Method Article

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם

DOI:

10.3791/55762

⸱

June 14th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 2Cardiovascular Tissue Bank of Milan, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 3Department of Clinical Sciences and Community Health, Cardiovascular Section, University of Milan, 4Department of Cardiovascular Disease, Development and Innovation Cardiac Surgery Unit, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרכב החלבון של שסתום המיטרל האנושי עדיין לא ידוע חלקית, משום שהניתוח שלו מסובך על ידי תאימות נמוכה ולכן על ידי ביוסינתזה חלבונית נמוכה. עבודה זו מספקת פרוטוקול ביעילות לחלץ חלבון לניתוח של proteome שסתום מיטרלי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח של proteome הסלולר יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות עקב פיתוח של טכנולוגיות המאפשרים זיהוי בקנה מידה גדול וכימות של חלבונים הנוכחי במערכות ביולוגיות מורכבות.ידע שנרכש מתוך גישה proteomic יכול להוביל הבנה טובה יותר של המנגנונים הפתוגניים המונחים ביסוד מחלות, ומאפשרת זיהוי של סמני מחלה אבחנתיים ופרוגנוסטיים חדשים, וכן, בתקווה, של מטרות טיפוליות. עם זאת, שסתום מיטרלי הלב מייצג מדגם מאתגר מאוד עבור ניתוח proteomic בגלל הסלולר נמוכה ב proteoglycan ו קולגן מועשר תאיים מטריקס. זה עושה את זה מאתגר לחלץ חלבונים לניתוח proteomic העולמי. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול התואם ניתוח חלבון לאחר מכן, כגון proteomics כמותי immunoblotting. זה יכול לאפשר את המתאם של נתונים דאגהG ביטוי חלבון עם נתונים על ביטוי mRNA כמותי ניתוח כמותי אימונוהיסטוכימיים. ואכן, גישות אלה, כאשר ביצע יחד, יוביל להבנה מקיפה יותר של המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות, מ mRNA כדי שינוי שלאחר החלבון translational. לכן, שיטה זו יכולה להיות רלוונטית לחוקרים המעוניינים במחקר physiopathology שסתום הלב.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עדויות האחרונות שינו את ההבנה של התפקידים של מנגנונים רגולטוריים רבים המתרחשים לאחר סינתזת mRNA. ואכן, תהליכים טרנסלציוניים, פוסט-תעתיקיים ופרוטוליטיים יכולים להסדיר את שפע החלבון ולתפקודו. הדוגמה - שאומרת כי ריכוזי ה- mRNA הם פרוקסי לאלה של החלבונים המתאימים, בהנחה שרמות התמלילים הן הגורם העיקרי לשפע החלבון - תוקנו חלקית. למרות זאת, רמות התמליל רק מנבאות באופן חלקי את כמות החלבון, מה שמרמז על אירועים פוסט-תעתיק להתרחש כדי לווסת את החלבונים בתוך תאים 1 , 2 .

יתר על כן, חלבונים בסופו של דבר להכתיב את הפ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, לבבות האדם נאספים במהלך explantation multiorgan (זמן איסכמיה קר של 4-12 שעות, כלומר 6 ± 2 שעות) מתורמים רב איברים שלא נכללו בהשתלת איברים מסיבות טכניות או פונקציונליות, למרות פרמטרים אקו-קרדיוגרפיים רגילים. הם נשלחים לבנק רקמות לב וכלי דם של מילאנו, מונזינו Cardiologic מרכז (מילאנו, איטליה) עבור הבנקאות של שסתומים אבי העורקים ריאתי. העלונים האחוריים המיטרליים אינם משמשים למטרות קליניות, ולכן הם נאספים במהלך בידוד שסתום אבי העורקים וריאתי לאחר קבלת הסכמה מדעת מצד קרובי התורמים. רקמת ההשתלה והמחקר נאספת רק לאחר הסכמת ההורים; בגיליון ההסכמה, הם מסמיכים (או לא) את השימוש ברקמת הלב למחקר רק אם אינו מתאים לשימוש קליני ב....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החילוץ והפירוק של חלבונים במאגר אוריאה תואם באופן ישיר עם שיטות proteomic מבוסס על isoelectrofocusing (דו מימדי אלקטרופורזה (2-DE) 11 ו בשלב נוזלי isoelectric התמקדות (IEF) 12 ) ועם immunoblotting לאחר דילול במאגר Laemmli 13 המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז 14 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צעד קריטי אחד של פרוטוקול זה הוא השימוש של חנקן נוזלי להקפיא את המדגם כדי לצנן את מערכת המטחנה. השימוש בחנקן נוזלי מונע השפלה ביולוגית ומאפשר אבקה יעילה, אבל זה דורש הכשרה ספציפית לטיפול בטוח.

בפרוטוקול זה תכונות מערכת המטחנה עבור מדגם שחיקה כי דגימות קטנות קשה להתאושש מרגמה רגילה ועלי. במקרה זה, דגימות קטנות להתפשט כמו אבקה דקה על פני השטח מרגמה, טיוח אוסף קשה. יתרון נוסף הוא כי המטחנה ממונע, אשר מאפשר מספר גדול.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משרד הבריאות האיטלקי תמך במחקר זה (RC 2013-BIO 15). אנו מודים לברברה מישלי על עזרתה הטכנית המצוינת.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תמיסת0.9% NaCl
Eurocollins ASALF30874046מדיום הובלת איברים מאוזן. שלב 400 מ"ל של Eurocollins A עם 100 מ"ל Eurocollins B כדי לקבל מדיום
BSALF30874022מדיום הובלה של איבר מאוזן. שלב 400 מ"ל של Eurocollins A עם 100 מ"ל Eurocollins B כדי להשיג
חיי גשרויסקונסיןRM/N 4081מדיום הובלה מאוזן של איברים
Biohazard אוויר זרימה אנכיתברדינולהClass A סיווג GMP
Dewar FlaskThermo ScientificNalgene 4150-1000
מערכת Cryogrinderאבחון OPSCG 08-01מערכת מטחנה המכילה מרגמות, עליים ומברג
מלקחיים
מרית
אזמל סטרילי חד פעמיMedisafeMS-10
מספרייםהניתנים לחיטוי
בחירותניתנות לחיטוי
וילון סטרילי חד פעמיMon& Tex3.307.08
תמיסת עיקור עם אלכוהול70% אלכוהול איזופרופיל
תמיסת עיקור עם מי חמצן6% מי חמצן
מיקרופיפטה, 1 מ"ל, עם טיפים
15 מ"ל צינורות צנטריפוגהVWR בינלאומי9278
1.7 מ"ל צינורות צנטריפוגהVWR חוצץ אוריאה PIER90410
8 M אוריאה, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 20 מ"מ Trizma, 55 mM Dithiotreitol
DithiotreitolSigma aldrichD0632-5Gלשימוש עבור מזרק חיץ אוריאה
50 מ"לPICלשימוש לסינון מאגר אוריאה
0.22 ומיקרו; m filterMilliporeSLGP033RBשישמש לסינון מאגר אוריאה
PFTE עלי, 2 מ"לKartell6302חלק מ-Potter-Elvehjem הומוגנייזר
בורוסיליקט מרגמה זכוכיתKartell6102חלק מ-Potter-Elvehjem הומוגנייזר
StirrerVELP scientificaStirrer DLHשישמש להומוגניזציה על ידי Potter-Elvehjem
Bradford Protein Assayמעבדות ביו-ראד5000006
מסובב צינורPbi InternationalF205
חנקן
רדיד
קופסת
קרח
לצנטריפוגה של צינורות צנטריפוגה של 1.7 מ"ל בטמפרטורה של 13,000 x גרם
מקפיא -80° C
חיטוי
איזון
כפפות קריוגניות לחנקן
כפפות
אוורור מאולץ מקצועי ותנורלעיקור
קוקטייל מעכב פרוטאזSigma aldrichP8340-5ML100X פתרון
ProteoExtract ערכת משקעים לחלבוןCalbiochem539180
RapiGestWaters186001861
Cytowww.cytoscape.orgגרסה 2.7פלטפורמת תוכנה לניתוח אונטולוגיה גנטית
תוסף BiNGOhttp://apps.cytoscape.org/apps/bingoגרסה 3.0.3 לניתוח אונטולוגיה גנטית
AlphaB Crystallin/CRYAB נוגדןNovus BiologicalsNBP1-97494נוגדן חד שבטי של עכבר כנגד CryAB
Septin-11 נוגדןנובוס ביולוגיNBP1-83824נוגדן רב-שבטי של ארנב נגד septin-11
FHL1 נוגדןנובוס ביולוגיNBP-188745נוגדן רב-שבטי של ארנב כנגד נוגדן דרמטופונטין FHL-1
Novus BiologicalsNB110-68135נוגדן רב-שבטי ארנב נגד דרמטופונטין
עז אנטי עכבר IgG HRPסיגמא אולדריץ' A4416-0.5MLנוגדן משני לאימונובלוטינג
עז אנטי ארנב מעבדות IgG HRPBio-Rad מעבדות170-5046נוגדן משני לאימונובלוטינג
מלח הובלה מאוזן של Eurocollins בינוניים מאוזנים מנירוסטהנירוסטה מנירוסטה נירוסטה איזופרופיל בינלאומיUrea Sigma aldrich U6504-1KG לשימוש עבור מאגר אוריאה Thiourea Sigma aldrich T8656 לשמש עבור מאגר אוריאה CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR לשימוש עבור מאגר אוריאה נוזליאלומיניוםפוליסטירן צנטריפוגה קרח יבש דיוק לעיקור נוזלי הסעת אוויר טבעי scape

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expressio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein ExtractionMitral ValveProteomic AnalysisUrea BufferLiquid Nitrogen GrindingBradford AssayTwo Dimensional ElectrophoresisLiquid Chromatography Mass SpectrometryGene Ontology AnalysisCardiac Valve Disease

Related Articles