מאמר שיטה

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם

DOI:

10.3791/55762

⸱

14 ביוני 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 2Cardiovascular Tissue Bank of Milan, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 3Department of Clinical Sciences and Community Health, Cardiovascular Section, University of Milan, 4Department of Cardiovascular Disease, Development and Innovation Cardiac Surgery Unit, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרכב החלבון של שסתום המיטרל האנושי עדיין לא ידוע חלקית, משום שהניתוח שלו מסובך על ידי תאימות נמוכה ולכן על ידי ביוסינתזה חלבונית נמוכה. עבודה זו מספקת פרוטוקול ביעילות לחלץ חלבון לניתוח של proteome שסתום מיטרלי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח של proteome הסלולר יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות עקב פיתוח של טכנולוגיות המאפשרים זיהוי בקנה מידה גדול וכימות של חלבונים הנוכחי במערכות ביולוגיות מורכבות.ידע שנרכש מתוך גישה proteomic יכול להוביל הבנה טובה יותר של המנגנונים הפתוגניים המונחים ביסוד מחלות, ומאפשרת זיהוי של סמני מחלה אבחנתיים ופרוגנוסטיים חדשים, וכן, בתקווה, של מטרות טיפוליות. עם זאת, שסתום מיטרלי הלב מייצג מדגם מאתגר מאוד עבור ניתוח proteomic בגלל הסלולר נמוכה ב proteoglycan ו קולגן מועשר תאיים מטריקס. זה עושה את זה מאתגר לחלץ חלבונים לניתוח proteomic העולמי. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול התואם ניתוח חלבון לאחר מכן, כגון proteomics כמותי immunoblotting. זה יכול לאפשר את המתאם של נתונים דאגהG ביטוי חלבון עם נתונים על ביטוי mRNA כמותי ניתוח כמותי אימונוהיסטוכימיים. ואכן, גישות אלה, כאשר ביצע יחד, יוביל להבנה מקיפה יותר של המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות, מ mRNA כדי שינוי שלאחר החלבון translational. לכן, שיטה זו יכולה להיות רלוונטית לחוקרים המעוניינים במחקר physiopathology שסתום הלב.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עדויות האחרונות שינו את ההבנה של התפקידים של מנגנונים רגולטוריים רבים המתרחשים לאחר סינתזת mRNA. ואכן, תהליכים טרנסלציוניים, פוסט-תעתיקיים ופרוטוליטיים יכולים להסדיר את שפע החלבון ולתפקודו. הדוגמה - שאומרת כי ריכוזי ה- mRNA הם פרוקסי לאלה של החלבונים המתאימים, בהנחה שרמות התמלילים הן הגורם העיקרי לשפע החלבון - תוקנו חלקית. למרות זאת, רמות התמליל רק מנבאות באופן חלקי את כמות החלבון, מה שמרמז על אירועים פוסט-תעתיק להתרחש כדי לווסת את החלבונים בתוך תאים 1 , 2 .

יתר על כן, חלבונים בסופו של דבר להכתיב את הפונקציה של התא ולכן להכתיב פנוטיפ שלה, אשר יכול לעבור שינויים דינמיים בתגובה גורמים אוטוקרינית, פאראקרין, אנדוקרינית; מתווכים עם דם; טֶמפֶּרָטוּרָה; טיפול תרופתי; ואת המחלה לפתחמנט. לפיכך, ניתוח הביטוי התמקדו ברמת החלבון הוא שימושי כדי לאפיין את proteome ולפרם את השינויים הקריטיים המתרחשים אליו כחלק מחולי המחלה 3 .

לכן, את ההזדמנויות כי proteomics הנוכחי כדי להבהיר בריאות ומחלות התנאים הם אדירים, למרות האתגרים הטכנולוגיים הקיימים. התחומים המבטיחים במיוחד של מחקר, שבהם יכולים פרוטאומיסטים לתרום: זיהוי של ביטוי חלבון שונה בכל רמה ( כלומר, תאים שלמים או רקמות, תאים תת-תאיים ונוזלים ביולוגיים); זיהוי, אימות ואימות של סמנים ביולוגיים חדשים המשמשים לאבחון ולפרוגנוזה של מחלות; וכן, בתקווה, זיהוי של מטרות חלבון חדש שניתן להשתמש בהם למטרות טיפוליות, כמו גם להערכת יעילות התרופות ואת הרעילות 4 .

לכידת המורכבות שלהפרוטאום מייצג אתגר טכנולוגי. כלים proteomic הנוכחי מציעים את ההזדמנות לבצע בקנה מידה גדול, תפוקה גבוהה ניתוח עבור זיהוי, כימות, ואימות של רמות חלבון השתנה. בנוסף, הכנסת שיטות חלוקה והעשרה, שמטרתן למנוע את ההפרעה הנגרמת על ידי החלבונים השופעים ביותר, שיפרה גם את זיהוי החלבון על ידי הכללת החלבונים הפחות שופעים. לבסוף, proteomics הושלמה על ידי ניתוח של שינויים לאחר translational, אשר בהדרגה מופיעים כמו מאפננים חשובים של תפקוד החלבון.

עם זאת, ההכנה המדגם התאוששות חלבון בדגימות ביולוגי תחת ניתוח עדיין להישאר הגבלת הצעדים של זרימת העבודה proteomic ולהגדיל את הפוטנציאל האפשרי pitfalls 5 . ואכן, ברוב טכניקות ביולוגיה מולקולרית כי חייב להיות מותאם, הצעדים הראשונים הם homogenizat רקמותיון ותאי תא, במיוחד במהלך ניתוח של חלבונים בשפע נמוכה עבורם שיטות הגברה לא קיימים. בנוסף, הטבע הכימי של חלבונים יכול להשפיע על ההתאוששות שלהם. לדוגמה, ניתוח של חלבונים הידרופובי מאוד הוא מאתגר מאוד, כי הם מזרזים בקלות במהלך ההתמקדות isoelectric, בעוד חלבונים ממברנה טרנס הם כמעט בלתי מסיסים (נסקרת ב הפניה 5). יתר על כן, השתנות הרכב הרקמה יוצרת מחסום משמעותי לפיתוח שיטת החילוץ האוניברסלית. לבסוף, כי כמעט כל הדגימות הקליניות הן של כמות מוגבלת, זה חיוני כדי לאפשר הכנת חלבון עם התאוששות מקסימלית reproducibility מ כמויות מדגם מינימלי 6 .

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול אופטימיזציה עבור החילוץ חלבון מן השסתום המיטרלי של הלב האנושי, המייצג מדגם מאתגר מאוד עבור ניתוח proteomic. שסתום מיטרלי רגיל הוא compמבנה lx שוכב בין אטריום שמאל החדר השמאלי של הלב ( איור 1 ). זה משחק תפקיד חשוב בשליטה על זרימת הדם מן אטריום החדר, מניעת backflow ולהבטיח את רמת נאותה של אספקת חמצן לכל הגוף, ובכך לשמור על פלט לב נאותה. עם זאת, הוא נחשב לעתים קרובות רקמה "לא פעילה", עם תאיות נמוכה כמה רכיבים, בעיקר מטריקס תאיים. הסיבה לכך היא, בתנאים נורמליים, התאים intervitial valvular תושב (VICs) להציג פנוטיפ שקט עם שיעור נמוך biosynthesis חלבון 7 .

עם זאת, הוכח כי במצב פתולוגי, מספר VICs ב spongiosa עולה סינתזת החלבון שלהם מופעל, יחד עם שינויים פונקציונליים אחרים פנוטיפי 8 . לכן, אין זה מפתיע כי הנתונים המינימליים הזמיניםהספרות מתמקדת בניתוח של שסתומים מיטרליים פתולוגיים 9 , 10 , שבהם מספר מוגבר של VICs מופעל עשוי להסביר את המספר הגבוה יחסית של חלבונים מזוהים.

לסיכום, פרוטוקול זה עשוי לשמש כדי להבין את ההבנה של מנגנונים פתוגניים האחראים על מחלות שסתום מיטרלי באמצעות מחקר של מרכיבי חלבון מיטרלי שסתום. ואכן, הבנה גדולה יותר של התהליכים הפתולוגיים הבסיסיים יכולה לסייע בשיפור הניהול הקליני של מחלות שסתום, אשר האינדיקציות הנוכחיות שלהם להתערבות מבוססות במידה רבה על שיקולים המודינאמיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, לבבות האדם נאספים במהלך explantation multiorgan (זמן איסכמיה קר של 4-12 שעות, כלומר 6 ± 2 שעות) מתורמים רב איברים שלא נכללו בהשתלת איברים מסיבות טכניות או פונקציונליות, למרות פרמטרים אקו-קרדיוגרפיים רגילים. הם נשלחים לבנק רקמות לב וכלי דם של מילאנו, מונזינו Cardiologic מרכז (מילאנו, איטליה) עבור הבנקאות של שסתומים אבי העורקים ריאתי. העלונים האחוריים המיטרליים אינם משמשים למטרות קליניות, ולכן הם נאספים במהלך בידוד שסתום אבי העורקים וריאתי לאחר קבלת הסכמה מדעת מצד קרובי התורמים. רקמת ההשתלה והמחקר נאספת רק לאחר הסכמת ההורים; בגיליון ההסכמה, הם מסמיכים (או לא) את השימוש ברקמת הלב למחקר רק אם אינו מתאים לשימוש קליני בבני אדם ( כלומר, בעיות מיקרוביולוגיות, תפקודיות וסרולוגיות), בהתאם להנחיות ועדת האתיקה שלמרכז קרדיולוגי של מונזינו.

1. הכנת שסתום Mitral

  1. קציר שסתום מיטרלי האדם בהקדם האפשרי לאחר explantation איבר (זמן איסכמיה קרה של 4-12 שעות).
  2. בחדר נקי, הוצא את הלב מתיק ההובלה המכיל פתרון קר (4 מעלות צלזיוס) ( כלומר תמיסת מלח או אירוקולינים בינוניים או ויסקונסין). הכנס אותו לתוך דלי והכניס אותו ארון biosafety (זרימת אוויר אנכי ביוגזאר, Class A, Good Practices טוב (GMP) סיווג) להמשיך בהכנה שסתום.
  3. מניחים את הלב על עטיפה סטרילית חד פעמי בארון. בעזרת אזמל חד פעמי סטרילי, לחתוך את הלב לחלוטין, באופן אופקי לציר המרכזי שלה, על רמת החדרים השמאלית והימנית, כ 4 ס"מ מן השיא.
  4. הזז את אבי העורקים עולה ועורק הריאה כדי להציג את הגג הפרוזדורי השמאלי.
  5. עם מלקחיים autoclavable סטרילית ומבחר, לחתוך סביב האוזן השמאלית עלהגג פרוזדורי שמאל, מה שהופך את שסתום המיטרלית גלוי ומאפשר עבור עלון גדול metral (הקדמי) ואת העלון קטן metral (אחורי) להיות מזוהה.
    הערה: אנטרו-לרוחב ופרוסקופים המדיאלי האחורי מגדירים את הגבול של העלון הקדמי והאזור האחורי.
  6. באמצעות מספריים autoclable סטרילי מלקחיים שאינם טראומטיים, לנתח את אטריום שמאל ועובי דופן החדר סביב היקף שסתום המיטרלית כולה .
  7. זיהוי המשכיות שסתום מיטרו-אבי העורקים.
    הערה: החדר השמאלי מכיל את כל שסתום המיטרל והאקורדים.
  8. הפרד את העלון הקדמי של שסתום המיטרל מעלון שסתום המטרל האחורי, חותך את העלון האחורי לאורך ההכנסה עם החדר (הקומיסר).
  9. לשטוף את העלון האחורי של תמיסת מלח. חותכים את עלון לחתיכות קטנות (<1 ס"מ 2 ) ו בנפרד לעטוף אותם בנייר אלומיניום. הצמד להקפיא אותם עם חנקן נוזלי.
    זהירות: בצע את נוהלי הבטיחות הארגוניים בעת השימוש בחנקן נוזלי.
    1. לטהר את השולחן של הממשלה עם פתרון אלכוהול 70% איזופרופיל ו 6% מי חמצן פתרון בסוף ההליך.

2. חלבון מיצוי

  1. השתמש מלקחיים כדי לאסוף את המדגם מאוחסן חנקן נוזלי ומיד למקם אותו על קרח יבש בעוד עטוף בנייר אלומיניום. אל תשאיר את המדגם להפשר במהלך העברות.
  2. לפני שחיקה, צמרמורת חרסינה / זירקוניום ו העליונות של מערכת מלתעה ( למשל, CryoGrinder), יחד עם המדגם, על ידי לשים אותם בקבוק דיואר המכיל חנקן נוזלי (~ 500 מ"ל).
    זהירות: בצע את נוהלי הבטיחות הארגוניים בעת השימוש בחנקן נוזלי.
  3. שים את המרגמה ואת העלי בתיבה קלקר המכיל קרח יבש. הסר את המדגם מתוך רדיד אלומיניום והכניס אותו לתוך המלט.
  4. Grind tהוא מדגם עם העלי הגדול נגד המרגמה 15-20 פעמים, באמצעות מברג לסובב את העלי. מערבבים את המדגם עם קצה של מרית טרום צונן במהלך תהליך השחזה.
    1. חזור עם העלי הקטן.
  5. מעבירים את המדגם הקרקע צינור שקלול בעבר ( למשל, צינור צנטריפוגה 15 מ"ל) על ידי הפיכת הצינור, הצבתה על המלט, והפך אותם יחד כדי להעביר את המדגם לצינור. השתמש מרית מראש צונן לשחזר את כל החומר מן המרגמה.
    1. שמור את הצינור עם המדגם על קרח יבש, כדי למנוע מדגם הפשרה במהלך ההעברה.
  6. חישוב משקל נטו של המדגם.
  7. נקה את המלט ואת העלי אחרי כל מדגם ולטהר אותם על ידי מעוקר או חימום אותם ב 200 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  8. מעבירים את המדגם אבקת מן צינור צנטריפוגה כדי צינור זכוכית של homogenizer על ידי היפוך.
  9. הוסף Buree אוריאה מסונניםR (8 M אוריאה, 2 M thiourea, 4% w / v CHAPS, 20 מ"מ טריס, ו dithiotreitol 55 מ"מ) כדי צינור זכוכית, 200 μL של חיץ אוריאה עבור כל 10 מ"ג אבקת רקמה.
    הערה: שאריות אבקת שיורית שנותר צינור צנטריפוגה ניתן לשחזר באמצעות חלק נפח מחושב של חיץ אוריאה.
  10. Homogenize המדגם באמצעות stirrer מצויד עם מרגמה זכוכית borosilicate ו עליון polytetrafluoroethylene (PTFE). לאט לאט לחץ על העלי על המדגם עם תנועה מתפתל (1,500 סל"ד) 10 פעמים.
  11. לשחזר את supernatant ולהעביר אותו צינור נקי 1.7 מ"ל צנטריפוגות. שוב לחלץ את המדגם הנותר עם טריים אוריאה חיץ, הוספת חצי נפח בשימוש במהלך החילוץ הראשון.
  12. חזור על שלב 2.10.
  13. לשחזר את supernatant ולשלב אותו עם supernatant משלב 2.11. מניחים את supernatant משולב על מסובבת צינור במשך 30 דקות.
  14. צנטריפוגה הצינור למשך 30 דקות ב XG 13,000 ו 4 ° C.
  15. לשחזר את supernatant אד למדוד את ריכוז החלבון באמצעות assay חלבון Bradford, לפי הוראות היצרן. חנות המדגם ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החילוץ והפירוק של חלבונים במאגר אוריאה תואם באופן ישיר עם שיטות proteomic מבוסס על isoelectrofocusing (דו מימדי אלקטרופורזה (2-DE) 11 ו בשלב נוזלי isoelectric התמקדות (IEF) 12 ) ועם immunoblotting לאחר דילול במאגר Laemmli 13 המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז 14 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צעד קריטי אחד של פרוטוקול זה הוא השימוש של חנקן נוזלי להקפיא את המדגם כדי לצנן את מערכת המטחנה. השימוש בחנקן נוזלי מונע השפלה ביולוגית ומאפשר אבקה יעילה, אבל זה דורש הכשרה ספציפית לטיפול בטוח.

בפרוטוקול זה תכונות מערכת המטחנה עבור מדגם שחיקה כי דגימות קטנות קשה להתאושש מרגמה רגילה ועלי. במקרה זה, דגימות קטנות להתפשט כמו אבקה דקה על פני השטח מרגמה, טיוח אוסף קשה. יתרון נוסף הוא כי המטחנה ממונע, אשר מאפשר מספר גדול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משרד הבריאות האיטלקי תמך במחקר זה (RC 2013-BIO 15). אנו מודים לברברה מישלי על עזרתה הטכנית המצוינת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת0.9% NaCl
Eurocollins ASALF30874046מדיום הובלת איברים מאוזן. שלב 400 מ"ל של Eurocollins A עם 100 מ"ל Eurocollins B כדי לקבל מדיום
BSALF30874022מדיום הובלה של איבר מאוזן. שלב 400 מ"ל של Eurocollins A עם 100 מ"ל Eurocollins B כדי להשיג
חיי גשרויסקונסיןRM/N 4081מדיום הובלה מאוזן של איברים
Biohazard אוויר זרימה אנכיתברדינולהClass A סיווג GMP
Dewar FlaskThermo ScientificNalgene 4150-1000
מערכת Cryogrinderאבחון OPSCG 08-01מערכת מטחנה המכילה מרגמות, עליים ומברג
מלקחיים
מרית
אזמל סטרילי חד פעמיMedisafeMS-10
מספרייםהניתנים לחיטוי
בחירותניתנות לחיטוי
וילון סטרילי חד פעמיMon& Tex3.307.08
תמיסת עיקור עם אלכוהול70% אלכוהול איזופרופיל
תמיסת עיקור עם מי חמצן6% מי חמצן
מיקרופיפטה, 1 מ"ל, עם טיפים
15 מ"ל צינורות צנטריפוגהVWR בינלאומי9278
1.7 מ"ל צינורות צנטריפוגהVWR חוצץ אוריאה PIER90410
8 M אוריאה, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 20 מ"מ Trizma, 55 mM Dithiotreitol
DithiotreitolSigma aldrichD0632-5Gלשימוש עבור מזרק חיץ אוריאה
50 מ"לPICלשימוש לסינון מאגר אוריאה
0.22 ומיקרו; m filterMilliporeSLGP033RBשישמש לסינון מאגר אוריאה
PFTE עלי, 2 מ"לKartell6302חלק מ-Potter-Elvehjem הומוגנייזר
בורוסיליקט מרגמה זכוכיתKartell6102חלק מ-Potter-Elvehjem הומוגנייזר
StirrerVELP scientificaStirrer DLHשישמש להומוגניזציה על ידי Potter-Elvehjem
Bradford Protein Assayמעבדות ביו-ראד5000006
מסובב צינורPbi InternationalF205
חנקן
רדיד
קופסת
קרח
לצנטריפוגה של צינורות צנטריפוגה של 1.7 מ"ל בטמפרטורה של 13,000 x גרם
מקפיא -80° C
חיטוי
איזון
כפפות קריוגניות לחנקן
כפפות
אוורור מאולץ מקצועי ותנורלעיקור
קוקטייל מעכב פרוטאזSigma aldrichP8340-5ML100X פתרון
ProteoExtract ערכת משקעים לחלבוןCalbiochem539180
RapiGestWaters186001861
Cytowww.cytoscape.orgגרסה 2.7פלטפורמת תוכנה לניתוח אונטולוגיה גנטית
תוסף BiNGOhttp://apps.cytoscape.org/apps/bingoגרסה 3.0.3 לניתוח אונטולוגיה גנטית
AlphaB Crystallin/CRYAB נוגדןNovus BiologicalsNBP1-97494נוגדן חד שבטי של עכבר כנגד CryAB
Septin-11 נוגדןנובוס ביולוגיNBP1-83824נוגדן רב-שבטי של ארנב נגד septin-11
FHL1 נוגדןנובוס ביולוגיNBP-188745נוגדן רב-שבטי של ארנב כנגד נוגדן דרמטופונטין FHL-1
Novus BiologicalsNB110-68135נוגדן רב-שבטי ארנב נגד דרמטופונטין
עז אנטי עכבר IgG HRPסיגמא אולדריץ' A4416-0.5MLנוגדן משני לאימונובלוטינג
עז אנטי ארנב מעבדות IgG HRPBio-Rad מעבדות170-5046נוגדן משני לאימונובלוטינג
מלח הובלה מאוזן של Eurocollins בינוניים מאוזנים מנירוסטהנירוסטה מנירוסטה נירוסטה איזופרופיל בינלאומיUrea Sigma aldrich U6504-1KG לשימוש עבור מאגר אוריאה Thiourea Sigma aldrich T8656 לשמש עבור מאגר אוריאה CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR לשימוש עבור מאגר אוריאה נוזליאלומיניוםפוליסטירן צנטריפוגה קרח יבש דיוק לעיקור נוזלי הסעת אוויר טבעי scape

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699(2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

UreaBradfordGene Ontology

מאמרים קשורים