Method Article

לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

DOI:

10.3791/55745

⸱

June 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדווחים על שני פרוטוקולים של סינכרון תאים המספקים הקשר ללימוד אירועים הקשורים לשלבים ספציפיים של מחזור התא. אנו מראים כי גישה זו שימושית לניתוח הרגולציה של גנים ספציפיים במחזור תאים לא מופרע או בחשיפה לסוכנים המשפיעים על מחזור התא.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוכנית ביטוי גנים של מחזור התא מייצג צעד קריטי להבנת התהליכים תלוי מחזור התא ואת תפקידם במחלות כגון סרטן. התא מחזור מוסדר ניתוח ביטוי גנים תלוי בסנכרון התא לשלבים ספציפיים. כאן אנו מתארים שיטה ניצול שני פרוטוקולים סינכרון משלימים כי הוא נפוץ בחקר וריאציה תקופתית של ביטוי גנים במהלך מחזור התא. שני ההליכים מבוססים על חסימה זמנית של מחזור התא בנקודה אחת מוגדרת. פרוטוקול הסינכרון על ידי הידרוקסיאורה (HU) מוביל לתא סלולרי בסוף שלב G1 / מוקדם S, ושחרור ממעצר HU מתווך מספק אוכלוסייה סלולרית מתקדם באופן אחיד באמצעות S ו- G2 / M. פרוטוקול הסינכרון על-ידי טיפול ב- thymidine ו- nocodazole (Thy-Noc) חוסם תאים במיטוזה מוקדמת, ושחרור ממעצר Thy-Noc בתיווך מספק אוכלוסיה סלולרית מסונכרנת המתאימה לשלב G1 ו- S שלבEvacpid יישום של שני הליכים דורש ניטור של פרופילי הפצה מחזור התא, אשר מבוצעת בדרך כלל לאחר propidium יודיד (PI) מכתים של התאים זרימת cytometry בתיווך ניתוח של תוכן ה- DNA. אנו מראים שהשימוש המשולב בשני פרוטוקולי סינכרון הוא גישה חזקה לבירור ברור של הפרוטוקולים התעתיקיים של גנים המווסתים באופן דיפרנציאלי במחזור התא ( כלומר E2F1 ו- E2F7), וכתוצאה מכך יש הבנה טובה יותר של תפקידם במחזור התא תהליכים. יתר על כן, אנו מראים כי גישה זו שימושית עבור מחקר של מנגנונים המבוססים על תרופות מבוססות תרופה ( כלומר, mitomycin C, סוכן antiancer), משום שהוא מאפשר להפלות גנים כי מגיבים סוכן genotoxic מאלה שהושפעו רק על ידי הפרעות מחזור התא שהוטל על ידי הסוכן.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המעבר דרך כל השלבים של מחזור התא הוא מצורף לתוכנית ביטוי הגן מוסדר היטב. זה מתואמת "לסירוגין" של שעתוק גנים ברחבי מחזור התא הוא האמין להיות תחת שליטה של ​​מערכות תמלול מורכבות תעתיק, המסדיר לא רק את העיתוי, אלא גם את רמות ביטוי גנים. הדה-רגולציה של מרכיבי מחזורי התא העיקריים ידועה כתורמת להתפתחותן של מספר מחלות והיא סימן ההיכר המובהק של tumorigenesis 1 , 2 . ניתוחי גנום רחבי תמליל שבוצעו בתאי שמרים ותאי יונקים גילו שמספר רב של גנים מציגים דפוסי ביטוי גנטיים מחזוריים במחזור התא, דבר המצביע על כך שתנודות תעתיק במהלך מחזור התא משקפות את הדרישה הטמפורלית של מוצר גנטי נתון בשלב 3 , 4 , 5 .

משימה מרכזית בחקר מחזור גנים מוסדר במחזור גנים היא סינכרון של תאים לשלבים ספציפיים של מחזור התא. סינכרון תאים מסייע לפרש את ההתאמה של דפוס ביטוי גנטי לתא מסוים של מעבר מחזורי התא, והוא הוביל להבנה טובה יותר של הרגולציה והתפקוד של גנים רבים. סינכרון סלולרי חשוב גם לחקר מנגנון הפעולה של תרופות נגד סרטן, כמו סוכני כימותרפיה ידועים להשפיע הן ביטוי גנים כמו גם מחזור תאים קינטיקה 6 , 7 . עם זאת, לעתים קרובות קשה לקבוע אם הפרשי ביטוי גנים הנובעים מטיפול בסוכנים אלה הם תגובה ישירה לטיפול או שהם רק תוצאה של שינויים בפרופילי מחזור התא. כדי להבחין בין האפשרויות הללו, ביטוי גנים צריך להיות מנותח בתאים שהיו sYnchronized לפני תוספת של תרופה כימותרפית.

למעט כמה תאים ראשוניים כגון תאים לימפואידים מבודדים טרי, אשר מהווים אוכלוסיית תאים הומוגנית מסונכרן G0 8 -, במבחנה הוקמה שורות תאים לגדול באופן אסינכרוני בתרבות. תחת תנאי צמיחה רגילים, אלה אופניים אסינכרוני אופניים נמצאים בכל השלבים של מחזור התא אבל, מעדיפים G1 9 . לכן, הקשר זה אינו מספק תרחיש אופטימלי עבור ניתוח פונקציונלי או ביטוי גנים בשלב מחזור תא מסוים ( לדוגמה , G1, S וכו '). שורות תאים נצחיות שלא הוסבו ( כגון fibroblasts) ניתן לסנכרן עם מה שמכונה שיטות פיזיולוגיות 10 . שיטות אלה מבוססות על תכונות התא העיקרי שנשמר של תאים שאינם משנים, כגון עיכוב קשר עם תא ותלות גורם גדילה כדי להמשיך את רכיבה על אופניים. הֲסָרָהשל סרום בשילוב עם עיכוב מגע הופך תאים שאינם הופכים נעצרו ב G0 / G1. עם זאת, מסומן מחזור מחזור התא התקדמות לעתים קרובות דורש תת, אשר כרוך גם ניתוק מלאכותי של תאים מחדש ציפוי 10 . והכי חשוב, שיטה זו אינה מתאימה לסינכרון של שורות תאים שהשתנו, הרוב המכריע של שורות תאים מבוססות הנמצאות בשימוש, המאופיינות בחסרונם של עיכובים בצמיחת מגע בתא או בתגובה לנסיגת גורמי גדילה. לכן, ברור כי שיטות חלופיות נדרשים סינכרון תא יעיל בשלבים ספציפיים של מחזור התא. באופן כללי, שיטות הסינכרון הנפוצות ביותר מבוססות על עיכוב כימי זמני או פרמקולוגי של נקודה מוגדרת אחת של מחזור התא, בדרך כלל סינתזה של DNA או יצירת ציר מיטוטי. עיכוב של סינתזת דנ"א מסנכרן תאים על ידי מעצר אותם בסוף G1 או בשלב S מוקדם. זה יכול להיות achiEved על ידי הוספת תרכובות כגון mimosine, מעכב של ביוטוסיזה של נוקליאוטיד 11 , 12 , aphidicolin, מעכב של פולימרים 13 , 14 , hydroxyurea, מעכב של ribonucleotide רדוקטאז 15 , 16 או על ידי כמויות עודפות של תימידין 17 , 18 . מצד שני, מעכבי פילמור microtubule, כגון קולצ'יצין או nocodazole, מסוגלים לחסום היווצרות ציר מיטוטי המוביל סינכרון התא בשלב M מוקדם 19 , 20 , 21 .

בעבודה זו אנו מתארים שיטה המערבת שני פרוטוקולים סינכרון משלימים המבוססים על עיכוב כימי חולף ללימוד הביטוי של גנים מחזורי מוסדר מחזור התא ב mRNAרָמָה. שיטה זו היא בסיסית להגדרת תפקידם של גנים במחזור תאים בתהליכי מחזור תאים ספציפיים. יתר על כן, הוא מספק מסגרת כללית לחקר ההשפעה של טיפולים נגד סרטן כדי לזהות במדויק את הגנים המגיבים לתרופות ולמזער הפרעות שגויות הנגזרות מהפרעות בתהליכי מחזור התא שנוצרו על ידי תרופות אלו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סינכרון נייד, שחרור ומעקב של התקדמות מחזור התא

  1. תימידין ו- nocodazole מבוססי (Thy-Noc) סינכרון ושחרור של תאים U2OS מ מיטוזה
    1. הכינו המדיום הנדרש לתרבות תאים. תאים U2OS גדלים באופן שגרתי ב DMEM- גלוטמין בינוני השלימו עם 10% (Vol / Vol) FBS (אופציונלי: 1% פניצילין / סטרפטומיצין). בצע את כל ההכנה בינוני מניפולציה בתנאים סטריליים ולחמם בינוני השלימה (מעתה ואילך המכונה "בינוני מלא") עד 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    2. זרע 2 x 10 6 תאים U2OS לכל צלחת 100 מ"מ במדיום 10 מ"ל תרבות מלאה. כדי לחשב את מספר הכלים הדרושים, יש לקחת בחשבון כי כל צלחת 100 מ"מ בדרך כלל מספק מספיק תאים מיטוטיים לצלחת מחדש כ 5 בארות של צלחת 6 באר (0.2 - 0.25 x 10 6 תאים / טוב) (ראה איור 1 ב ). שתי בארות לכל נקודת זמן שנבחרו הם requirאד בניסוי (1 גם עבור מיצוי רנ"א 1 גם לניטור מחזור התא). בנוסף, טוב השלישי ניתן לאסוף בכל נקודת זמן עבור ניתוח חלבון.
      הערה: תאים צלחת בערב (בסביבות 7 בערב), כך הצעדים הבאים ניתן לבצע בשעות העבודה בימים הבאים. כלול 2 בארות נוספות של תאים גדל באופן אסינכרוני להגדיר הגדרות פיצוי FACS ניתוח.
    3. בואו תאים לצרף על ידי דוגרים 100 מנות מ"מ על 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO 2 עבור 24 שעות.
    4. עבור בלוק תימידין, להכין פתרון 200 מ"מ thymidine המניות על ידי המסת אבקת תימידין 145.2 מ"ג ב 3 מ"ל H 2 O (או כמויות שווה) ולעקר את הפתרון על ידי סינון באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן גודל הנקבוביות. התחממות קלה עשויה לעזור להמיס תימידין. הוסף 100 μL של 200 מ"מ טרי מוכן טרי לכל צלחת 100 מ"מ תרבות (ריכוז סופי 2 מ"מ). דגירה תאים עם תימידין במשך 20 שעות ב 3776; C באווירה humidified עם 5% CO 2 .
      הערה: לטפל בתאים בערב (בסביבות 7 בערב), יש לי זמן לבצע הן שחרור thymidine ו nocodazole לחסום למחרת.
    5. כדי לשחרר את בלוק thymidine, להסיר בינוני thymidine המכיל צמיחה בשעות אחר הצהריים של היום הבא (15:00); לשטוף תאים פעמיים עם חימם מראש 1x PBS ולהוסיף 10 מ"ל של המדיום המלא לכל צלחת 100 מ"מ. דגירה תאים 5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO 2 .
    6. למעצר תא מיטוטי, להוסיף nocodazole לריכוז סופי של 50 ng / mL (8 בערב). הכן פתרון המניות על ידי המסת אבקת nocodazole ב DMSO ( למשל 5 מ"ג / מ"ל) ולאחסן בחנות ב -20 מעלות צלזיוס. דגירה תאים עם nocodazole לא יותר מ 10-11 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO 2 .
    7. שחרור ממעצר בתיווך nocodazole בשלב M בשלב מוקדם (מיטוטי לנער- off) ואוסף של דגימות בכמה poi זמןNts (החל בשעה 6-7 בבוקר).
      1. לנתק מעוגלות (תאים מיטוטים) על ידי רעד כל צלחת בעדינות pipetting nocodazole המכיל בינוני צמיחה. איסוף בינוני עם תאים מנותקים מכל צלחת 100 מ"מ לתוך 50 צינורות סטרילי מ"ל, צנטריפוגות (300 xg, 5 דקות, טמפרטורת החדר (RT)), לשטוף תאים פעמיים על ידי הוספת 1x PBS ואחריו צנטריפוגה. שימוש קר PBS או PBS בתוספת nocodazole מומלץ להימנע slipage מיטוטי (ראה סעיף דיון).
      2. Resuspend תאים מיטוטיים נאספו כל צלחת 100 מ"מ 10 מ"ל של המדיום המלא. שמור 2 מ"ל עבור מיצוי RNA ו 2 מ"ל עבור ניתוח FACS עבור נקודת זמן 0 h (כ 0.2-0.25 x 10 6 תאים לכל מדגם).
      3. Re-plate שנותרו תאים מיטוטיים עבור נקודות זמן לאחר מכן 6 צלחות היטב (2 מ"ל / טוב, 0.2-0.25 x 10 6 תאים / טוב).
        הערה: זכור כי 2 בארות נדרשים לנקודת זמן שנבחרה (1 עבור RNA ו 1 לניתוח FACS).
    8. איסוף דגימות ב selEcted נקודות זמן. כל 1.5 עד 3 שעות מומלץ על מנת לקבל פרופיל הולם של התקדמות מחזור התא.
      1. עבור מיצוי RNA, להסיר בינוני, לשטוף היטב עם 2 מ"ל מראש חם 1x PBS ולהוסיף 1 מ"ל של מגיב בידוד RNA מתאים ( למשל TRIzol) בבאר (בצע את השלב האחרון בארון בטיחות עבור כימיקלים). פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק תאים lyse, להעביר lysate תא צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, דגירה 5 דקות ב RT ו חנות החנות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
      2. עבור ניתוח FACS, לשטוף היטב עם 2 מ"ל לפני החום 1x PBS, להוסיף מראש חימם פתרון טריפסין- EDTA (0.3 מ"ל / טוב) לנתק תאים, לחסום Trypsin-EDTA על ידי הוספת בינוני 1 מ"ל מלא ולאסוף כל מדגם נפרד צינור 15 מ"ל.
        1. צנטריפוגה תאים (300 xg, 5 דקות, RT), לשמור גלולה הסלולר וזורקים supernatant. כדי לתקן תאים, תאים resuspend ב 1 מ"ל של צונן 70% (V / V) אתנול 1x PBS ידי צינורות vortexing בעדינות, ומניחים אותם על הקרח עבור היישוםבערך 15 דקות לפני אחסון ב 4 ° C או מכתים לניתוח נוסף על ידי FACS (המתואר צעדים 1.4 - 1.5).
  2. HU מבוסס סינכרון ושחרור של תאים U2OS מן הגבול G1 / S
    1. הכן את המדיום מלא תרבות התא כפי שתואר בשלב 1.1.
    2. זרעים 0.25 x 10 6 תאים U2OS לכל טוב 6 צלחות גם (2 מ"ל תרבות בינוני מלא לכל טוב). כדי לחשב את מספר הבארות הדרושות לניסוי, יש לקחת בחשבון כי 2 בארות יידרשו לכל נקודת זמן שנבחרה (1 גם עבור מיצוי רנ"א 1 גם לניטור מחזור התא) וכי 2 בארות נוספות של תאים גדל באופן אסינכרוני הם צריך להגדיר הגדרות פיצוי FACS ניתוח.
    3. בואו תאים לצרף על ידי דוגרים 6-גם צלחות לילה (O / N) ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO 2 .
    4. הסר בינוני מלא מבארות למחרת בבוקר ולהוסיף 2 מ"לשל חימם מראש FBS ללא DMEM- גלוטמין בינוני לכל טוב. דגירה תאים במשך 24 שעות נוספות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO 2 .
      הערה: בצע שלב זה בכל הבארות למעט 2 (אלה שנשמרו כדי להגדיר הגדרות FACS). צעד נסיגה בסרום ניתן להשמיט אם סינכרון יעיל מושגת על ידי הדגירה פשוטה תאים עם HU.
    5. G1 / S מחזור מחזור המעצר עם HU.
      1. הכן טריים פתרון מניות HU (500 מ"מ) לפני כל שימוש. הוסף 2 מ"ל H 2 O ל 76.06 מ"ג אבקת HU ומערבבים עד מומס ביסודיות. לעקר את הפתרון על ידי סינון באמצעות 0.2 מיקרומטר גודל הנקבוביות מסנן. מערבבים 50 מ"ל של המדיום המלא עם 400 μL של מסנן מעוקרים פתרון מניות HU לריכוז HU הסופי של 4 מ"מ.
      2. הסר בינוני מכל בארות למעט 2 הבארות הדרושים להגדרת הגדרות FACS ולהחליף עם מוכן 4 מ"מ HU המכיל בינוני מלא (2 מ"ל / טוב).
      3. דגירה תאים עבור 24 שעות בHU המכיל בינוני ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO 2 .
    6. שחרור של תאים מהמעצר מתווך HU. הסר בינוני המכיל HU מבארות לשטוף בארות פעמיים עם חימם מראש 1x PBS (2 מ"ל בכל פעם). הוסף 2 מ"ל של המדיום המלא לכל טוב. איסוף 2 דגימות עבור נקודת זמן 0 h (1 עבור החילוץ RNA ו 1 עבור מעצר תא מעצר אימות על ידי FACS), כמו גם 2 דגימות שנשמרו עבור הגדרות FACS. מקום בארות הנותרים בחממה.
    7. איסוף דגימות כל 1.5 עד 3 שעות על מנת להשיג חלוקה נאותה של מחזור מחזור התא. בכל נקודת זמן, לבצע עיבוד מדגם (עבור מיצוי RNA ו FACS ניתוח) כמתואר 1.1.8.1-1.1.8.2.
  3. טיפול בסוכני דנ"א
    הערה: בכל פעם שהמטרה היא להבהיר את ההשפעה של תרכובת ( כגון חומרים מזיקים של DNA) באירועי מחזור תאים, כל אחת משיטות הסינכרון המתוארות לעיל יכולה להיותבשילוב עם טיפול בתאים עם סוכן genotoxic. כדי לבחור את שיטת הסנכרון, חשוב לשקול את השלב של מחזור התא שאנחנו רוצים לנתח. באופן כללי, ההליך Thy-Noc עשוי להתאים את ההשפעה של תרכובת בשלב G1 או שלב שלב S בזמן סינכרון HU בתיווך עשוי להיות מתאים יותר ללמוד את ההשפעה של S ל G2 שלבים או בכניסה מיטוזה.
    1. ניתוח ההשפעה של חומרים genotoxic בשלב G1 או שלב שלב S
      1. סנכרן תאים כמתואר בסעיף 1.1.2. 1.1.6.
      2. שחרר תאים מ nocodazole מחדש צלחת אותם כמתואר 1.1.7. דגירה אותם על 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO 2 במשך 3 שעות לתת להם לצרף לפני הוספת סוכן (תקופת הדגירה נדרש עשוי להשתנות בהתאם לקו התא).
      3. הוסף סוכן לאסוף דוגמאות כפי שתואר לעיל 1.1.8.
    2. ניתוח ההשפעה של סוכנים genotoxic ב SG2 שלבים או כניסה M
      1. סנכרן תאים כמתואר בסעיף 1.2.2. כדי 1.2.5.
      2. שחרר תאים מ HU כמתואר 1.2.6. ולהוסיף סוכן ישר.
      3. איסוף דגימות כפי שתואר לעיל 1.8.
  4. ניטור של סינכרון התא התקדמות דרך מחזור התא על ידי propidium יודיד (PI) מכתים וניתוח FACS
    הערה: הדגימות שנאספו בכל נקודות הזמן יחד עם אלה הדרושות להגדרת הגדרות FACS ניתנות לאחסון ב 4 ° C לאחר תיקוןן (כאמור בסעיף 1.1.8.2). בצע מכתים עם פתרון PI ואחריו ניתוח FACS עבור כל דגימות של הניסוי בו זמנית. PI intercalates לתוך החריץ העיקרי של ה- DNA תקועים פעמיים לייצר אות ניאון מאוד כאשר מתרגש ב 535 ננומטר עם שיא פליטה רחב סביב 600 ננומטר. מאז PI יכול גם להכפיף RNA תקועים פעמיים, יש צורך לטפל בתאים עם RNase לקבלת רזולוציה דנ"א אופטימלית.
    1. הכן טריים פתרון צביעה PI. פתרון המניות PI יכול להיות מוכן על ידי המסת אבקת PI ב PBS ( למשל 5 מ"ג / מ"ל). חנות הפתרון המניות ב 4 ° C (בחושך). פתרון מכתים מורכב PI (140 מיקרומטר), ציטראט נתרן (38 מ"מ) וטריטון X-100 (0.01% v / v).
    2. מחממים משטח מתאים ( למשל, תנור) עד 37 ° C.
    3. צנטריפוגה תאים קבועים (450 xg, 5 דקות, RT), supernatant decant (אתנול) ולשטוף פעם עם 1x PBS.
    4. צנטריפוגות תאים שוב, להסיר PBS ולהוסיף 300 μL של פתרון מכתים PI לכל מדגם (למעט לאחד הדגימות עבור הגדרות FACS, להוסיף PBS למדגם זה במקום).
    5. העברת תאים צינורות FACS (5 מ"ל עגול צינורות פוליסטירן התחתונה).
    6. הוסף 1 μL של RNase A לכל דגימה, לערבב דגימות דגימה למשך 30 דקות בחושך על 37 מעלות צלזיוס. דוגמאות ניתן לאחסן מוגן מפני האור על 4 מעלות צלזיוס למשך מקסימום של 2 - 3 ימים.
    7. ניתוח תוכן DNA בדגימות על ידי זרימהציטומטרי. הגדרת הגדרות פיצוי FACS ניתוח עם מדגם אסינכרוני מוכתמים PI. השתמש מדגם ריק (ללא תמיסת PI מכתים) כדי לבדוק autofluorescence. יסודות של PI מכתים בתיווך ניתוח של תוכן ה- DNA על ידי cytometry הזרימה תוארה בעבר 9 .
  5. קביעת מדד מיטוטי על ידי כפול phospho-H3 (סר 10) / מכתים PI
    הערה: תאים שעוברים מיטוזה ניתן לזהות בקלות על ידי cytometry הזרימה עם נוגדנים ספציפיים עבור H3 H phone histone ב Serine 10 (pH3). מכתים PI מקביל הוא שימושי כדי לקבוע DNA מבוסס תוכן ההפצה של האוכלוסייה התא. 5 דגימות נדרשות עבור תצורות אופטימלי של הגדרות FACS: ריק, PI בלבד, pH3 בלבד, נוגדנים משני בלבד מכתים כפול.
    1. צנטריפוגה תאים קבועים (450 xg, 5 דקות, 4 ° C) וזורקים supernatant. השלבים הבאים מתוארים כדי לבצע מכתים צינורות 15 מ"ל.
    2. שטפו תאים על ידי הוספת 1מ"ל PBS-T (PBS + 0.05% Tween-20) כדי גלולה צנטריפוגה (450 xg, 5 דקות, 4 ° C). הסר supernatant.
    3. הוסף נוגדנים נוגדי pH3 מדולל (1: 500) μL 100-200 של PBS-T + 3% BSA, ו דגירה עם נדנדה עבור 2 שעות ב RT (או O / N ב 4 ° C).
    4. הוסף 2 מ"ל PBS-T (PBS + 0.05% Tween-20) ו צנטריפוגה (450 xg, 5 דקות, 4 ° C). הסר supernatant.
    5. לשטוף פעם נוספת על ידי הוספת 2 מ"ל PBS-T כדי גלולה, צנטריפוגה וזורקים supernatant.
    6. הוסף נוגדנים משני (אנטי ארנב AlexaFluor 488 במקרה של נוגדן pH3 נבחרים) מדולל (1: 500) ב 100-200 μL של PBS-T + 3% BSA ו דגירה עם נדנדה עבור 1 שעה ב RT (או O / N ב 4 ° C). להגן על דגימות מן האור.
    7. לשטוף פעמיים עם PBS-T (2 מ"ל) על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 1.5.4.
    8. ביצוע מכתים PI כמתואר (צעדים 1.4.1-1.4.6).

2. אוסף לדוגמא ו Processsing עבור ניתוח ביטוי גנים

  1. לקחת1.5 מ"ל microcentrifuge דגימות של מגיב בידוד RNA מתוך המקפיא ולתת להם להפשיר ב RT בתוך ארון בטיחות עבור כימיקלים.
  2. הוסף 400 μL של כלורופורם לכל מדגם ולנער במרץ (אך לא מערבולת) עד ערבוב מלא. דגירה דגימות במשך 5 דקות ב RT.
  3. צנטריפוגה צינורות במשך 15 דקות (XG 8,000 ≥, 4 ° C) microcentrifuge benchtop.
  4. מעבירים את השלב מימית (עליון) לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל חדש לרשום את נפח המועבר (כדי לפשט את ההליך, מומלץ לאסוף כמויות שוות בכל דגימות של הניסוי).
  5. הוסף נפח 1 של 100% אתנול לאט (ירידה טיפה) לשלב מימית בזמן ערבוב. אין צנטריפוגות.
  6. בצע את הצעדים הבאים עם ערכת RNA מסחרי מיני. פיפטה עד 700 μL של כל מדגם, כולל כל המשקע שאולי יצרו, לתוך עמוד ספין בצינור 2 מ"ל אוסף (מסופק על ידי היצרן).
  7. סגור אתמכסה צנטריפוגה (≥ 8,000 גרם, RT) במשך 15 s. מחק את הזרימה דרך. חזור על השלב הקודם עם המדגם הנותר (אם בכלל).
  8. בצע הוראות manufactors 'עבור RNA כביסה elution (elute כל מדגם 30-40 nuclease μl חינם H 2 O כדי להשיג ריכוז מתאים RNA לשלב הבא).
  9. קביעת ריכוז RNA וטוהר של דגימות ידי מדידות ספיגת ( A יחס 260/280 של 2.0-2.1 מצביע על טוהר טוב של מדגם RNA). חנות דגימות RNA ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש עבור ניתוח RT-qPCR.
  10. עבור המרה RNA לתוך cDNA ואחריו כמותי- PCR, לקחת 1 RNA מיקרוגרם לדגימה ולהכין תגובה retrotranscriptase על פי הוראות היצרנים. דגימות cDNA שהושגו ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס (במשך כמה ימים) או ב -20 מעלות צלזיוס (לתקופות זמן ארוכות יותר).
    הערה: הכנה לדוגמא, עיצוב פריימר ושיקולים אחרים בזמן אמת PCR כבר לשעברמתוארת מתוחכמת בספרות 22 , 23 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצוג סכמטי של פרוטוקולים Thy-Noc ו- HU עבור סינכרון תאים.

איור 1 מסכם את הצעדים הנדרשים עבור סינכרון תא U2OS ואת אוסף המדגם הבאים על מנת לאמת את ההתקדמות דרך מחזור התא ולבצע ניתוח ביטוי גנים.

Phospho-H3 ו PI מכתים הם פרמטרים הערכה טובה ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח גנים מווסתים עדינים המעורבים בתפקידים זמניים וספציפיים במחזור התא דורשים אוכלוסיית תאים אחידה. חוקרים רבים משתמשים באופן שגרתי בקווי תאים סרטניים ארוכי טווח למטרות אלו, ומספר שיטות פותחו כדי להשיג אוכלוסיות תאים סינכרוני (או סינכרוני), במטרה לצבור תאים רבים ככל האפשר בשלבים מוגדרים של מחזור התא. יתר על כן, מאמצים חזקים נעשו כדי לשפר ולייעל גישות סינכרון מבוססת היטב. עם זאת, לכל פרוטוקולי הסינכרון יש חסרונות, שניתן לייחסם להטרוגניות של תרבויות תאים, ליעילות תת-אופטימלית של תה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי Zubiaga ומעבדות Altmeyer לדיונים מועילים ולתמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמשרד הספרדי (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), ממשלת הבאסקים (IT634-13 ו KK-2015/89), ואת אוניברסיטת המדינה הבסקית UPV / EHU ( UFI11 / 20).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, גלוקוז גבוה, תוסף GutaMAXThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, מוסמך, מאושר על ידי האיחוד האירופי, ממוצא דרום אמריקהThermo Fisher Scientific10270-106
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
0.25% Trypsin-EDTA (1x), פנול אדוםThermo Fisher Scientific25200-072
תימידיןSIGMAT1895-5Gמוכן טרי. התחממות קלה עשויה לעזור להמיס תימידין.
NocodazoleSIGMAM-1404פתרון מלאי ב-DMSO מאוחסן ב-20 º C בכמויות קטנות
HydroxyureaSIGMAH8627
מיטומיצין טרי C מ- Streptomyces caespitosusSIGMAM4287תמיסת מלאי 1.5 מ"מ ב- H2O סטרילי מוגן מפני אור ומאוחסן ב 4 º C
דימתיל סולפוקסידSIGMAD2650
פרופידיום יודידSIGMAP4170תמיסת מלאי ב-PBS סטרילי ב-5 מ"ג/מ"ל, מאוחסן ב-4 º C מוגן מפני אור.
PBS pH 7.6אתנול תוצרת בית
PANREACA3678,2500
כלורופורםSIGMAC2432
נתרן ציטראטPANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
RNAse AThermo Fisher ScientificEN0531
TRIzol מגיבLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוההThermo Fisher Scientific4368814
אנטי-ציקלין E1 נוגדןאיתות תאים41291:1000 דילול ב-5% חלב, o/n, 4 º C
נוגדן אנטי-ציקלין B1איתות תאים41351:1000 דילול ב-5% חלב, o/n, 4 º C
אנטי-&בטא;-אקטיןSIGMAA-54411:3000 דילול ב-5% חלב, 1 שעה, RT
אנטי-pH3 (Ser 10) אנטי-בוטיMillipore06-570מצוין בפרוטוקול
אנטי-ארנב משני AlexaFluor 488 נוגדןInvitrogenR37116מצוין בפרוטוקול
נוגדן משני נגד עכבר-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-36971:3000 דילול ב-5% חלב, שעה אחת,
נוגדן RT Forward E2F1 (אנושי)                                      TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioתוכנן על ידי הכלי PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
נוגדן E2F1 הפוך (אנושי)                                      CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioתוכנן על ידי כלי PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
נוגדן Forward E2F7 (אנושי)                                      GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioעוצב על ידי כלי PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
נוגדן E2F7 הפוך (אנושי)                                      TGGGAGAGACCAAGAGTAGAGABiolegioתוכנן על ידי כלי PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
קדימה p21Cip1 נוגדן (אנושי)                                      AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioתוכנן על ידי כלי PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
הפוך p21Cip1 נוגדן (אנושי)                                      TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioתוכנן על ידי כלי PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
גן ייחוס נוגדן TBP קדימה (אנושי)                                       Biolegioעוצב על ידי כלי PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
נוגדן TBP הפוך (אנושי)                                       Biolegioתוכנן על ידי כלי PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L נוגדן (אנושי) גן ייחוס    CACTTGCCAGAGATCCAGAG                                 Biolegioעוצב על ידי הכלי PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L   נוגדנים (אנושיים)      CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                               Biolegioעוצב על ידי PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
FACS Tubes Sarstedt551578
MicroAmp אופטי 96 בארות צלחת תגובהתרמו פישר N8010560
קורנינג 100 מ"מ צלחת תרבית מטופלת TCקורנינג
צלחות תרבית תאים של קוסטאר 6 בארקורנינג3506
מיקרוצנטריפוגה ספסל מקורראפנדורף5415 R
צנטריפוגה מקוררת ספסל עליון Jouan CR3.12Jouan743205604
NanoDrop Lite ספקטרופוטומטרתרמו מדעיND-LITE-PR
BD FACSציטומטר זרימה של קליבורBD Bioscience
QuantStudio 3 מערכת PCR בזמן אמתThermo Fisher ScientificA28567
מדעי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, R. J., et al. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle. Nat Genet. 27 (1), 48-54 (2001).
  4. Peña-Diaz, J., et al. Transcription profiling during the cell cycle shows that a subset of Polycomb-targeted genes is upregulated during DNA replication. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2846-2856 (2013).
  5. Grant, G. D., et al. Identification of cell cycle-regulated genes periodically expressed in U2OS cells and their regulation by FOXM1 and E2F transcription factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3634-3650 (2013).
  6. Minderman, H., et al. In vitro and in vivo irinotecan-induced changes in expression profiles of cell cycle and apoptosis-associated genes in acute myeloid leukemia cells. Mol Cancer Ther. 4 (6), 885-900 (2005).
  7. McKenna, E., Traganos, F., Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Persistent DNA damage caused by low levels of mitomycin C induces irreversible cell senescence. Cell Cycle. 11 (16), 3132-3140 (2012).
  8. Infante, A., et al. E2F2 represses cell cycle regulators to maintain quiescence. Cell Cycle. 7 (24), 3915-3927 (2008).
  9. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of cell cycle position in mammalian cells. J Vis Exp. (59), (2012).
  10. Schorl, C., Sedivy, J. M. Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells. Methods. 41 (2), 143-150 (2007).
  11. Lalande, M. A reversible arrest point in the late G1 phase of the mammalian cell cycle. Exp Cell Res. 186 (2), 332-339 (1990).
  12. Park, S. Y., et al. Mimosine arrests the cell cycle prior to the onset of DNA replication by preventing the binding of human Ctf4/And-1 to chromatin via Hif-1α activation in HeLa cells. Cell Cycle. 11 (4), 761-766 (2012).
  13. Ikegami, S., et al. Aphidicolin prevents mitotic cell division by interfering with the activity of DNA polymerase-alpha. Nature. 275 (5679), 458-460 (1978).
  14. Baranovskiy, A. G., et al. Structural basis for inhibition of DNA replication by aphidicolin. Nucleic Acids Res. 42 (22), 14013-14021 (2014).
  15. Adams, R. L., Lindsay, J. G. Hydroxyurea reversal of inhibition and use as a cell-synchronizing agent. J Biol Chem. 242 (6), 1314-1317 (1967).
  16. Mitxelena, J., Apraiz, A., Vallejo-Rodríguez, J., Malumbres, M., Zubiaga, A. M. E2F7 regulates transcription and maturation of multiple microRNAs to restrain cell proliferation. Nucleic Acids Res. , (2016).
  17. Bootsma, D., Budke, L., Vos, O. Studies on synchronous division of tissue culture cells initiated by excess thymidinE. Exp Cell Res. 33, 301-309 (1964).
  18. Galgano, P. J., Schildkraut, C. L. G1/S Phase Synchronization using Double Thymidine Synchronization. CSH Protoc. (2), (2006).
  19. Edwin Taylor, W. Kinetics of inhibition and the binding of h3-colchicine. J Cell Biol. 25, 145-160 (1965).
  20. Zieve, G. W., Turnbull, D., Mullins, J. M., McIntosh, J. R. Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells. Exp Cell Res. 126 (2), 397-405 (1980).
  21. Matsui, Y., Nakayama, Y., Okamoto, M., Fukumoto, Y., Yamaguchi, N. Enrichment of cell populations in metaphase, anaphase, and telophase by synchronization using nocodazole and blebbistatin: a novel method suitable for examining dynamic changes in proteins during mitotic progression. Eur J Cell Biol. 91 (5), 413-419 (2012).
  22. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  23. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 39 (2), 145-154 (2011).
  24. Abbas, T., Dutta, A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nat Rev Cancer. 9 (6), 400-414 (2009).
  25. Kung, A. L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (24), 9553-9557 (1990).
  26. Borel, F., Lacroix, F. B., Margolis, R. L. Prolonged arrest of mammalian cells at the G1/S boundary results in permanent S phase stasis. J Cell Sci. 115 (Pt. 14, 2829-2838 (2002).
  27. Knehr, M., et al. A critical appraisal of synchronization methods applied to achieve maximal enrichment of HeLa cells in specific cell cycle phases). Exp Cell Res. 217 (2), 546-553 (1995).
  28. Zhu, W., Giangrande, P. H., Nevins, J. R. E2Fs link the control of G1/S and G2/M transcription. EMBO J. 23 (23), 4615-4626 (2004).
  29. Whitcomb, E. A., Dudek, E. J., Liu, Q., Taylor, A. Novel control of S phase of the cell cycle by ubiquitin-conjugating enzyme H7. Mol Biol Cell. 20 (1), 1-9 (2009).
  30. Bruinsma, W., Macurek, L., Freire, R., Lindqvist, A., Medema, R. H. Bora and Aurora-A continue to activate Plk1 in mitosis. J Cell Sci. 127, 801-811 (2014).
  31. Thomas, D. B., Lingwood, C. A. A model of cell cycle control: effects of thymidine on synchronous cell cultures. Cell. 5 (1), 37-42 (1975).
  32. Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol Biol Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
  33. Lim, S., Cdks Kaldis, P. cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation. Development. 140 (15), 3079-3093 (2013).
  34. Tapia, C., et al. Two mitosis-specific antibodies, MPM-2 and phospho-histone H3 (Ser28), allow rapid and precise determination of mitotic activity. Am J Surg Pathol. 30 (1), 83-89 (2006).
  35. Andreassen, P. R., Martineau, S. N., Margolis, R. L. Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state. Mutat Res. 372 (2), 181-194 (1996).
  36. Wei, F., Xie, Y., He, L., Tao, L., Tang, D. ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation. Cell Signal. 23 (1), 259-268 (2011).
  37. Kubota, S., et al. Activation of the prereplication complex is blocked by mimosine through reactive oxygen species-activated ataxia telangiectasia mutated (ATM) protein without DNA damage. J Biol Chem. 289 (9), 5730-5746 (2014).
  38. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  39. St-Denis, N. A., Derksen, D. R., Litchfield, D. W. Evidence for regulation of mitotic progression through temporal phosphorylation and dephosphorylation of CK2alpha. Mol Cell Biol. 29 (8), 2068-2081 (2009).
  40. Min, A., et al. RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib. Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle SynchronizationHydroxyurea TreatmentThymidine NocodazoleFlow Cytometry AnalysisGene Expression AnalysisRNA Extraction ProtocolPropidium Iodide StainingU2OS CellsMitotic Cell ArrestG1 S Boundary

Related Articles