Microinjection של ביציות העכבר משמש בדרך כלל עבור transgenesis קלאסי ( כלומר, שילוב אקראי של transgenes) ו CRISPR בתיווך גישור המיקוד. פרוטוקול זה סוקר את ההתפתחויות האחרונות microinjection, עם דגש מיוחד על בקרת איכות אסטרטגיות genotyping.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות
במאמר זה
סיכום
תקציר
השימוש בעכברים מהונדסים גנטית תרם באופן משמעותי למחקרים על תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים בתהליכי vivo . הזרקת pronuclear של ביטוי דנ"א בונה לתוך ביציות מופרות נשאר הטכניקה הנפוצה ביותר לייצר עכברים מהונדס overexpression. עם כניסתה של טכנולוגיית CRISPR עבור מיקוד גנים, הזרקת pronuclear לתוך ביציות מופרות הורחב לדור של שני נוקאאוט ועכברים נוקין. עבודה זו מתארת את הכנת ה- DNA להזרקה ואת הדור של מדריכים CRISPR עבור מיקוד גנים, עם דגש מיוחד על בקרת איכות. ההליכים הגנוטיפיים הדרושים לזיהוי המייסדים הפוטנציאליים הם קריטיים. אסטרטגיות גנוטיפינג חדשניות המנצלות את יכולות ה"רב-ריבוב "של CRISPR מוצגות כאן. הליכים כירורגיים מתוארים גם. יחד, השלבים של הפרוטוקול יאפשר את הדור של genעכברים מותאמים באופן מהותי עבור הקמתם הבאים של מושבות עכבר עבור שפע של תחומי מחקר, כולל אימונולוגיה, מדעי המוח, סרטן, פיזיולוגיה, פיתוח, ועוד.
מבוא
מודלים של בעלי חיים, הן בחולייתנים והן בחסרי חוליות, שימשו כלי עזר לבחינת הפתופיזיולוגיה של מצבים אנושיים כגון מחלת אלצהיימר 1 , 2 . הם גם כלים שלא יסולאו בפז כדי לחפש מחליפי מחלות ובסופו של דבר לפתח אסטרטגיות טיפול חדש בתקווה של תרופה. למרות שלכל מודל יש מגבלות פנימיות, השימוש בבעלי חיים כמודלים מערכתיים שלמים הוא חיוני למחקר ביו-רפואי. הסיבה לכך היא כי הסביבה הפיזיולוגית מטבולית ומורכבת לא ניתן לדמות לחלוטין בתרבית רקמות.
עד כה, העכבר נשאר המין היונקים הנפוצים ביותר המשמשים מניפולציה גנטית כי זה כולל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים אושרו על ידי אוניברסיטת ניו סאות 'ויילס טיפול בבעלי חיים ואתיקה הוועדה.
1. הכנת הטרנסג'ן (אינטגרציה אקראית)
- ג 'ל אלקטרופורזה אקרוטית אנליטית.
- לעכל את הפלסמיד כדי לסתום את transgene באמצעות אנזימים המתאימים (דגירה 1 שעה) או אנזים מהיר digest (15 עד 30 דקות הדגירה) ב thermocycler בעקבות המלצות היצרן (ראה איור 2 א ואת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
להלן, זרימות עבודה עבור microinjection במקרה של אינטגרציה אקראית CRISPR בתיווך גנים מיקוד מתוארים ( איור 1 ).
איור 1: זרימת עבודה אופיינית עבור הדור של עכברים מהונדסים גנטית. עבור אינטגרציה אקראית, transgene מטוהרים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
הדור של עכברים מהונדסים גנטית ידוע להיות מאתגר מבחינה טכנית. עם זאת, הפרוטוקול המוצג כאן היא שיטה אופטימיזציה ופשוט המאפשר אחד לשלוט ולפתור את הטכניקה בזמן שיא. ישנם שני שלבים הכרחיים להשלמת הטכניקה בהצלחה. ראשית, הסינתזה של תבניות DNA לינאריות (לסינתזה של sgRNAs) ניתן להשיג ללא מגנזיום כלורי (MgCl 2 ). עם זאת, מומלץ מאוד להוסיף MgCl 2 באופן שיטתי לתמהיל הראשי כי הכ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מספקים שירותי transgenesis אקדמי בעכברים באמצעות אוניברסיטת ניו סאות 'ויילס מארק ויינרייט אנליטית מרכז.
תודות
המחברים מודים לצוות של מתקן החיות (BRC) על תמיכתם המתמשכת. עבודה זו מומנה על ידי המועצה הלאומית למחקר רפואי רפואי ומועצת המחקר האוסטרלית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מיקרופיפטה 0.1-2.5 μ L | Eppendorf | 4920000016 | |
| מיקרופיפטה 2 - 20 μ L | Eppendorf | 4920000040 | |
| מיקרופיפטה 20 - 200 μ L | Eppendorf | 4920000067 | |
| מיקרופיפטה 100 - 1,000 μ L | Eppendorf | 4920000083 | |
| סמן משקל מולקולרי | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1 kb |
| סמן משקל מולקולרי | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x - מדולל ל-1x |
| אתידיום ברומיד | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR כתם ג'ל בטוח | Invitrogen | S33102 | |
| ערכת מיצוי ג'ל | Qiagen | 28706 | |
| ערכת טיהור PCR (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| (סעפת) | Promega | A7231 | |
| מאגר מיקרו-הזרקה ללא נוקלאז' | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR מבטא פלסמיד (px330) | Addgene | 42230 | |
| מים ללא נוקלאז | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion polymerase | ניו אינגלנד Biolabs | M0530L | |
| T7 ערכת RNA מהירה בתפוקה גבוהה | ניו אינגלנד Biolabs | E2050S | |
| עמודות ספין לטיהור RNA (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| תורם פלסמיד | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa מדיום תרבית עובר | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| Zenith Biotech | ZSCO-100 | ||
| M2 בינוני | סיגמא-אולדריץ' | M7167 | |
| ציטוכלזין B | סיגמא-אולדריץ' | C6762 | |
| שופר | סיגמא-אולדריץ' | A5177 | |
| מיקרו-נימי זכוכית | מכשיר סאטר | BF100-78-10 | |
| פרוטאינאז K | Applichem | A3830.0100 | |
| דומונט #5 מלקחיים | כלים מדעיים | 91150-20 | |
| מספריים לאיריס | כלים מדעיים | 91460-11 | |
| מהדק כלי | מדעיים עדינים | 18374-43 | |
| קליפס פצעים | כלים מדעיים | 12040-01 | |
| אפליקציות קליפים | כלים מדעיים | 12018-12 | |
| מיקרו-מספריים | כלים מדעיים | 15000-03 | |
| כלים מדעיים עדינים של | Cauterizer | 18000-00 | |
| תפרים כירורגיים לא נספגים (אתילון 3-0) | אתיקון | 1691H | |
| 5% CO2 חממה | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| ספקטרופוטומטר | תרמו פישר Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| הגדרת אלקטרופורזה | BioRad | 1640300 | |
| UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
| מיקרוסקופ סטריאוסקופי | אולימפוס | SZX7 | |
| מיקרוסקופ הפוך | Olympus | IX71 | |
| 2x מיקרומניפולטורים | Eppendorf | 5188000.012 | |
| ביציות מניפולטור | Eppendorf | 5176000.025 | |
| מיקרו-מזרק (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| עכברים C57BL/6J זן | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
מקורות
- Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
- Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
