טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ Rhipicephalus microplus תאים אפיתל גוט

Summary

צפיפות שונה צנטריפוגה מבוססי מתודולוגיה שיפוע מבוסס נוצל לבודד תאים אפיתל מ רקמה Rhipicephalus רקמת microplus . משטח חלבונים הקשורים היו biotinylated ו מטוהרים באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin עבור יישומים במורד הזרם.

Abstract

Rhipicephalus microplus - תווית בקר - הוא ectoparasite משמעותי ביותר במונחים של השפעה כלכלית על בעלי חיים כמו וקטור של מספר פתוגנים. המאמצים הוקדשו לשלוט בקר בקר כדי להפחית את ההשפעות המזיקות שלה, עם דגש על גילוי של מועמדים חיסון, כגון BM86, הממוקם על פני השטח של תאים מעיים לתאי אפיתל. המחקר הנוכחי מתמקד בשימוש של cDNA וגנום ספריות, כדי המסך עבור מועמדים חיסון אחרים. הבידוד של תאים מעיים לתקתק מהווה יתרון חשוב בחקירת הרכב של חלבונים פני השטח על קרום תאים בטן קרום. מאמר זה מהווה שיטה חדשנית וראוי לבידוד של תאי אפיתל, מן התוכן מעיים לתקתק של מיקרופלוס חצי רתומה למחצה . פרוטוקול זה מנצל TCEP ו EDTA לשחרר את התאים אפיתל מן הרקמות תמיכה subepithelial ו צפיפות רציפה צנטריפוגה gradieNt לתאי אפיתל נפרדים מסוגי תאים אחרים. חלבונים משטח התא היו biotinylated ומבודדים מן התאים בטן אפיתל בטן, באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin מקושר המאפשר עבור יישומים במורד FACS או LC-MS / MS- ניתוח.

Introduction

Rhipicephalus microplus , סמן בקר, הוא ectoparasite משמעותי ביותר במונחים של השפעה כלכלית על תעשיית הבקר של אזורים טרופיים תת טרופיים כפי שהוא נוקט קדחת הבקר קדחת (babesiosis), anaplasmosis ו piroplasmosis סוס ^{1 , 2 , 3 , 4} . המאמצים הוקדשו לבקרת סמן בקר, כדי להפחית את ההשפעה המזיקה, אולם לשיטות קונבנציונליות כגון שימוש בחומרי אקריצידים כימיים יש חסרונות משתמעים, כגון נוכחות של שאריות כימיות בחלב ובבשר, ועלייה בשכיחות של קרציות עמידות כימית ^{5 ,}

Protocol

1. דיסקציה של אפיתל גוט מ ר microplus

1. איסוף קרציות חצי מבושל מן הבקר ביום הניסוי. לנתח מתקתק בתוך 24 שעות לאחר הסרת מן המארח.
2. לדבוק רצועת סרט דביק לתחתית של צלחת פטרי 92 מ"מ x 16 מ"מ פטרי. הוסף טיפה של דבק סופר לקלטת. מניחים את סמן, בצד הגחון על הדבק סופר, לאפשר יבש במשך 2 דקות.
3. יוצקים 100 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) לתוך צלחת פטרי, א....

Results

תאים אפיתל היו מבודדים מרקמות המעיים של ר microplus לפי סכימה הציג באיור 1 . נציג מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקרינה של תאים מעיים לתאי אפיתל מוכן באמצעות פרוטוקול זה מוצגים בתרשים 2A ו 2 ב. כמו בידוד התא מתבצע על רבעי מחורץ מיקרופלוס חצי , תאים מופיעים כמו יחיד, כדורית, משטח מורפולוגיה .......

Discussion

התפשטות בקר קרים מהווים בעיה רצינית עבור תעשיית הבקר באזורים טרופיים וסובטרופיים של העולם, עם השיטה הנפוצה ביותר של שליטה להסתמך על שימוש אקריצידים ^{1 , 4} . Bm86 זוהה בעבר בתוך השטח האפיתל במעיים לתקתק כמו אנטיגן המגן נגד ר microplus שריצה ^10, עם הצלחה מוגבלת כאסטרטגיה חיסון עקב וריאציה רצף גיאוגרפי Bm86 ואת הדרישה קבוע לחיזוק ^4.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan Blue	ThermoFisher Scientific	15250061
1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה	Eppendorf	3322
100mM Carbonate Buffer			3.03 גרם Na2CO3, 6.0 גרם NaHCO3 1000 מ"ל מים מזוקקים pH 9.6
16 מ"ל צינורות צנטריפוגה עם מכסה איטום	Thermo Scientific	3138-0016	מצננים בקרח לפני שיפוע
250 ומיקרו; מסננת תאים M	Thermo Fisher	87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) מערכת מצע נוזלי עבור ELISA	Sigma	T0440	מאוחסן ב-4C
30% מי חמצן	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS ג'ל	Gen Script	M42015
4-כלורו-1-נפתול טבליה	Sigma-Aldrich	C6788
50 מ"ל צינור פלקון	כחול קורנינג		30 x 115 מ"מ סטייל. צינור חרוטי פוליפרופליין.
70 ומיקרו; מסננת תאים M	BD Falcon	352350
AP15 נייר סינון	Millipore	AO1504200
ביוטין (סוג A) ערכת צימוד	Abcam	Ab102865
דיסקציה מיקרוסקופ	אולימפוס	SZX7
DP Manager	אולימפוס	2.2.1.195	תוכנת הדמיה סלולרית
סרט דביק	הנדימן		48 מ"מ x 25 מ"מ סרט דביק
Dulbecco' s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - קר כקרח לפרוטוקול
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
סרום בקר עוברי	Sigma-Aldrich	12003C
FCS מיקרוסקופ פלואורסצנטי	אולימפוס	BX51
Fluoroshield עם DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
מלקחיים	Dumont		#9 Dumont - Switerzland
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	גליצרול לביולוגיה מולקולרית >99%
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
כף יד	דלפק עבודות משרדיות	JA0376230
האנק' s תמיסת מלח מאוזנת	סיגמא מדעי החיים	H9394	HBSS – קר כקרח לפרוטוקול
המציטומטר	אופטיק לקור	-	-
L-גלוטתיון מחומצן	סיגמא-אולדריץ'	G4376
מעמד הפרדה מגנטית	novagen-4		צינורות מתלה הפרדה מגנטית
מתנול	סיגמא-אולדריץ'	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	מערכת טיהור מים אינטגרלית למים טהורים במיוחד
ניטרוצלולוזה ממברנה	החיים	66485	30 ס"מ x 3M ממברנת ניטרוצלולוזה טהורה
PageRuler סולם חלבון צבוע מראש	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1.16 גרם Na2HPO4, 0.1 גרם KCl, 0.1 גרם K3PO4, 4.0 גרם NaCl (500 מ"ל מים מזוקקים) pH 7.4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
משאבה פריסטלטית	Masterflex	7518-10
חומצה זרחתית	Sigma-Aldrich	P6560
פירס ללא חלבון T20 PBS חוסם מאגר	Thermo-Scientific	37573	מאוחסן ב-4C. חסימת
קוקטייל מעכב פרוטאז	מאגר סיגמא-אולדריץ'	P8215-5ML	PIC – מאוחסן בטמפרטורה של -20 ° C
התחלה מהירה מגיב צבע ברדפורד 1x	Biorad	500-0205	לבדיקת ברדפורד
התחלה מהירה תקני BSA	Biorad	500-0207	תקני BSA למעבדת אזמל ברדפורד
	. גודל משותף		11 ערכת צביעה של אזמל
SilverQuest TM	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM כתם בטוח	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge	Thermo Scientific	46910
Streptavidin (HRP)	Abcam	AB7403
Streptavidin חרוזים מגנטיים	ניו אינגלנד Biolabs	S1420S
סופר גלו - סופר דבק מיני UHU			UHU סופר מהיר במיוחד 1 מ"ג.
צנטריפוגה מיני	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
מערבל מערבולת	Ratek	VM1
מענק	אמבט מים	GD100