם צריך להיות App40 μL בערך מיני ג'ל ו 130 μL עבור מקסי ג'ל. עבור דגימות BN, הוסף Coomassie לדגימות כך יחס של צבע על חומר ניקוי הוא 1: 4 (w / w).
    7. טען 30 ו 120 μL של דגימות לתוך הבארות של מיני או מקסי ג'ל, בהתאמה. השתמש 10 μL הנותרים מדגם זה עבור ג'ל SDS denaturing לאיתור VDAC כמו בקרת טעינה.
    8. כדי להכין את סמנים משקל מולקולרי, להמיס 1 בקבוקון של תערובת גבוהה משקל מולקולרי משקל כיול (ראה טבלה של חומרים לקבלת מידע נוסף) ב μL 60 של חיץ BN / CN ג'ל ולהוסיף 120 μL של H 2 0 ו 20 μL של LB. טען 15 μL לכל נתיב.
    9. הפעל את הג'לים כפי שמתואר בשלב 1.2.9.2.

2. ב-מבחני ג'ל עבור Cx-I ו- Cx-V

הערה: מבחני מבוצעים בטמפרטורת החדר. צלם תמונות, סריקות או תמונות של להקות מתפתחות עבור תיעוד. (חשוב) חלבונים לא יכול להיות מועבר ontO nitrocellulose ממברנות לאחר השלמת IGA.

  1. CX-I assay
    1. הכנה.
      1. הכן חיץ assay של 5 מ"מ טריס ב H 2 O, עם pH של 7.4; החנות בטמפרטורת החדר.
      2. ממיסים 10 מ"ג של NADH ב 1 מ"ל של חיץ assay. חנות aliquots של μL 100 ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש; להימנע מקפיא והפשרה.
      3. שוקלים 25 מ"ג של nitroblue tetrazolium לתוך microtube.
      4. הכן את מקבע על ידי דילול 5 מ"ל של חומצה אצטית ב 95 מ"ל של H 2 O; החנות בטמפרטורת החדר.
    2. ביצוע assay.
      1. שלב 10 מ"ל של חיץ assay עם 25 מ"ג של nitroblue tetrazolium (ריכוז סופי: 2.5 מ"ג / מ"ל) ו 100 μL של 10 מ"ג / מ"ל ​​NADH (0.1 מ"ג / מ"ל). הוסף את זה ג'ל כולו, נתיב, או תחום עניין הוסרו מן ג'ל CN.
        הערה: זה יכול להיעשות בתוך פלסטיק ברור או מיכל זכוכית. שים לב assay זה לא יכול להתבצע לאחר BN PAGE.
      2. בצע את הפיתוח של להקות כחולות לאחר תסיסה עדינה (נדנדה) במשך 3 דקות.
      3. תקן את הג'ל 10 - 20 מ"ל של תמיסת חומצה אצטית או לשטוף ב 5 מ"מ טריס, pH 7.4 כדי לעצור את התגובה. לצלם תיעוד (ראה טבלה של חומרים).
  2. Assay Cx-V
    הערה: assay Cx-V צריך להיעשות באמצעות CN או BN כפולים ג'ל, שבו אחד מודגרת עם 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​oligomycin (מעכב Cx-V) כדי להדגים פעילות Cx-V עצמאית.
    1. הכנה.
      1. הכן חיץ assay עם 35 מ"מ טריס ו 270 מ"מ גליצין; להתאים את ה- pH ל 8.3 בטמפרטורת החדר. חנות למאגר קפוא ב 50 מ"ל aliquots, אבל לבדוק את ה- pH לאחר הקפאה להפשיר.
      2. הכן 1 M MSOSO 4 ב H 2 O; חנות ב 4 ° C עד לשימוש.
      3. לשקול 27.28 מ"ג של Pb (NO 3 ) 2 לתוך microtube.
      4. לשקול 60 מ"ג של ATP לתוך microtube.
      5. ממיסים 1 מ"ג של oליגומיצין ב 1 מ"ל של אתנול. חנות ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      6. הכן מקבע על ידי ערבוב 50 מ"ל של מתנול עם 50 מ"ל של H 2 O; החנות בטמפרטורת החדר.
    2. ביצוע assay.
      1. דגירה ג'ל, נתיב, או אזור עניין של BN או ג'ל CN במשך 2 שעות עם תסיסה עדינה (נדנדה) ב 10-20 מ"ל של חיץ assay ± 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​oligomycin (50-100 μL של 1 מ"ג / מ"ל באתנול) בטמפרטורת החדר.
      2. לאחר הדגירה, להחליף את המאגר עם 14 מ"ל של חיץ assay טרי להוסיף, על מנת, 190 μL של 1 M MSOSO 4 (14 מ"מ), 27.28 מ"ג של Pb (NO 3 ) 2 (5 מ"מ), 60 מ"ג של ATP 8 מ"מ), ו 75 μL של אוליגומיצין (במידת הצורך).
      3. דגירה עם תסיסה עדינה (נדנדה) ולצפות משקע לבן, כמו להקות על oligomycin שטופלו ג'לים ייתן שאינם CX-V תלוי הלהקות.
        הערה: המראה של המשקע עשוי להימשך מספר שעות.
      4. תקן את הג'ל ב- methanol-( למשל, 50% מתנול), כי פתרונות חומצי יהיה להמיס את המשקע להוביל. צלם את התוצאות.
        הערה: משקע להוביל אינו מפריע מכתים של ג 'ל קומסי.

3. העברת חלבון ל Nitrocellulose או Polyvinylidene Difluoride (PVDF) ממברנות

  1. הכן מאגר חיץ של 25 מ"מ טריס ו 200 מ"מ גליצין. להתאים את ה- pH ל 8.3 ולהוסיף 0.0005 גרם / L SDS ו 200 mL / L מתנול. חנות בטמפרטורת החדר.
    1. חותכים nitrocellulose או קרום PVDF (גודל הנקבוביות: 0.45 מיקרומטר) עם סכין גילוח או מספריים לגודל מעט גדול יותר מזה של הג'ל.
      הערה: ניטרוסלולוזה ממברנות לאפשר Ponceau S מכתים כדי להעריך את טעינת חלבון, בעוד ממברנות PVDF תשואה יותר להקות מוגדר בחדות.
  2. פרוטוקול.
    1. משרים את קרום nitrocellulose, נייר הסינון, ואת sponges עבורלא לפחות 10 דקות במאגר ההעברה. מניחים את קרום PVDF ב מתנול 100% עבור 15 s או על פי המלצת היצרן לפני הצבתו במאגר ההעברה. מניחים את קלטת פתוחה של ערכת ההעברה לתוך קערה שטוחה עם חיץ העברה.
    2. מניחים את ספוג 1-2 שכבות של נייר סינון בצד האחורי של הקלטת. הסר את הבועות.
    3. מניחים את הג'ל על נייר הסינון. ציין את הכיוון של ג'ל על ידי גזירת פינה של ג'ל ו / או את הממברנה.
    4. מניחים את הממברנה על גבי הג'ל. הסר את כל הבועות.
    5. מניחים נייר סינון וספוג על גבי הממברנה. הסר את כל הבועות בסנדוויץ 'זה.
    6. סגרו את הקלטת והכניסו אותה לתוך מחזיק הקלטת של ערכת ההעברה.
    7. מעבירים את החלבונים ב 25 V בערך 12-18 שעות.

4. Immunoblotting

  1. הכנה.
    1. הכן כתם פונצ'ו (500 מ"ל) על ידי הוספת 25 מ"לשל חומצה אצטית ו 0.5 גרם של Ponceau S ל 475 מ"ל של H 2 O; החנות בטמפרטורת החדר (ניתן לעשות בה שימוש חוזר).
    2. הכן טריס שנאגרו מלוחים (TBS) עם 200 מ"מ NaCl, 25 מ"מ טריס Base, ו 2.7 מ"מ KCl. להתאים את ה- pH ל 8.0 ו לאחסן בטמפרטורת החדר.
    3. הכן TBS-tween (TBST) על ידי הוספת 0.5 מ"ל / L Tween 20 כדי TBS; החנות בטמפרטורת החדר.
    4. הכן מוצקים חלב / TBST ידי המסת 5 גרם של מוצקים חלב ב 100 מ"ל של TBST. חנות ב 4 ° C ולהשתמש בתוך 3 ימים.
    5. הכן BSA / TBST ידי המסת 3 גרם של אלבומין בסרום שור (BSA, חלק V) ב 100 מ"ל של TBST. חנות ב 4 ° C ולהשתמש בתוך 3 ימים.
  2. פרוטוקול.
    1. כאשר ההעברה הסתיימה, למקם את הממברנה לתוך פתרון Ponceau S לדמיין את כל החלבונים שהועברו. תווית את המיקום של סמנים על הממברנה עם עיפרון ולתעד את הממברנה פונצ'ו- S מוכתם על ידי צילום או לסרוק.
    2. לשטוף את הממברנה 3 פעמים במשך 10 דקות כל wiTBS תחת תסיסה עדינה.
    3. לחסום את הממברנה עם מוצקים חלב / TBST עבור 1-2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה בחדר קר עם תסיסה עדינה.
    4. לשטוף את הממברנה במשך 10 דקות עם TBST תחת תסיסה עדינה.
    5. דגירה עם נוגדן ראשוני בן לילה בחדר קר תחת תסיסה עדינה. לדלל את הנוגדנים ( למשל, 1: 1000 עבור אנטי ATP5A ו - NDUFB6) ב BSA / TBST.
      הערה: נוגדנים ביותר לתת איתות טוב יותר על ממברנות מ ילידים ג'ל כאשר מודגרת בן לילה.
    6. לשטוף את הממברנה במשך 10 דקות עם TBST תחת תסיסה עדינה.
    7. דגירה עם נוגדן משני לפחות 60 דקות בטמפרטורת החדר uner עדין תסיסה. לדלל את הנוגדנים (1: 5,000-1: 50,000) ב מוצקים חלב / TBST.
    8. לשטוף את הממברנה 3 פעמים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם TBST תסיסה עדינה.
    9. במהלך הכביסה האחרונה, להכין את המצע chemoluminesencence משופר (ECL) על פי הוראות של manufaCturer.
    10. דגירה את הממברנה עם מצע ECL באמצעות הוראות המסופקים על ידי היצרן.
    11. לזהות את האות על הסרט באמצעות הוראות שסופקו על ידי היצרן של המצע ECL.

5. Electroelution

  1. הכנה.
    1. הכן חיץ elution של הטריסין 25 מ"מ, 3.75 mM imidazole (pH 7.0 ב 4 מעלות צלזיוס), ו 5 mM 6-aminohexanoic חומצה.
      הערה: ללבוש כפפות בכל עת בעת הטיפול electroeluter ואת כובעי ממברנה כדי למנוע זיהום עם חלבונים חיצוניים.
  2. ביום לפני השימוש electroeluter עבור electroelution יליד, בצע את הפעולות הבאות:
    1. משרים את כובעי הממברנה (לחתוך את: 3.5 kDa) ב חיץ elution עבור 1 שעה ב 60 ° C. מעבירים את המכסים למאגר אלוטיון טריים ולספוג אותם במשך 12 שעות או יותר במקרר.
      הערה: חתך משקל מולקולרי של 3.5 kDa מונע את ההפסד של p קטןרוטינים שעשויים להתנתק בקלות ממכלול החלבון המעניין.
    2. שטפו את מודול electroeluter, צינורות זכוכית, טנק, ומכסה ביסודיות עם אתנול. יש לשטוף במים ולתת לציוד יבש.
  3. ביום electroelution יליד, בצע את הפעולות הבאות.
    1. מניחים frit בתחתית (מקפיא) של כל צינור זכוכית לשמש. אם יש צורך, במקום צינור זכוכית במאגר elution ולדחוף את frit מבפנים אל החלק התחתון של הצינור.
    2. דחוף את צינור הזכוכית עם frit לתוך המודול של electroeluter. רטוב את grommet עם חיץ elution ולהחליק את צינור זכוכית למקום. ודא כי צמרות של צינורות זכוכית הם אפילו עם grommet.
    3. סגור את grommets ריקים עם פקקים.
    4. מניחים כובע רטוב רטוב בחלק התחתון של מתאם הסיליקון ולמלא את המתאם עם חיץ elution. לאט לאט פיפטה המאגר במתאם למעלה ולמטה כדי להסיר בועות אוויר סביב קרום דיאליזה.
    5. החלק את המתאם המלא-חיץ לתחתית צינור הזכוכית. הסר את כל הבועות המופיעות על frit בתוך הצינור זכוכית.
    6. ממלאים כל צינור זכוכית עם חיץ elution.
    7. מניחים את להקות נכרת של דף BN לתוך צינורות זכוכית (ראה צעד 1.2.9.3). חותכים חתיכות גדולות לחתיכות קטנות יותר. ודא כי גובה מילוי בתוך צינור זכוכית הוא סביב 1 ס"מ.
    8. מניחים את כל המודול לתוך הטנק.
    9. הוסף על 600 מ"ל של חיץ elution קר הטנק. ודא כי מתאם סיליקון כובעים נמצאים במאגר כדי למנוע בועות בקרום דיאליזה.
    10. מניחים בסיר במערב בתחתית הטנק.
      הערה: ערבוב ימנע בועות מלהידבק לתחתית הממברנה הדיאליזה.
    11. Elute חלבונים במשך 4 שעות ב 350 V בחדר קר.
    12. לאחר השלמת האלוטיון, הסר את מודול electroeluter מן הטנק חיץ ומכניסים אותו לכיור או קערה.
    13. אם נעשה שימוש בפקק, הסר אותו לגרורבתא העליון המאגר. אחרת, להשתמש פיפטה גדולה להסיר את המאגר.
    14. הסר את המאגר מכל צינור זכוכית וזורקים. ודא כי מתאם הסיליקון נשאר במקום וכי הנוזל מתחת לפריט אינו מוטרד או מזועזע.
    15. בזהירות להסיר את מתאם הסיליקון, יחד עם מכסה הממברנה מלמטה של ​​צינור זכוכית. פיפטה את התוכן (כ 400 μL) של מכסה סיליקון לתוך microtube. עם עוד 200 μL של חיץ elution, לשטוף את מכסה הסיליקון ולהוסיף microtube. חזור על כל צינורות זכוכית.
    16. כמו בקבוקים ממברנה ניתן לעשות שימוש חוזר, לשמר את המכסות קרום ידי הצבת אותם למאגר elution המכיל 0.5 מ"ג / מ"ל ​​כספית נתרן. קירור אותם.
      הערה: eluate יש ריכוז חלבון נמוך יכול להיות מרוכז באמצעות מסנן צנטריפוגלי התקנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להמחיש supercomplexes המיטוכונדריה, המיטוכונדריה מבודדים טרי מן העכברים היו בשימוש 17 , 18 . Supercomplexes מיטוכונדריאלי רגישים מחזורי חוזרות ונשנות של הקפאה והפשרה, המוביל להתפוררות שלהם, אם כי זה עשוי להיות נסבל עבור כמה חוקרים. אם הקפאה יש צורך לאחסון, כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר, דגימות לא צריך לעבור יותר ממחזור אחד של הקפאה להפשיר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A פונקציונלי ETC הוא הכרחי עבור הדור המיטוכונדריה ATP. קומפלקסים של ETC מסוגלים ליצור שני סוגים של supercomplexes: respirasomes (Cx-I, IIII, ו- IV) 1 ואת synthasomes (Cx-V) 2 . הרכבה של כל מורכבות נדרשת עבור ETC שלם, בעוד הארגון של ETC לתוך supercomplexes נחשב להגביר את יעילות ETC הכוללת 5 , 22 . איך אלה supercomplexes להרכיב ולפרק אינו מובן היטב, אבל הפרוטוקולים המוצגים כאן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן השותף האמריקאי של איגוד הלב של שותף [12GRNT12060233] ואת חזקה לילדים מרכז המחקר באוניברסיטת רוצ'סטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תא מיני ג'ל Protean IIBiorad1658004סט שלם למזיגה והפעלה של אלקטרופורזה מיני ג'ל
Protean XL מקסי-ג'לBiorad 1653189סט שלם למזיגה והפעלה של אלקטרופורזה מקסי-ג'ל
יצרנית שיפוע, Hoefer SG15VWR95044-704מזיגת מיני ג'ל שיפוע
יצרנית שיפוע, מקסי-ג'לVWRGM-100מזיגת מקסי-ג'ל ערכת העברת שיפועים
Biorad1703930סט שלם להעברה רטובה של חלבונים על ממברנות
דגם Electroeluter 422Biorad1652976אלקטרו-אללוציה של חלבונים מלוחות זכוכית מקוריים או SDS PAGES
צלחות1653308Biorad לוחות קצרים
לוחות זכוכיתBiorad1653312לוחות מרווח
זכוכיתBiorad1651823לוחות פנימיים
לוחות זכוכיתBiorad1651824לוחות חיצוניים
ספק כוחBiorad1645070ספק כוח מתאים לאלקטרופורזה מקורית
ECL-Western Thermo Scientific32209מצע Chemolumniscense
SuperSignal-West DuraThermo Scientific34075מצע כימולומניצנס משופר
סרט/אוטורדיוגרפיה סרטGE HealthCare 28906845תיעוד של כתמים מערביים
מעבד סרטים CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640 CanonNAצילום תמונות לתיעוד ג'לים, ממברנות וכתמים.
קולט אדים למצלמה Canon Power Shot 640 של Canonלתמונות שצולמו על שולחן אור
אקרילאמיד/ביסקרילאמידBiorad1610148תמיסה מעורבבת מראש 40%
גליציןסיגמאG7403
SDS (נתרן דודציל סולפט)Invitrogen15525-017
Tris-baseSigmaT1503Buffer
TricineSigmaT0377
נתרן דאוקסיצ'לאטSigmaD66750חומר ניקוי
EDTASigmaE5134
סוכרוזSigmaS9378
MOPSSigmaM1254מאגר
סיגמאI15513מאגר
לאוריל מלטוסידSigmaD4641חומר ניקוי
Coomassie G250Biorad161-0406
חומצה אמינוהקסנואיתSigmaO7260
מקורית  ערכת משקל מולקולריGE שירותי בריאות 17-0445-01ערכת קליבריטיזציה במשקל מולקולרי גבוה לאלקטרופורזה מקורית.
שםחברהמספר קטלוגיהערות
NADHSigmaN4505
Nitroblue tetrazoliumSigmaN6639
Tris HClSigmaT3253
ATP   סיגמאA2383
<חזק>שם<חזק>חברה><חזק>מספר קטלוגי><חזק>הערות
עופרת(II) חנקתית (Pb(NO3)2):Sigma228621
OligomycinSigmaO4876
שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
Ponceau SסיגמאP3504
אנטי-ATP5AAbcamab14748נוגדן לתת-יחידה ATP סינתאז ATP5A
אנטי-NDUFB6Abcamab110244נוגדן לתת-יחידה Cx-1 NDUFB6
anti-VDACCalbiochem529534נוגדן ל-VDAC
ECL HRP נוגדן מקושרHealth CareNA931Vנוגדן משני ל-ATP5A, NDUFB6 ו-VDAC
מגיב חוסםBiorad170-6404
BSA
נתרן כלוריSigmaS9888
אשלגן כלוריSigmaP9541
EGTASigmaE3889
NameCompanyCatalog Number>Comments
Silver צביעת KitInvitrogenLC6070
לוחות זכוכית לוחות מצלמת מיגון GE

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330(2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Mitochondrial SupercomplexesBlue Native PAGEImmunoblottingProtein Complex AssemblyMitochondrial BiologyMitochondrial Isolation

מאמרים קשורים