מאמר שיטה

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

DOI:

10.3791/55757

⸱

9 באוגוסט 2017

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Physiology, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לרתום את הפוטנציאל בידול הלב של מקורות צעיר של גזע mesenchymal האנושי על מנת ליצור תאים פונקציונלית, קבלנות, כמו cardiomyocyte אין ויטרו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוטם שריר הלב המפל איסכמי עוקבות לגרום לאובדן נרחב של cardiomyocytes, שמוביל אי-ספיקת לב, הגורם המוביל של התמותה ברחבי העולם. גזע mesenchymal (MSCs) הם אופציה מבטיח מבוססת תא טיפולים להחליף את הנוכחי, פולשני טכניקות. MSCs יכולים להתמיין שושלות mesenchymal, כולל סוגי תאים הלב, אך התמיינות להשלים לתוך תאים פונקציונלית לא עדיין לא הושג. שיטות קודמות של בידול התבססו על סוכנים תרופתי או גורמי גדילה. עם זאת, אסטרטגיות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית ניתן גם להפעיל MSCs לעבור טרנספורמציה cardiomyogenic. כאן, אנו מציגים שיטה בידול באמצעות MSC אגרגטים בשכבות מזין cardiomyocyte לייצר תאים קבלנות, כמו cardiomyocyte.

תאים אנושיים חבל הטבור perivascular (HUCPVCs) הוכחו יש פוטנציאל מאשר הבחנה גדולה יותר נפוץ חקרו את סוגי MSC, כגון מח העצם MSCs (BMSCs). כמקור ontogenetically הצעיר, חקרנו את הפוטנציאל cardiomyogenic בטרימסטר הראשון (FTM) HUCPVCs לעומת מקורות בוגרים. FTM HUCPVCs הם מקור הרומן, עשיר של MSCs לשמור בתוך הרחם immunoprivileged המאפיינים שלהם כאשר תרבותי במבחנה. באמצעות בידול פרוטוקול זה, FTM המונח HUCPVCs מושגת בידול cardiomyogenic מוגבר באופן משמעותי בהשוואה BMSCs, כמצוין על-ידי ביטוי מוגבר של סמנים cardiomyocyte (קרי, myocyte משפר פקטור 2 ג, טרופונין לב T, שרשרת כבדה לב צולבות הקישור חוטים שרירן, אות חלבון תקינה α ו connexin 43). הם גם קיימו immunogenicity נמוך משמעותית, כפי שהוכח על ידי שלהם נמוך הלע-A ביטוי והבעה הלע-G גבוה. החלת בידול מבוססי צבירה, FTM HUCPVCs הראה היווצרות צבירה מוגבר פוטנציאלי שנוצר קבלנות תאים אשכולות בתוך שבוע אחד של תרבות משותפת בשכבות מזין לב, הופך הסוג MSC הראשון לעשות כן.

התוצאות שלנו להדגים כי אסטרטגיה זו בידול יכול ביעילות לרתום את הפוטנציאל cardiomyogenic של MSCs צעירים, כגון FTM HUCPVCs, מרמז שכי במבחנה קדם הבידול יכול להיות אסטרטגיה אפשרית כדי להגדיל את יעילות הרגנרציה שלהם בתוך vivo.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אי-ספיקת לב (CHF) נמשכת כגורם מוביל התחלואה והתמותה ברחבי העולם. CHF מתרחשת לעיתים קרובות בעקבות אובדן מאסיבי של cardiomyocytes ופיתוח של התא ללא רקמה צלקתית כתוצאה פתולוגי של אוטם שריר הלב (MI)1. הלב הוא איבר באופן חלקי עצמי המתחדש, תושב גזע ו קדמון תא הבריכה אחראי על ביצוע התחדשות רקמות באופן משמעותי פוחתת שפע ומתפקדים בחולים בגילאי, לעתים קרובות להיות מספיק להתאוששות אופטימלית לאחר פציעה. לפיכך, יש עניין רב בפיתוח טיפולים ניסיוניים המערבות את השתלת תאי התורם בריא לתוך שריר הלב הפגוע. זה הכרחי כי תאי התורם לא רק לשחזר את המבנה של הרקמה, אלא גם להשיג התאוששות פונקציונליות של שריר הלב מושפעת.

הלב יליד מעסיקה תושב רקמת הלב ותיקון אנדוגני שמקורם במח העצם בתאי גזע עבור לאחר פציעה2,3,4. משובי תאים-מארח, התורם-נגזר כאחד-חובה יש את היכולת להשיג את פנוטיפ המתאים ואת פונקצית microenvironment של שריר הלב שיפוץ, יחד עם היכולת ביעילות ובבטחה להחליף את התאים אבוד. במבחנה בידול שיטות נעשה שימוש נרחב על מנת להשיג יעילות גבוהה, המבוססים על תאי גזע cardiomyocyte-הייצור-5,-6. לפרופיל ביטוי של סמנים השושלת הלב משמש כדי להגדיר תהליך התמיינות תאי גזע כלפי שושלת היוחסין לב7. בתחילת בידול סמנים, כגון NKX2.5, myocyte משפר פקטור 2 ג (Mef2c), ו-8,GATA49, יכול להיות אינדיקציה אתחול של תהליך cardiomyogenic. סמנים cardiomyocyte בוגר נפוץ כדי להעריך את היעילות בידול הן אות חלבון תקינה α (SIRPA)10, טרופונין לב T (cTnT)11, שרשרת כבדה לב צולבות הקישור חוטים שרירן (MYH6)8,12,13ו connexin 43 (Cx43)14,15,16. השיטות שימוש בתאי גזע עובריים (ESCs) וגזע pluripotent (מגירסה) יש כבר ביסודיות אופטימיזציה ודן לגבי הפרטים של גורמים אינדוקטיבית, חמצן ומילויים הדרגתיים מזין, ואת העיתוי המדויק של פעולה5,6,7,17,18. למרות זאת, ESC-PSC מבוססי טכנולוגיות עדיין להציג את מספר דאגות אתיות ובטיחות, יחד עם תכונות אלקטרופיזיולוגיות אימונולוגי שיוצרת19,20. המארחים מושתלים עם תאים אלה לעיתים קרובות חווים immunorejection ודורשים החיסוני קבוע. זאת בעיקר בשל mismatching תשואה histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) מולקולות המארח של התורם, וכתוצאה מכך T-cell תגובה21. בזמן MHC בודדים מחלקה אני התאמת הוא פתרון אפשרי, פרקטיקה קלינית נגיש יותר ידרוש מקור תא זה אוניברסלית immunoprivileged להתגבר על החשש מדחייה.

כמקור חלופי תא לשימוש ביישומים קליני, MSCs ובמיוחד, BMSCs, נחקרו לשימוש בהתחדשות רקמות מאז תיאור הראשונית שלהם בשנת 199522. MSCs מאמינים כי תושב תאים משובי שניתן למצוא כמעט בכל רקמה vascularized23. על בידוד מן המקור הרצוי, MSCs ניתן בקלות להרחיב בתרבות, יכולת paracrine נרחב, לעיתים קרובות בעלי immunoprivileged או immunomodulatory מאפיינים24,25. הבטיחות והיעילות שלהם כבר הוכחו במספר מחקרים קליניים, בפרט עבור התחדשות לב3,26.

אסטרטגיות רבות של בידול MSC לנצל סוכנים תרופתי, כגון 5-azacytidine22 , דימתיל סולפוקסיד27, ואת הצמיחה או גורמים morphogenic, כמו BMPs5,7,28,29 או אנגיוטנסין-II30, עם יעילות משתנה. אסטרטגיות אלו, עם זאת, אינם מבוססים על המכשולים תא משובי תמים סביר להניח שתיתקל לאחר שנשלחה אל האתר של פציעה או ויוו. אסטרטגיות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית, עוד יותר קשה להגדיר, לתמרן, מבוססים על ההנחה כי בידול MSC יכולה להיגרם באמצעות אותות microenvironment הרקמה עצמה. מחקרים קודמים הראו כי החשיפה לב תא lysates31 או32,חדרית שריר הלב33או ישיר קשר cardiomyocytes הראשית in vitro לקשרי15,34, באפשרותך להגדיל את הביטוי של סמני לב MSCs. אחרים הדגים cardiomyogenesis ספונטנית לאחר טיפול פציעות לב עם MSCs35,36,37,38, למרות בחלקו, היתוך גרעיני של BMSCs, cardiomyocytes39,40 שנוצר לשריר המתהווה. לידע שלנו, cardiomyocytes פונקציונלי, מתקשרת באופן ספונטני של MSCs אנושי (hMSCs) של כל מקור הרקמה לא טרם דווחו.

הקונצנזוס הנוכחי הוא כי כל MSCs נובעים תאים perivascular23. יאנג MSCs עם מאפיינים pericyte ניתן לבודד מאזור perivascular של42,41,רקמה אנושית הטבור43. בהשוואה BMSCs, HUCPVCs בעלי פוטנציאלי מוגבר בידול, מספר יתרונות משובי אחרים, שניהם במבחנה41,44 ו ויוו45,46,47. ראוי לציין, המקור להיות הממשק אמהי-עוברית, HUCPVCs יש immunogenicity נמוך משמעותית בהשוואה למבוגרים מקורות של MSCs. המחקר שלנו מתמקד אפיון ויישומים קליניים של FTM HUCPVCs, המקור הצעיר של MSCs חקירה, אשר בעבר הראינו הגבירו proliferative ומעלה multilineage הבחנה הקיבולות, כולל השושלת cardiomyogenic41.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמשלב היווצרות צבירה ושכבות המזין העיקרי תא לב כמו אינדוקטיבית כוחות כדי להשיג את הבידול cardiomyogenic מלאה של אגרגטים MSCs. לספק סביבה תלת-ממד, כדאי מודלים תנאים ויוו לעומת תרבויות חסיד 2D. ניצול שכבות הלב מזין מספק סביבה נציג של האתר השתלת האולטימטיבי MSCs. נדגים כי מקורות הצעיר של MSCs מבודד חוטי חבל הטבור לפני או אחרי לידה יש יכולת גבוהה יותר טופס אגרגטים ולהגיע על פנוטיפ לב בהשוואה למבוגרים BMSCs, תוך שמירה על הזכות-החיסון שלהם. מלבד גובה תלול של השושלת לב סמן גנים, הביטוי המושרה תאיים (קרי, cTnT ו- MYH6) וחלבונים תא-פני (קרי, SIRPA ו Cx43) ספציפיות עבור cardiomyocytes, אנו מראים כי הפוטנציאל בידול של FTM HUCPVCs ניתן לשלוט באמצעות שיטה זו, כי הם יכולים להצמיח באופן ספונטני קבלנות תאים, כמו cardiomyocyte.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים שכללו בעלי חיים נערכו ודווחו בהתאם להנחיות ARRIVE48. כל המחקרים בוצעו באישור ועדת האתיקה של המחקר המוסדי (מספר REB 454-2011, מכון המחקר סאניברוק; REB 29889, אוניברסיטת טורונטו, טורונטו, קנדה). כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של רשת הבריאות האוניברסיטאית (טורונטו, קנדה), וכל בעלי החיים קיבלו טיפול אנושי בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, מהדורה 8 (המכונים הלאומיים לבריאות 2011).

1. תרבית רקמות

  1. תרבית FTM HUCPVCs, מונח HUCPVCs (שהוקם בעבר, n ≥ 3 קווים עצמאיים לכל אחד)42 ו-BMSCs זמינים מסחרית במדיום חיוני מינימלי אלפא (MEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) וקוקטייל 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S). תרבית קרדיומיוציטים ראשוניים של חולדות ותרביות MSC-קרדיומיוציטים במדיום הנשר המותאם של Dulbecco: תערובת נוטריאנטים F-12 (DMEM-F12) המכילה 10% FBS ו-1% P/S.
    הערה: עקר את המדיום באמצעות מסנן של 0.2 מיקרומטר. אחסן תמיסות בינוניות מוכנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 3 שבועות.
  2. שמור על תרביות תאים בחממות לחות (95% לחות יחסית, 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2) ומעבר במפגש של 70-80%, שנקבע על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. השתמש בנפחים מתאימים של מדיום לגודל צלחת תרבית הרקמה המשמשת (למשל, 10 מ"ל בצלחת של 10 ס"מ ו-2 מ"ל לבאר בצלחת תרבית רקמות של 6 בארות). השתמש בתנאי תרבית אלה למשך הפרוטוקול.
  3. נתק את MSC חד-שכבתי למעבר או להקמת תרבית משותפת של MSC-cardiomyocyte באמצעות תמיסת אנזים דיסוציאציה (2 מ"ל/באר בצלחת של 6 בארות) ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
  4. העבירו את התאים המנותקים לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות.
  5. שאפו את הסופרנטנט מבלי לשבש את כדור התא והשעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום תרבית המתאים לספירה באמצעות מונה תאים אוטומטי. זרע את התאים כמתואר בסעיפי הפרוטוקול הבאים.

2. הכנת תרביות קו-רסק ראשוניות של קרדיומיוציטים-MSC של חולדות

  1. השג רקמת לב לבידוד קרדיומיוציטים ראשוני.
    1. המתת חסד של גורי חולדות (5-6 ימים לאחר הלידה) באמצעות חנק CO2. הגדר את תאי CO2 ל-20% החלפת גז (קצב זרימה = 0.2 x נפח תא לדקה). אשר יציאה על ידי היעדר רפלקס הצביטה.
    2. הסר את הפרוזדורים עם כלי הדם העיקריים המחברים באמצעות מכשירים מעוקרים (כלומר, מלקחיים ומספריים מעוקלים)41. העבירו את הלבבות לצינורות של 50 מ"ל המכילים PBS סטרילי עם 1% P/S (PBS-P/S) על קרח.
    3. חותכים את החדרים לשניים ונותנים לדם להישטף בכלי של 10 ס"מ עם 10 מ"ל PBS-P/S על קרח. חותכים את דפנות החדרים לחתיכות קטנות (קוטר = 2-3 מ"מ) בעזרת מספריים מעוקלים.
    4. העבירו את חלקי הלב מ-10-12 בעלי חיים לצינור של 50 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית ותנו להם להתייצב.
    5. הסר כמה שיותר PBS-P/S מבלי להסיר חלקי לב. הוסף 10 מ"ל של PBS-P/S חדש.
  2. עכל את רקמת הלב כדי לבודד את הקרדיומיוציטים.
    1. הניחו לחתיכות הלב להתייצב. החלף את ה-PBS-P/S ב-10 מ"ל של 0.15% טריפסין ב-PBS ונער ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. השליכו את הסופרנטנט. חזור על העיכול המתואר בשלב 2.2.1 שלוש פעמים נוספות, אך שפך את הסופרנטנטים לתוך צינורות איסוף של 50 מ"ל המכילים 10 מ"ל של 100% FBS.
  3. צנטריפוגה את התאים (400 x גרם, 5 דקות) ושואב את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים ב-DMEM-F12 המכילים 10% FBS ו-1% P/S וזרע על צלחת של 6 בארות (1 x 105 תאים/ס"מ2, 2 מ"ל מדיום לבאר).
  4. לאחר שעה, העבירו את המדיום המכיל תאים לא מחוברים לצינור של 50 מ"ל והשליכו את התאים המחוברים. ספרו את התאים בהשעיה וצלחו אותם מחדש ללוחות חדשים של 6 בארות (1 x 105 תאים/ס"מ2, 2 מ"ל של DMEM-F12 המכילים 10% FBS ו-1% P/S לבאר).
  5. מעכב התפשטות תאים עם ברומודוקסיורידין (BrdU).
    זהירות: BrdU הוא טרטוגן חזק וחשוד למוטגן. אנא ודא שניתנת הדרכה מתאימה ועיין בגיליון נתוני הבטיחות לפני השימוש.
    1. לאחר חיבור התאים, החלף את המדיום בצלחת 6 הבארות ב-DMEM-F12 המכיל 10% FBS, 1% P/S (2 מ"ל מדיום לבאר) ו-5 מיקרומטר BrdU. דגירה למשך 16 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
    2. הסר את המדיום המכיל BrdU והחלף ב-DMEM-F12 המכיל 10% FBS ו-1% P/S (2 מ"ל מדיום לבאר).
  6. הכן MSCs מוכתמים מראש.
    1. לאחר שתרביות MSC נמצאות במפגש של 70-80% בכלים של 10 ס"מ, הסר את מדיום התרבות והוסף 3 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה של תאים. דגרו את המנה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 5 דקות.
    2. העבירו את התאים המנותקים לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות.
    3. שאפו את הסופרנטנט מבלי לשבש את גלולת התא והשעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של DMEM-F12 המכיל 10% FBS ו-1% P/S לספירה באמצעות מונה תאים אוטומטי.
    4. לדלל את התאים לריכוז של 1 x 106 MSC/mL של DMEM-F12 המכיל 10% FBS ו-1% P/S.
    5. דגרו את ה-MSCs עם צבע פלואורסצנטי בר-קיימא שאינו ניתן להעברה (5 מיקרומטר, 30 דקות, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) בצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל למשך שעה אחת.
    6. צנטריפוגה את הצינורות ב-400 x גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-DMEM-F12 המכילה 10% FBS ו-1% P/S לריכוז תאים של 1 x 106 MSC/mL. חזור על זה בסך הכל 3 פעמים.
  7. העבירו את ה-MSCs לקרדיומיוציטים (שלב 2.5.2) בריכוז של 10 x 104 תאים לבאר של צלחת 6 הבארות.

3. הכנת תרביות משותפות מצטברות

  1. הכן תרחיף חד-תאי של MSCs (2 x 104 תאים/מ"ל של מדיום, מעבר # ≤ 6) באלפא-MEM בתוספת 10% FBS ו-1% P/S (ראה שלב 2.6).
    הערה: עיין בסעיף 1 של הפרוטוקול למעבר תאים. לחלופין, יש לצבוע מראש MSCs לפי שלב 2.6.
  2. התחל היווצרות אגרגטים על ידי הנחת טיפות של 25 מיקרוליטר של תרחיף תאים (500 תאים) על המשטח הפנימי של המכסים של צלחות תרבית רקמה בגודל 10 ס"מ (עד 50 טיפות למכסה). הנח את המכסים על עמיתיהם התחתונים המכילים PBS-P/S. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    הערה: מניחים 5-7 מ"ל של PBS-P/S בצלחת התרבות מתחת לטיפות התלויות כדי למנוע אידוי טיפה.
  3. צפו בהיווצרות מצטבר בטיפות לאחר 3 ימים באמצעות סטריאומיקרוסקופ. אם מעל 40 מתוך 50 טיפות מכילות אגרגטים שנוצרו, אסוף את הטיפות מהמכסים באמצעות מיקרופיפטה של 1 מ"ל והעביר את האגרגטים ישירות לחד-שכבות קרדיומיוציטים ראשוניות של חולדות (הוכן בשלבים 2.1-2.7; 10 טיפות לבאר). הימנע מפיפטינג נמרץ כדי לשמור על שלמות הצבירה.
  4. שמור תרביות משותפות מצטברות בחממות עד שבועיים, ושנה את הנפח המלא של המדיום (2 מ"ל של DMEM-F12 המכיל 10% FBS ו-1% P/S לבאר) כל 72 שעות.
    1. התבונן מדי יום באגרגטים המחוברים לשכבות תאי הזנה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. רשום אגרגטים חוזיים כאשר נצפים.
  5. הכן אגרגטים לניתוח.
    1. הסר את המדיום והוסף 2 מ"ל PBS לכל באר של צלחת תרבית רקמות בת 6 בארות. הסר את ה- PBS והוסף 2 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה לבאר. יש לדגור למשך 3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    2. צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות לקבלת כדור תא. השעו מחדש במדיום, כמפורט עבור היישומים המתוארים בשלבים הבאים (ראה שלבים 4.1, 5.1 ו-6.1) ועברו דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר.

4. ציטומטריית זרימה (FC) ומיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS)

  1. דגירה של תרחיפי תאים (1 x 105 תאים ב-200 מיקרוליטר של PBS המכילים 3% FBS) עם נוגדנים ראשוניים מצומדים פלואורופור (FITC או APC) (כלומר, CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G ו-SIRPA עבור FC או TRA-1-85 עבור FACS; 1:40) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, מוגנים מפני אור.
  2. צנטריפוגה (400 x גרם, 5 דקות) ולהשעות מחדש את התאים ב-1 מ"ל של PBS עם 3% FBS עבור FC או PBS עם 0.5% FBS עבור FACS.
    הערה: ה-FC של MSCs עבר אופטימיזציה על ידי הונג ואחרים.41.
  3. שמור על התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך עד שהם מוכנים לניתוח על ידי FC (לפחות 1 x 104 אירועים) או FACS. מיין את התאים כמתואר41. צלח מחדש תאים ממוינים TRA-1-85 חיוביים גבוהים בצלחות של 6 בארות (1 x 104 תאים / באר, 2 מ"ל של DMEM-F12 המכילים 10% FBS ו- 1% P/S) תוך שעה < / > הערה: לאסטרטגיית השער של אנטיגן פני התא האנושי TRA-1-85, ראה איור משלים.

5. אימונוציטוכימיה (ICC) ומיקרוסקופיה

  1. צלחת מחדש של תרחיפי התאים המתקבלים מהתרביות המשותפות (שלב 3.5.2) או FACS (סעיף 4) על שקופיות תא (1 x 104 תאים / באר, 2 מ"ל של DMEM-F12 המכיל 10% FBS ו- 1% P / S לבאר). תן לתאים להיצמד למשך הלילה באינקובטור תרבית רקמה (ראה סעיף 1 לתנאים).
  2. תקן את התאים באמצעות 3 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף 3 פעמים עם 3 מ"ל PBS המכיל 1% אלבומין בסרום בקר (BSA; PBS-BSA) למשך 5 דקות לכל כביסה.
    זהירות: ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת טיפול ב-PFA.
  3. לחדור לתאים ב-3 מ"ל של PBS-BSA עם 0.1% טריטון X-100. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עבור אנטיגנים תוך-תאיים (כלומר, אקטינין אלפא סרקומרי (aSarc) ו-Cx43), או 25 דקות עבור אנטיגנים תוך-גרעיניים (כלומר, Mef2c ואנטיגן גרעיני אנושי (HuNu)). שטפו 3 פעמים עם 3 מ"ל PBS-BSA למשך 5 דקות לכל כביסה.
  4. חסום את הדגימות כנגד תגובות נוגדנים לא ספציפיות עם 3 מ"ל של PBS המכיל 5% סרום עיזים רגיל (NGS) ו-1% BSA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו 3 פעמים עם 3 מ"ל PBS-BSA למשך 5 דקות לכל כביסה.
  5. דגירה של התאים בנוגדנים הראשוניים (כלומר, Mef2c, aSarc, Cx43 ו-HuNu) מדוללים ב-1:200 ב-3 מ"ל של PBS-BSA ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  6. יש לשטוף 3 פעמים עם 3 מ"ל PBS-BSA למשך 5 דקות לכל שטיפה ולדגור עם נוגדנים משניים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו 3 פעמים עם 3 מ"ל PBS-BSA למשך 5 דקות לכל כביסה.
  7. אחסן את הדגימות המוכתמות ב -3 מ"ל של מדיום הרכבה.
  8. רכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש במטרה של פי 10 (NA = 0.3), ובמטרה של פי 20 (NA = 0.45) להדמיה בהגדלה נמוכה יותר. השתמש בקוביות מסנן פלואורסצנטי ואורכי גל עבור GFP (למשל = 470/22 ננומטר, em = 525/50 ננומטר) ו-RFP (למשל = 531/40 ננומטר, em = 593/40 ננומטר) עבור הנוגדנים המשניים המשמשים (ראה טבלת חומרים וציוד).
  9. כימות תמונות באמצעות תוכנת הדמיה (ראה טבלת חומרים וציוד לתוכנה המומלצת). נרמל את קריאות עוצמת הקרינה לרכישות הבקרה המשניות.

6. בידוד RNA ו-RT-PCR כמותי

  1. הכן דגימות RNA מתרביות MSC לא מובחנות או MSCs ממוינות מתרביות משותפות באמצעות בידוד RNA מבוסס עמודות, על פי הוראות היצרן. הכן 1 x 104 עד 1 x 106 תאים ב-0.7 מ"ל של מאגר ליזה תאים (מסופק עם ערכת בידוד RNA) לכל דגימה.
  2. הכן cDNA מעד 2 מיקרוגרם של RNA לכל תגובת RT של 100 מיקרוליטר.
  3. בצע qPCR באמצעות 10 ננוגרם של cDNA לכל תגובה (40 מחזורים, 60 מעלות צלזיוס חישול/הארכת טמפרטורה).
    1. השתמש בפריימרים עבור MY6H ו-cTnT אנושיים בריכוז של 500 ננומטר ו-1-100 ננוגרם של cDNA לכל תגובה (ראה טבלת חומרים וציוד). השתמש ב-GAPDH, ACTB ו-HPRT כמנרמל משק בית פנימי. השתמש בקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע אנושיים הזמינים מסחרית כבקרה חיובית.
      הערה: בטא את שינוי הקיפול של הביטוי בהשוואה לדגימות cDNA שמקורן ב-MSC לא מובחנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HUCPVCs מציגים פוטנציאל היווצרות צבירה ורמות ביטוי CD49f גבוהות יותר בהשוואה ל-BMSCs:

כדי לגרום להתמיינות של hMSCs (כלומר, FTM HUCPVCs, מונח HUCPVCs ו-BMSCs), תרחיפים חד-תאיים של MSCs לא מובחנים או טיפות תלויות המכילות MSC (טבלה 1) הועברו לחד-שכבות קרדיומיוציטים ראשוניות של חולדות כדי ליצור תרביות משותפות ישירות או תרביות משותפות מצטברות, בהתאמה. שלושת סוגי MSC השונים הראו שפע ומראה דומ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבידול הלב של תאי גזע נמצא בפיתוח במשך יותר מ 2 עשורים, עם מספר אסטרטגיות שונות בשימוש ליצירת תאים דמויי cardiomyocyte ממקורות MSC. רבים של אסטרטגיות אלו, עם זאת, הם לא יעילים, התנאים בהם נעשה שימוש לעתים קרובות לא נציג הסביבה, מושתלים תאים מפגש ויוו.

בניגוד לשיטות הקיימות, פרוטוקול המובאת כאן מנצל שילוב של ראשי מזין לב שכבות ויצירת צבירה MSC. הרבדים מזין הלב הראשי מספק סביבה בידול דומה לזה אשר hMSCs נחשפים על השתלת. מצרפי ליצור סביבה עם מעברי צבע חמצן, מזין, אשר יכולה להיות השפעה השר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ד ר קליפורד ל' Librach הוא מחזיק משותף של הפטנט: שיטות בידוד ושימוש של תאים שמקורם ברקמות חבל הטבור בשליש הראשון, העניק קנדה ואוסטרליה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים תודה חברי הצוות הבאה ומחקר סגל על תרומתם: מתיו Librach, ליילה בית, טניה א Baretto, שלומית קניגסברג ו אנדרה גותייה-פישר. עבודה זו נתמכה על ידי אונטריו מחקר קרן - מחקר (ORF-RE, עגול #7) ומצוינות ליצור תוכנית בע מ

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין/EDTAGibco25200056לדיסוציאציה של תאים
Alpha-MEMGibco12571071למדיית תרבית HUCPVC ו-BMSC.
נוגדן CD49f מצומד PE אנטי אנושי/עכברBiolegend313612סמן אינטגרין עבור נוגדן
Cx43/GJA1 אנושי מצומד FC APC& D SystemsFAB7737Aסמן Connexin 43 עבור
נוגדן HLA-A2 מצומד FC FITCGenway Biotech Inc.GWB-66FBD2סמן אימונוגניות עבור
נוגדן FC FITC מצומד נגד HLA-G [MEM-G/9]Abcamab7904סמן אימונוגניות עבור נוגדן מצומד עכבר FC
FITC אנטי אנושי SIRPA/CD172aMCA2518Fסמן לב עבור
נוגדן TRA-1-85/CD147 אנושי מצומד FC APC& D SystemsFAB3195Aסמן תאים אנושיים עבור FC ו-FACS
FITC אנושי מצומד TRA-1-85/CD147& D SystemsFAB3195Fסמן תאים אנושיים לנוגדנים FC ו-FACS
Anti-connexin 43/GJA1Abcamab11370Cx43. עבור
נוגדן משני בעל ספיגה צולבת IgG (H+L) נגד ארנב ICC, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21428עבור נוגדן
אלפא אקטינין אנטי-סרקומרי ICC [EA-53]Abcamab9465aSARC. עבור נוגדן
משני בעל שרשרת כבדה IgM נגד עכבר ICC, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21426עבור נוגדן ארנב ICC
Mef2C (D80C1) XP NewEngland BioLabs Ltd.5030Sעבור
נוגדן משני נגד ארנב ICC חמור IgG (H+L), Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21206עבור נוגדן ICC
נגד גרעינים (HuNu) (שיבוט 235-1)EMD MilliporeMAB1281 עבור ICC
MZ9.5 סטריאומיקרוסקופLeicaלאגרגטים הדמיה.
מיקרו-צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"לAxygenMCT-150-Cלצביעה של MSCs בצבע פלורסנט.
ImageJתוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח.
אריה II מתקן מועדון הכדורגל BD UHN SickKids. למיון תאים.
תאי סטרומה מזכימליים של מח העצםLonzaPT-2501BMSCs
אלבומין בסרום בקרSigma-AldrichA7030-100GBSA. להכנת פתרונות ל-ICC
BrdUEMD MilliporeMAB3424זהירות: BrdU הוא טרטוגן חזק וחשוד במוטגן. אנא הקפידו על הכשרה מתאימה והתייחסו ל-SDS לפני השימוש.
Canto IIBDUHN SickKids FC Facility. לציטומטריית זרימה.
cDNA EcoDry PremixClontech/Takara639570להכנת cDNA עבור qPCR
CellTracker Green CMFDA DyeLife TechnologiesC7025הדמיה פלואורסצנטית של ציטופלזמה תאית
Countess מונה תאים אוטומטיInvitrogen Inc.C10227לספירת תאים
DMEM-F12סיגמא-אולדריץ'D6421למדיום תרבית קרדיומיוציטים ראשוני של חולדות.
תמיסת מלח פוספט חוצצתGibco, ללא Ca2+, Mg2+
EVOSLife Technologiesמיקרוסקופ פלואורסצנטי פנימי
FACSCaliburBDבתוך הבית. לציטומטריית זרימה.
סרום בקר עוברי (Hyclone)GE HealthcareSH3039603FBS. מרכיב במדיום תרבית תאים.
בדיקות IDT Prime Time qPCRטכנולוגיות נתונים משולבותFAM fluorophorehttp://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor הרכבה מימית בינוניתThermoScientificTA-030-FMלאחסון תאים לעבור ICC
LSR II מתקן מועדון הכדורגל BD UHN SickKids. לציטומטריית זרימה.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Facility. למיון תאים.
סרום עיזים רגילטכנולוגיית איתות תאים5425SNGS. משמש בתמיסת חסימה עבור ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8 בארותThermo Scientific Nunc155409להכנת דגימות עבור ICC
OmniPur Triton X-100 SurfactantEMD Millipore9410-OPכמרכיב של תמיסת חדירה בעת הכנת תאים ל-ICC
Paraformaldehyde, תמיסה 16%,מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15710לקיבוע תאים עבור ICC.
פניצילין/סטרפטומיציןג'יבקו15140122מרכיב במדיום תרבית תאים.
פריימריםSigmaCustom Standard DNA Oligos, מומלחים, 0.2 μ מול<חזק>CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; <חזק>CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; <חזק>MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; <חזק>MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT
G מניין דיסק מסתובב קונפוקליZeissSickKids Imaging
Facility ReproCardio קרדיומיוציטים שמקורם בתאי hiPSReproCellRCD001Nבקרה חיובית לערכת מיני qPCR
RNeasyQiagen74106לבודד RNA עבור qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074עבור qPCR עם תערובת מאסטר
RPMI 1640GibcoA1049101עבור MSC, מדיום קוקולטורה מונוציטים.
מבחני פריימר qPCR של TaqManThermo Fisher Scientific4444556עבור qPCR
Trypan BlueLife TechnologiesT10282צביעת תאים לצורך כדאיות וספירה
TrypsinGibco272500108לדיסוציאציה של תאים
VolocityPerkin-ElmerVolocity 6.3תוכנת הדמיה
0.2 μ m מסנן נקבוביותThermo Fisher Scientific566-0020לעיקור אמצעי תרבית רקמות
HERAcell 150i CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific51026410לדגירת תאים
פוספט של DulbeccoSigma-AldrichD8537PBS. 1X, ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד
מלקחייםAlmedic7727- A10-704למסירת לב עכברוש. יכול להשתמש בכל מלקחיים דומים.
מספרייםכלי מדע עדינים14059-11לטחינת לב חולדה. מספריים מעוקלים מומלצים.
צינור 50 מ"לBD Falcon352070לאיסוף במהלך איסוף קרדיומיוציטים והליכי תרבית רקמות כלליים
צינור BDפלקון352096להליכי תרבית רקמות כלליים
צלחות 6 בארותThermo Scientific NuncCA73520-906לתרבית רקמות
10 ס"מ כלי תרבית רקמותקורנינג25382-428להיווצרות מצטברים
Axiovert 40C מיקרוסקופZeissלהדמיית שדה בהיר דרך תרבית רקמה חיצונית ושאר הפרוטוקול
70 μ מסננת תאים mFisherbrand22363548כדי להבטיח השעיית תא בודד לפני זרימה ציטומטריה או מיון
Triton X-100EMD Millipore9410-1Lמשמש בתמיסת חדירות עבור ICC
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399כתם המשמש במהלך הדמיה של לוקליזציה של Cx43
R R R 10010023-D-PBS של Dulbecco בדרגת EM מלח

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
  3. Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
  4. Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
  5. Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
  6. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  8. Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
  9. Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
  10. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  11. Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
  12. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  13. Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
  14. Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
  15. Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
  16. van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
  17. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  18. Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
  19. Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
  20. Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
  21. Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1(2014).
  22. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
  23. Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767(2015).
  24. Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4(2008).
  25. Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
  26. Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
  27. Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
  28. Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
  29. Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
  30. Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
  31. Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
  32. Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
  33. Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
  34. Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
  35. Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
  36. Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
  37. Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
  38. Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
  39. Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
  40. Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
  41. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  42. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  43. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  44. Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
  45. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  46. Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
  47. Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
  48. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  49. Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
  50. Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
  51. Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252(2016).
  52. Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
  53. Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
  54. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
  55. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
  56. Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HUCPVC

מאמרים קשורים