פרוטוקול זה מתאר את ההפרדה של מיטוכונדריאלי תפקודי שרשרת התחבורה אלקטרונים מתח (Cx) IV ו supercomplexes מהם באמצעות אלקטרופורזה יליד לחשוף מידע על הרכבה שלהם המבנה. ג'ל הילידים יכול להיות נתון immunoblotting, מבחני ג'ל, וטיהור על ידי electroelution כדי לאפיין עוד קומפלקסים בודדים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג'ל, ו Electroelution
במאמר זה
סיכום
תקציר
רשת ההולכה המיטוכונדריאלית (ETC) מייצרת את האנרגיה הנגזרת מהתפלגות של דלקים שונים למטבע הביו-אנרגטי של התא, ATP. ה- ETC מורכב מ -5 מתחמי חלבון מסיבי, אשר גם להרכיב סופר קומפלקסים הנקראים respirasomes (CI, C-III, ו- C-IV) ו synthasomes (קורות חיים) המגבירים את היעילות של התחבורה אלקטרונים הייצור ATP. שיטות שונות שימשו במשך למעלה מ -50 שנה כדי למדוד את הפונקציה ETC, אבל פרוטוקולים אלה אינם מספקים מידע על הרכבה של קומפלקסים בודדים supercomplexes. פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה של ג 'ל הילידים polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (PAGE), שיטה ששונה לפני יותר מ -20 שנה ללמוד מבנה מורכבים ETC. יליד אלקטרופורזה מאפשר הפרדה של מתחמי ETC לתוך צורות פעיל שלהם, ואז קומפלקסים אלה ניתן ללמוד באמצעות immunoblotting, מבחני ג'ל (IGA), וטיהור על ידי electroelution. על ידי שילוב מחדשSults של ג 'ל הילידים PAGE עם אלה של מבחני המיטוכונדריה אחרים, ניתן להשיג תמונה completer של פעילות ETC, הרכבה דינמי שלה פירוק, וכיצד זה מווסת מבנה המיטוכונדריה ותפקוד. עבודה זו תדון גם במגבלות של טכניקות אלה. לסיכום, הטכניקה של הילידים PAGE, ואחריו immunoblotting, IGA, electroelution, המוצגת להלן, היא דרך רבת עוצמה לחקור את הפונקציונליות ואת ההרכב של supercomplexes המיטוכונדריה ETC.
מבוא
אנרגיה מיטוכונדריאלית בצורה של ATP אינה חיונית רק להישרדות התא, אלא גם להסדרת מוות התא. הדור של ATP על ידי זירזון חמצוני דורש שרשרת תובלה אלקטרונית תפקודית (ETC, Cx-I ל- IV) ו synthase ATP המיטוכונדריה (Cx-V). מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי אלה קומפלקסים חלבונים גדולים מאורגנים supercomplexes, נקרא respirasomes ו synthasomes 1 , 2 . זה מאתגר לנתח את הרכבה, דינמיקה, ויסות הפעילות של אלה קומפלקסים מסיבי supercomplexes. בעוד מדידות צריכת חמצן שנלקחו עם אלקטרודה חמצן מבחני אנזים שנערכו באמצעות ספקטרופוטומטר יכול לתת מידע בעל ערך על פעילות מורכבים ETC, מבחני אלה לא יכולים לספק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בוצעו באמצעות לבבות מ C57BL / 6N עכברים (סוג בר). עכברים היו מורדמים עם CO 2 לפני פריקה צוואר הרחם, וכל ההליכים בוצעו בהתאם קפדנית עם המחלקה של מעבדה לבעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר ועל פי החוק המדינה, החוק הפדרלי, ואת מדיניות NIH. הפרוטוקול אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש של אוניברסיטת רוצ'סטר (ועדת האוניברסיטה על בעלי חיים משאבים).
1. CN ו- BN PAGE
הערה: כל הציוד המשמש עבור BN ו- CN PAGE חייב להיות נטול חומר ניקוי. כדי להבטיח זאת, לשטוף את כל הציו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להמחיש supercomplexes המיטוכונדריה, המיטוכונדריה מבודדים טרי מן העכברים היו בשימוש 17 , 18 . Supercomplexes מיטוכונדריאלי רגישים מחזורי חוזרות ונשנות של הקפאה והפשרה, המוביל להתפוררות שלהם, אם כי זה עשוי להיות נסבל עבור כמה חוקרים. אם הקפאה יש צורך לאחסון, כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר, דגימות לא צריך לעבור יותר ממחזור אחד של הקפאה להפשיר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
A פונקציונלי ETC הוא הכרחי עבור הדור המיטוכונדריה ATP. קומפלקסים של ETC מסוגלים ליצור שני סוגים של supercomplexes: respirasomes (Cx-I, IIII, ו- IV) 1 ואת synthasomes (Cx-V) 2 . הרכבה של כל מורכבות נדרשת עבור ETC שלם, בעוד הארגון של ETC לתוך supercomplexes נחשב להגביר את יעילות ETC הכוללת 5 , 22 . איך אלה supercomplexes להרכיב ולפרק אינו מובן היטב, אבל הפרוטוקולים המוצגים כאן .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן השותף האמריקאי של איגוד הלב של שותף [12GRNT12060233] ואת חזקה לילדים מרכז המחקר באוניברסיטת רוצ'סטר.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תא מיני ג'ל Protean II | Biorad | 1658004 | סט שלם למזיגה והפעלה של אלקטרופורזה מיני ג'ל |
| Protean XL מקסי-ג'ל | Biorad 1653189 | סט שלם למזיגה והפעלה של אלקטרופורזה מקסי-ג'ל | |
| יצרנית שיפוע, Hoefer SG15 | VWR | 95044-704 | מזיגת מיני ג'ל שיפוע |
| יצרנית שיפוע, מקסי-ג'ל | VWR | GM-100 | מזיגת מקסי-ג'ל ערכת העברת שיפועים |
| Biorad | 1703930 | סט שלם להעברה רטובה של חלבונים על ממברנות | |
| דגם Electroeluter 422 | Biorad | 1652976 | אלקטרו-אללוציה של חלבונים מלוחות זכוכית מקוריים או SDS PAGES |
| צלחות | 1653308 | Biorad לוחות קצרים | |
| לוחות זכוכית | Biorad | 1653312 | לוחות מרווח |
| זכוכית | Biorad | 1651823 | לוחות פנימיים |
| לוחות זכוכית | Biorad | 1651824 | לוחות חיצוניים |
| ספק כוח | Biorad | 1645070 | ספק כוח מתאים לאלקטרופורזה מקורית |
| ECL-Western | Thermo Scientific | 32209 | מצע Chemolumniscense |
| SuperSignal-West Dura | Thermo Scientific | 34075 | מצע כימולומניצנס משופר |
| סרט/אוטורדיוגרפיה סרט | GE Health | Care 28906845 | תיעוד של כתמים מערביים |
| מעבד סרטים CP1000 | Agfa | NC0872640 | |
| Canon Power Shot 640 | Canon | NA | צילום תמונות לתיעוד ג'לים, ממברנות וכתמים. |
| קולט אדים למצלמה Canon Power Shot 640 | של Canon | לתמונות שצולמו על שולחן אור | |
| אקרילאמיד/ביסקרילאמיד | Biorad | 1610148 | תמיסה מעורבבת מראש 40% |
| גליצין | סיגמא | G7403 | |
| SDS (נתרן דודציל סולפט) | Invitrogen | 15525-017 | |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Buffer |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| נתרן דאוקסיצ'לאט | Sigma | D66750 | חומר ניקוי |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| סוכרוז | Sigma | S9378 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | מאגר |
| סיגמא | I15513 | מאגר | |
| לאוריל מלטוסיד | Sigma | D4641 | חומר ניקוי |
| Coomassie G250 | Biorad | 161-0406 | |
| חומצה אמינוהקסנואית | Sigma | O7260 | |
| מקורית ערכת משקל מולקולרי | GE שירותי בריאות | 17-0445-01 | ערכת קליבריטיזציה במשקל מולקולרי גבוה לאלקטרופורזה מקורית. |
| שם | חברה | מספר קטלוגי | הערות |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| Nitroblue tetrazolium | Sigma | N6639 | |
| Tris HCl | Sigma | T3253 | |
| ATP | סיגמא | A2383 | |
| <חזק>שם< | חזק>חברה | ><חזק>מספר קטלוגי | ><חזק>הערות |
| עופרת(II) חנקתית (Pb(NO3)2): | Sigma | 228621 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| Ponceau S | סיגמא | P3504 | |
| אנטי-ATP5A | Abcam | ab14748 | נוגדן לתת-יחידה ATP סינתאז ATP5A |
| אנטי-NDUFB6 | Abcam | ab110244 | נוגדן לתת-יחידה Cx-1 NDUFB6 |
| anti-VDAC | Calbiochem | 529534 | נוגדן ל-VDAC |
| ECL HRP נוגדן מקושר | Health Care | NA931V | נוגדן משני ל-ATP5A, NDUFB6 ו-VDAC |
| מגיב חוסם | Biorad | 170-6404 | |
| BSA | |||
| נתרן כלורי | Sigma | S9888 | |
| אשלגן כלורי | Sigma | P9541 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Name | Company | Catalog Number | >Comments |
| Silver צביעת Kit | Invitrogen | LC6070 |
מקורות
- Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
- Saks, V., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
