הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

סיכום

מחלות הקשורות לגיל קשורות למספר פגמים במרכיבי הציטופלזמה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת שלפוחית ​​הממברנה פלזמה מתאי גזע העצם mesenchymal. טכניקה זו יכולה לשמש כאמצעי טיפולי החלפת ציטופלסמה כדי לשפר או אפילו הפנוטיפים הקשורים לגיל הקשורים.

תקציר

יש לנו בעבר דיווחו על הדור של שלפוחית ​​הממברנה פלזמה (PMVs) באמצעות שחול מכני של תאים יונקים. היתוך של PMVs עם תאים Rho0 לקוי המיטוכונדריה משוחזרת פעילות מיטוטית בתנאים התרבות הרגילה. טרשת עורקים, סוכרת מסוג 2, מחלת האלצהיימר וסרטן הן מחלות הקשורות לגיל, אשר דווחו כי הן קשורות למספר פגמים מכניים ופונקציונליים בציטוזול ובאברונים של מגוון סוגי תאים. תאי גזע מוחיים mesenchymal (BMSCs) מייצגים אוכלוסיית תאים ייחודית ממח העצם, בעלת יכולות התחדשות עצמית, תוך שמירה על ריבוי המרכיבים שלהם. התוספת של תאים ההזדקנות עם cytoplasm צעירים מ BMSCs אוטולוגיים באמצעות היתוך של PMVs מספק גישה מבטיחה כדי לשפר או אפילו הפנוטיפים הקשורים לגיל הקשורים. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין PMVs מ BMSCs באמצעות שחול באמצעות קרום פוליקרבונט עם 31, נקבוביות, לקבוע את קיומה של המיטוכונדריה ולבחון את תחזוקת הפוטנציאל הממברנה בתוך PMVs באמצעות מיקרוסקופ confocal, להתרכז PMVs על ידי צנטריפוגה, ולבצע את הזרקת vivo של PMVs לשריר gastrocnemius של עכברים.

מבוא

כמות עצומה של מאמץ הוקדשה להקמת גישות לטיפול בגנים, באנזים ובתאי החלפת תאים. זה הביא פריצות דרך גדולות ואפילו יישומים קליניים ^{1 , 2 , 3} . לאחרונה, טיפול מחליף מיטוכונדריה שנוי במחלוקת המבוסס על טכנולוגיית העברת גרעין הוחל על הפריה חוץ גופית עבור נשים בגיל מבוגר או נושא מוטציה דנ"א מיטוכונדריאלית קטלנית ⁴ . פגמים שנמצאו במחלות הקשורות לגיל, כולל טרשת עורקים, סוכרת מסוג 2, מחלת האלצהיימר וסרטן, הם לרוב רב פנים. זה כבר מתועד כי הצטברות של טיפות השומנים; את התצהיר של חלבון עמילואיד; שימור חלבונים שהתגלגלו בתוך הרשת האנדופלסמית; ו פרוטאזום פגום, autophagosome, ו המיטוכונדריה לתרום להתפתחות או להחמרה של מחלות אלה"Xref"> 5 ^{, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} . כיום, אין מנגנון זמין שמטרתו תיקון ישיר של תקלה ב cytosol ו organelles, אשר גורם ההזדקנות ו פנוטיפים ההזדקנות.

יש לנו בעבר דיווחו על הדור של שלפוחית ​​הממברנה פלזמה (PMVs) באמצעות שחול מכני של תאים יונקים ¹² . למעט הגרעין, נמצאו המרכיבים בממברנה או בציטוסול, כולל חלבונים ורנ"א, כמו גם את האברונים, כמו המיטוכונדריה, ב- PMV. בעיקרו של דבר, PMV יכול להיחשב לתא אנקלאציה מיניאטורי. חשוב יותר, היתוך של PMVs עם תאים Rho0 לקוי המיטוכונדריה משוחזרת פעילות מיטוטית בתנאים התרבות הרגילה. זהו הדו"ח הראשון על establiShing גישה יעילה פוטנציאלית לטיפול החלפת ציטופלסמה.

תאי גזע מוחיים mesenchymal העצם (BMSCs) הם תאים אב multipotent כי הם נוצרים באופן שגרתי ממח העצם והם מורחבים בקלות בתרבות. תאים עובריים של תאי גזע Oct4, Nanog ו- SOX2 התגלו ברמות נמוכות ב- MSC ¹³ . פעילות הטלומראז ניתנת למדידה. בנוסף, היעדרם של מולקולות מעוררות-גומלין ומולקולות מחלקה II של לויקוציטים אנושיים (HLA), כמו גם ביטוי נמוך של HLA Class I ב- MSC, הופכים אותם לתאים אידיאליים לשימוש באלוגני או "מדף" רפואה משובי ויישומים אימונומודולטוריים ¹⁴ .

כאן, אנו מתארים כיצד להכין PMVs מ BMSCs העכבר באמצעות שחול באמצעות קרום פוליקרבונט עם 3 מיקרוגרם הנקבוביות, לקבוע את קיומו של המיטוכונדריה ולבחון את תחזוקת הפוטנציאל הממברנה ב PMVs באמצעות קונפוקאל מיקרוסקופיה, להכין מרוכזים אך לא מצטברים PMVs על ידי צנטריפוגה, ולבצע את הזרקת vivo של PMVs לשריר gastrocnemius של עכברים.

פרוטוקול

8 עד 12 שבועות BALB / c עכברים נרכשו מ שנחאי ניסיוני בעלי חיים מרכז (שנחאי, סין) וגדל ב פתוגן ללא מתקן ממוזג ללא תשלום. טיפול בבעלי חיים ונהלים ניסיוניים היו בקנה אחד עם הנחיות לשימוש וטיפול של חיות מעבדה שהוקמה על ידי אוניברסיטת שאנטו.

1. הרכבה של המנגנון

1. כדי להבטיח סטריליות, להדליק את האור UV של ברדס תרבות רקמה במשך 30 דקות לפני השימוש.
2. לפרק יחידת 25 מ"מ מסנן חד פעמיות להטביע את הכובע ואת החלק התחתון של היחידה לתוך כוס זכוכית 200 מ"ל מלא באתנול 75% במשך 30 דקות. היחידה מורכבת מפוליפרופילן רפואי.
3. להרים את הכובע ואת החלק התחתון של המכשיר באמצעות מלקחיים, לנער את האתנול הנותר ביד, ולאפשר את החלקים לאוויר יבש במשך 10 דקות במכסה המנוע.
4. רטוב 19 מ"מ קוטר פוליקרבונט ב PBS ומניחים אותו בזהירות על גבי המטריצה ​​התומכת של בוטומ 'של היחידה. הסרט פולימר יש משטח חלק, שטוח לעקוב חרוט 3 נקבוביות מיקרומטר.
5. הרכב מחדש את היחידה על ידי הברגה של הכובע בחוזקה על הקרקעית. ודא כי הממברנה אינה משוחררת מהמרכז.
6. הסר את המחט של מזרק 1 מ"ל אינסולין לצייר 1 מ"ל של PBS. צרף את המזרק ליחידת המסנן ולאחר מכן לדחוף PBS דרך היחידה כדי להרטיב את הרכבה כדי לבדוק אם יש דליפה כלשהי.

2. הדור של שלפוחית ​​קרום פלזמה (PMVs)

1. להקים תרבות BMSC, כפי שדווח על ידי Nemeth et al. ¹⁵ , במדיום התרבות DMEM המכיל 15% FBS ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין. לטפח את התאים בצלחת 6-היטב חממה humidified המכיל 5% CO ₂ ב 37 מעלות צלזיוס.
2. כדי להפיץ את התאים, להסיר את המדיום תרבות לשטוף היטב עם 0.5 מ"ל של סידן ללא PBS.
3. הוסף 0.5 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA ו דגירה התאים על 37 מעלות צלזיוסבמשך 3 דקות. הקש על צלחת על כף היד כמה פעמים כדי להקל על ניתוק התא. עצור עיכול על ידי הוספת 1 מ"ל של המדיום תרבות.
4. איסוף התאים צינור חרוטי 15 מ"ל ספין ב XG 200 דקות 2 בצנטריפוגה הדף הספסל. Resuspend התאים 4 מ"ל של המדיום תרבות aliquot התאים לתוך שתי בארות של צלחת 6-היטב.
   הערה: תאים מגיעים בדרך כלל ל -24 שעות.
5. כדי לייצר PMVs, קציר התאים מבאר אחד (כ 5 x 10 ⁵ תאים) של צלחת 6-היטב על ידי עיכול טריפסין monodisperse התאים 0.5 מ"ל של המדיום תרבות.
6. טען את התאים לתוך מזרק האינסולין, לצרף אותו יחידת מסנן, ולדחוף את הבוכנה במהירות כדי לסחוט את התאים דרך המסנן. מחק את המדיום extruded כי צריך להיות רק כמה PMVs בתוכו.
7. טען 0.5 מ"ל נוספת של המדיום לתוך המזרק במהירות לדחוף אותו דרך המסנן. אסף את המדיום של שחול השני, אשר מכיליםS PMVs בגודל שונה.
8. טען 150 μL של המדיום שנאסף לתוך צלחת זכוכית בתחתית 35 מ"מ ולאפשר PMVs להתיישב לתחתית במשך כ 10 דקות. לבחון את PMVs תחת מיקרוסקופ בניגוד שלב הפוכה מצויד במצלמת CCD באמצעות עדשה אובייקטיבית 20X.

3. בחינת התוכן בתוך PMVs באמצעות מיקרוסקופיה Confocal

1. כדי לבצע transfection ב BMSCs, לדלל 2 מיקרוגרם של DNA פלסמיד supercoiled ו 6 μL של מגיב transfection קטיוני ( למשל, PolyJet) ב 50 μL של DMEM חינם בסרום. מערבולת לערבב היטב ספין בקצרה לאסוף את כל הנוזל מן הצדדים של הצינור.
2. מוסיפים את הפתרון מדולל (מ שלב 3.1) dropwise לתוך פתרון DNA מדולל, מערבולת חזקה במשך 1 דקות, ספין בקצרה, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
3. החלף את המדיום הישן על BMSCs, אשר כבר seeded על 30% מפגש לילה, עם 2 מ"ל של מדיום תרבות טרי להוסיף DNתערובת transfection dropwise.
4. החלף עם 2 מ"ל של מדיום טרי לאחר 12 שעות של transfection.
5. כדי לעקוב אחר cytoplasmically חלבונים מקומיים, transfect התאים עם פלסמיד המכיל קלטת ביטוי EGFP (pEGFP-N1), כמתואר לעיל. קציר התאים על ידי עיכול טריפסין 48 שעות לאחר transfection עבור הדור PMV, כמתואר לעיל.
6. כדי לעקוב אחר המיטוכונדריה, כתם התאים עם צבע המיטוכונדריה (1 מיקרומטר, MitoTracker) במדיום תרבות טרי במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
7. כדי לזהות את הפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, כתם את התאים עם צבע cyanine JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetrachloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine יודיד) (10 מיקרוגרם / מ"ל) במדיום תרבות טרי 30 דקות ב 37 ° C.
   1. לשטוף את התאים עם 0.5 מ"ל של PBS שלוש פעמים ולאחר מכן למסוק את התאים על ידי עיכול טריפסין עבור הדור PMV, כמתואר לעיל.
   2. טען 150 μL של התרופות שנאספוIum לתוך צלחת זכוכית בתחתית 35 מ"מ ולאפשר PMVs להתיישב לתחתית במשך כ 10 דקות. לבחון את PMVs תחת מיקרוסקופ confocal באמצעות העדשה 100X שמן אובייקטיבי.
8. כדי לזהות EGFP או צבע המיטוכונדריה, להפעיל את הלייזר 488 ננומטר ולאסוף את האות ב 505-530 ננומטר. כדי לזהות JC-1, להפעיל את 488 ננומטר ו 543 ננומטר לייזרים ולאסוף אותות ב 505-530 ננומטר 560-615 ננומטר. הגדר את ערך החור ל -1.4.

4. הכנת PMVs מרוכזים על ידי צנטריפוגה

1. קציר התאים על ידי עיכול trypsin וליצור PMVs, כמתואר לעיל, ב 0.5 מ"ל של המדיום תרבות.
2. ספין PMVs ב 1200 xg בצנטריפוגה benchtop במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend גלולה μL 100 של המדיום תרבות עם סחרור עדין.
3. טען 50 μL של PMVs לתוך צלחת זכוכית בתחתית 35 מ"מ ולאפשר להם להתיישב בטמפרטורת החדר למשך כ 10 דקות. בחן את PMVsתחת מיקרוסקופ confocal באמצעות העדשה 40X שמן אובייקטיבי.
4. מוסיפים את הסדרה של polyethylenimine מדולל (PEI) פתרון לתרבות BMSC עבור 1 שעות ולבדוק סימנים של cytotoxicity.
   הערה: כאן, PEI ב 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​נבחר מאז שום סימן של רעילות זוהה BMSCs.
5. קציר התאים על ידי עיכול trypsin ולהוסיף PEI ב 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​במשך 1 שעות לחייב את קרום התא כאמצעי למניעת צבירה. ליצור PMVs, כמתואר לעיל, ב 0.5 מ"ל של המדיום תרבות. לרכז את PMVs ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ confocal, כמתואר לעיל.

5. הזרקה של PMVs לתוך שריר Gastrocnemius

1. כדי הכתם את הממברנה, להוסיף CM-DII (chloromethyl dialkyl-indocarbocyanine) (10 מיקרומטר) צבע 1 מ"ל של מדיום תרבות טרי BMSCs למשך 30 דקות.
2. קציר התאים (על 5 x 10 ⁵ ) על ידי עיכול טריפסין resuspend אותם 0.5 מ"ל של המדיום תרבות. הוסף PEI (2 מיקרוגרם / מ"ל) עבור 1ח. ליצור ולרכז את PMVs μL 100 של המדיום תרבות, כמתואר לעיל.
3. להרדים עכבר BALB / C על ידי הזרקת סודיום barbital (10 מ"ג / ק"ג) לאחר 12 שעות של צום.
4. נקה את החלק החיצוני של שריר gastrocnemius עם 75% אתנול. לאט לאט להזריק את PMVs (100 μL) לשריר gastrocnemius באמצעות מזרק 30 G אינסולין.
5. לאחר מתן ההרדמה, במקום גזה רטוב על העיניים למשך הניסוי ולחמם את העכבר עם אור ליבון עד שהוא מתעורר. בית העכבר לבד בכלוב אוורור הפרט.
6. כדי לקצור את שריר gastrocnemius 12 שעות לאחר הניתוח, להרוג את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
7. מפזרים 75% אתנול על שריר gastrocnemius, לפתוח את העור עם מספריים, לחתוך את שריר gastrocnemius כולו בשני הקצוות.
8. שוטפים את השריר עם PBS ולבחון אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות העדשה 20X אובייקטיבי.
9. לחתוך את השריר עםסכין גילוח חד להסיר את החלקים ללא פלואורסצנטי. חותכים את החלקים עם פלואורסצנטי אדום חזק לתוך כ 9 מ"מ ³ קוביות.
10. שבץ כל קובייה במדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלי (אוקטובר), לטבול אותו חנקן נוזלי במשך 5 דקות, ולאחסן אותו במקפיא -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
11. חותכים את החלקים הקפואים לחתיכות 20 מיקרומטר עבה באמצעות cryostat ו לדבוק כל קטע לשקופית זכוכית. שוטפים את החלק פעם עם PBS.
12. צייר מעגל סביב הקטע עם עט מעגל הכתם ולהוסיף 100 μL של DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל). לשאוב את הפתרון DAPI לאחר 10 דקות הדגירה בטמפרטורת החדר בחושך לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
13. זרוק הרכבה שמן על הדגימה, לכסות אותו עם להחליק זכוכית, ואת החותם את השקופית עם לק. לבחון את הקטע תחת מיקרוסקופ confocal באמצעות העדשה 100X שמן אובייקטיבי.
14. כדי לזהות CM-DiI, להפעיל את הלייזר 543 ננומטר ולאסוף את האות ב 560-615 ננומטר. כדי לזהות DAPI, הפעל את ה- 405Nm לייזר ולאסוף את האות ב 420-480 ננומטר. הגדר את ערך החור על כ 1.4.

תוצאות

המפתח ההכנה המוצלחת של PMVs תלוי במידה רבה על הרכבה נכונה של יחידת המסנן ( איור 1 ), אשר ניתן לבדוק על ידי דחיפת 1 מ"ל של PBS דרך הממברנה. אם מתרחשת דליפה, חבר מחדש את יחידת המסנן ובדוק שוב. עם זאת, דליפה ניתן רק לבדוק באופן מהימן כאשר תאים נדחפים דרך הממברנה. אם רק כמה PMVs מזוהים תחת מיקרוסקופ רגיל באמצעות המטרה 10X, או אם גודל של PMVs הוא בעיקר סביב 1 מיקרומטר, זה יעיד כי רוב התאים נלכדים בתוך היחידה בשל הרכבה שגוי. PMVs עם גודל...

דיון

לטיפול בתחליפי ציטופלזמה כפי שהוצע בכתב יד זה יש יתרונות ייחודיים על פני גישות מדווחות אחרות כגון טיפול גנטי, מולקולרי ותאי. PMVs הנוצרים מ-BMSCs עוטפים לא רק את התוצרים של גנים גזעיים אלא גם אברונים תאיים שלמים, החיוניים לתיקון הפנוטיפים המזדקנים הקשורים להזדקנות. כאשר ציטופלזמה צעירה מועברת לתאים מזדקנים, המנגנונים הלא תקינים עשויים לקבל הקלה קצרה; במקביל, ניתן לתכנת מחדש את האפיגנום ולהמריץ אותו כדי לספק אפקט ארוך טווח. בנוסף, למיטוכונדריה אקסוגנית עשוי להיות קצב התפשטות מהיר יותר, כפי שצוין במחקר הקודם שלנו

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ממברנות IsoporeTM	Millipore	TSTP04700	3 מ"מ נקבוביות
יחידת מסנן חד פעמית	Xinya, שנחאי, סין	25 מ"מ	מזרק אינסולין פוליפרופילן בדרגה רפואית
	BD	328446	1 מ"ל
pN1-EGFP	Clontech	6085-1
בדיקות מולקולריות	MitoTracker	M7514	ירוק FM, 1 μ M
JC-1	Beyotime, היימן, סין	C2006	10 מ"ג/מ"ל
CM-DiI	Beyotime, היימן, סין	C1036	10 מ"מ
PEI	Sigma	P3143	Mn = 75,000
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	Nikon	Eclipse TE 2000	עם מצלמת CCD
מיקרוסקופ Confocol	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	לטרנספקציה של תאים