Method Article

אינטגרציה של מיצוי שלב מוצק ממוזער ו LC-MS / MS איתור של 3-Nitrotyrosine בשתן האדם עבור יישומים קליניים

DOI:

10.3791/55778

⸱

July 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Pharmasan Labs, Inc., 2NeuroScience, Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כרומטוגרפיה סלקטיבית ורגישה כרומטוגרפית מסודרת (LC-MS / MS) שיטה בשילוב עם מוצק שלב מוצק שלב על מצב מעורבת קטיון (MCX) 96 מיקרופלטה גם פותחה למדידת חינם nitrotyrosine 3 ( 3-NT) בשתן אנושי עם תפוקה גבוהה, אשר מתאים ליישומים קליניים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חינם 3-nitrotyrosine (3-NT) כבר בשימוש נרחב כמו ביומרקר אפשרי עבור מתח חמצוני. רמות מוגברות של 3-NT דווחו במגוון רחב של מצבים פתולוגיים. עם זאת, שיטות קיימות חסרים את הרגישות ו / או הספציפיות הנדרשת כדי למדוד את רמת אנדוגני נמוך של 3-NT אמין והם מסורבלים מדי עבור יישומים קליניים. לפיכך, שיפור אנליטית יש צורך בדחיפות כדי לכמת במדויק את רמות 3-NT ולאמת את התפקיד של 3-NT בתנאים פתולוגיים. פרוטוקול זה מציג את הפיתוח של כרומטוגרפיה נוירומטית חדשה של ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) בשילוב עם מיצוי שלב מוצק מוצק (SPE) למדידה מהירה ומדויקת של 3-NT בשתן אנושי כמו ביומרקר לא פולשני עבור מתח חמצוני. SPE באמצעות צלחת 96-היטב להפשיט באופן משמעותי את התהליך על ידי שילוב ניקוי המדגם והעשרה אנליטית ללא derivatization מייגע צעדים אידוי, הפחתת צריכת ממס, סילוק פסולת, סיכון של זיהום זמן עיבוד הכולל. העסקת 25 מ"מ אמוניום אצטט (NH 4 OAc) ב pH 9 כמו פתרון elution SPE משופרת באופן משמעותי את הסלקטיביות. תגובת אותות ספקטרומטריית מסה השתפרה באמצעות התאמת מעברי הניטור המרובים (MRM). שימוש של 0.01% HCOOH כתוסף על עמודה pentafluorophenyl (PFP) (150 מ"מ x 2.1 מ"מ, 3 מיקרומטר) שיפור האות בתגובה עוד פי 2.5 וקצר את זמן הריצה הכולל עד 7 דקות. מגבלה נמוכה יותר של quantitation (LLOQ) של 10 pg / mL (0.044 ננומטר) הושגה, המייצג שיפור רגישות משמעותי על מבחני דיווח. שיטה פשוטה, מהירה, סלקטיבית ורגישה זו מאפשרת שתי צלחות של דגימות שתן (n = 192) להיות מעובדות תוך 24 שעות. בהתחשב בביצועים האנליטיים המשופרים במידה ניכרת, ובדגימת שתן לא פולשנית וזולה, המבחן המוצע מועיל לטיפול פרה-קליני וקלינילימודים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההשפעות של לחץ חמצוני על מצגת קלינית כבר דחף בחזית בשנים האחרונות 1 . אחד הביומרקרים הנבדקים הוא 3-nitrotyrosine (3-NT), מוצר יציב סוף נוצר כאשר מינים חנקן תגובתי (RNS) אינטראקציה עם טירוזין, מבשר נוירוטרנסמיטר catecholamine. בעוד 3-NT עשוי להיות ערך קליני כמו ביומרקר עבור RNS in vivo, שינויים משמעותיים של תכונות ותפקודים של טירוזין עלול להשפיע לרעה חלבונים המתאימים פונקציות הסלולר 1 , 2 . מחקר מתפתח הציע כי 3-NT עשוי לשחק תפקיד חשוב בתנאים דלקתיים 3 , הפרעות ניווניות 4 , 5 , מחלות לב וכלי דם 6 ו סוכרת 7 כמו גם תנאים הקשורים מתח חמצוני. עם זאת, אלה obseRvations מבוססים על תוצאות מתודולוגיות חסרות רגישות ו / או סלקטיביות 8 , 9 , 10 , 11 . טווחי הריכוז העצומים 3-NT עבור הדגימות הביולוגיות שדווחו בעבר בספרות מגלות כי בעיות אנליטיות חמורות קשורות עם מבחנים אלה ושיפור טכני נדרש כדי לכמת במדויק את רמות 3-NT ולאמת את תפקידו הפתולוגיה של תנאים אלה .

הכמות של 3-NT חינם מטריצות ביולוגיות מציג אתגר מיוחד לאדם ולכלי 8 , 9 , 10 , 11 . ראשית, רמת עקבות של אנדוגני 3-NT דורש זיהוי רגיש במיוחד; שנית, את קיומו של מספר רב של אנלוגים דומים מבחינה מבנית, במיוחד טירוזין, אשר קייםעודף עצום, דורש מידה גבוהה של סלקטיביות; שלישית, היווצרות artefactual של 3-NT ידי טיטרציה טירוזין עם חנקתי בכל מקום ניטריט דורש שיקול מיוחד במהלך הכנת המדגם, כדי למנוע overestimation שקר של 3-NT.

בין מגוון רחב של מתודולוגיות המשמשות למדידה של 3-NT, MS / MS נחשב לשיטה הסטנדרטית של הזהב, בשל רגישותו הסלקטיבית והבררה שלו 11 , 12 , 13 , 14 . גז כרומטוגרפיה (GC) מצמידים MS / MS מציעה את הרגישות הטובה ביותר, עם זאת, הצעדים derivatization המדגם הכרחי מייגעים מדי זמן רב כדי להיות יעיל עבור כלי קליני 15 , 16 . LC-MS / MS אינו דורש derivatization מדגם מורכב, מה שהופך אותו אופציה מבטיחה יותר. עם זאת, ישנם מספר מכשולים שיש להתגבר עליהםNsitivity של LC-MS / MS שיטות דיווחו בספרות הצרכים כדי לשפר את המדידה של שופע נמוך 3-NT 7 , 17 , 18 ואת זמן התפנית יחסית חייב להיות מקוצר עבור תפוקה גבוהה יישומים 12 , 13 , 17 , 19 .

בנוסף, כאשר בוחנים יישומים קליניים, המטריצה ​​הביולוגית המשמשת משחקת תפקיד משמעותי. זה צריך להיות קל וזול להשיג ולא פולשני אם אפשר 20 , 21 , 22 . פלזמה, המדגם המשמש באופן מסורתי בספרות, אינה מטריצה ​​רצויה מבחינה קלינית, ולכן מתודולוגיה המשתמשת בשתן שאינו פולשני וחסכוני.

מספר ניסיונות לפתח relIable ספציפיים LC-MS / MS מתודולוגיות נעשו באמצעות שתן 9 , 10 , 11 . עם זאת, כולם נמנעו מלהיות סלקטיביים, אמינים או יעילים מספיק לשימוש קליני. האפקטיביות של ה- SPE השולט באמצעות מחסנית שלב הפוכה המסורתית (C18 סוג) כמו ניקוי מדגם לניתוח 3-NT כבר נחקר ו SPE רציף של חילופי קטיון חזקה (SCX) ואת הפוכה שלב C18-OH הוצע 6 , 7 , 19 . שיטה אחת שפותחה לאחרונה LC-MS / MS השתמשו בתהליך טיהור רב של C18 SPE ידנית, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC), ו- SPE באינטרנט לניתוח של 3-NT 23 . למרות ששיטה זו הייתה רגישה מספיק למטרות קליניות, עם LLOQ של 0.041 ננומטר, תהליך הניקוי היה אינטנסיבי ומייגע ו requiאדום 3 מ"ל של שתן, הגבלת הכדאיות שלה עבור תפוקה גבוהה. פולימר מוטבע במולקולה הועסק כמרכיב SPEb כדי לשפר את היעילות של תהליך הניקוי 14 , אך LLOQ שהתקבל (0.7 מיקרוגרם / מ"ל) לא היה נמוך מספיק עבור דגימות קליניות. שיטה נוספת נדרשה דו מימדי LC-MS / MS ו chromatography immunoaffinity עבור ניקוי המדגם על מנת להשיג גבול של גילוי (LOD) של 0.022 nM 24 . בעוד כל השיטות הללו עשו התקדמות בהערכת 3-NT, אף אחד לא השיגו את הרגישות, האמינות, ואת היעילות הדרושים עבור יישומים קליניים.

על מנת לחקור את הפתולוגיה של 3-NT חינם ואת תפקידה כסימן ביולוגי של מתח חמצוני בקליני, פיתחנו מתודולוגיה פשוטה, יעילה, מדויקת ומדויקת, המאפשרת יישומים קליניים עתירי תפוקה 25 . מיניאטורה מעורבת מצב קטיון excHange (MCX) 96-microplate החילוץ גם יושמה כדי להשיג ניקוי מדגם פשוט ויעיל והעשרה של 3-NT ב מיצוי אחד עקיפת החסרונות לראות בשיטות הקיימות הדורשים derivatization, אידוי ו- 2D-LC. כרומטוגרפיה נוזלית עם 0.01% HCOOH כתוסף בשלב נייד הציעה תגובת אות משופרת עם זמן מחזור מהיר. הסלקטיביות השתפרה עוד יותר באמצעות יישום של פתרון ALUT מתון NH 4 OAc עבור elution סלקטיבי של 3-NT, ושימוש במעבר MRM הן עבור 3-NT והן בתקן הפנימי (IS). אפקט מטריצה ​​היה פיצוי על ידי שימוש בכמות מופחתת של 13 המועדפת C שכותרתו IS איזוטופי לכימות. עם הופעתה של מתודולוגיה זו, חוקרים וקלינאים יוכלו לאמת את התפקיד של 3-NT בתנאים קליניים נוספת לחקור את ההשפעה של מתח חמצוני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים שעסקו בדגימות שתן של בני אדם נערכו תוך שמירה על ההליך שאושר על ידי מועצת המנהלים של המוסד הרפואי (Pharmasan / Neuroscience).

1. שתן אוסף דוגמאות וקריאטינין (Cr) קביעת

  1. איסוף 5 מ"ל של דגימות שתן בבוקר לאחר ca. 10 שעות צום לילה בצינור 5 מ"ל תחבורה המכיל 250 μL של 3 N HCl כמו משמר ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. הפשרה ו מערבולת 5 מ"ל שתן התחבורה צינור צנטריפוגה בצנטריפוגה ( למשל Sorvall) (2297 XG, 10 דקות).
  3. Aliquot 1 מ"ל של שתן פעמיים מן צינור 5 מ"ל תחבורה A.
  4. קביעת Cr בשיטת קריאטינין בשתן 26 .

2. הכנה של תקן, IS ו בקרת איכות (QC) דוגמאות

  1. הכן פתרון המניות של 3-NT ב 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​במים עם 0.01% HCOOH שלב נייד A (MA) ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
  2. עשהפתרון 3-NT תקן עבודה בריכוז של 100 ng / mL על ידי דילול 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​3-NT פתרון המניות עם MA.
  3. יצירת תקנים הנעים בין 5 ל 2500 pg / mL על ידי דילול של 100 ng / מ"ל ​​תקן עבודה עם 0.15 M HCl acidified חומצה ריקה חינם של 3-NT יחד עם ריק ריק דוגמאות ריקות.
  4. הכן פתרון המניות של IS 13 C 9 -3 NT ב 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​במים עם MA חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
  5. הפוך פתרון עובד IS ב 500 pg / mL על ידי דילול של 100 מיקרוגרם / מ"ל 13 C 9 -3 NT פתרון מלאי עם MA.
  6. להקים חמש רמות של דגימות QC המכסים את LLOQ, נמוך, בינוני רמות גבוהות ( כלומר , 10, 25, 100, 500 ו 1,250 pg / mL), על ידי דילול של 3-NT תקן העבודה בשתן ריק acidified.

3. הליך מוצק שלב הפקת

  1. ההפשרה דגימות שתן וורטקס, תקנים דגימות QC.
  2. הוסף דגימות שתן, תקנים ו QC SampLes (250 μL כל אחד) עד 32 בארות של נקי 2 מ"ל 96-גם אוסף צלחת.
  3. הציגו את 500 pg / mL IS פתרון עובד (50 μL) לכל טוב, למעט כפול מדגם ריק היטב. הוסף 0.01% HCOOH (50 μL) למדגם ריק כפול היטב.
  4. הוסף LC-MS / MS מים עם 0.1% HCOOH (250 μL).
  5. מערבבים את התערובת לעיל עם פיפטה 8 ערוצים שלוש פעמים.
  6. מכסים את הצלחת עד טעינת SPE.
  7. מניחים צלחת מיצוי MCX 96-well ו מאגר מאגר על מעבד לחץ חיובי.
  8. התנאי את צלחת מיצוי עם זרימת MeOH (200 μL) דרך sorbent.
  9. לאזן על ידי מים זורמים עם HCOOH 2% (200 μL) דרך סורב.
  10. טען את עוצמת הקול של כל אחד מראש דגימות מעורב על צלחת מיוצר מראש בזהירות עם פיפטה 8 ערוצים.
  11. הגדר לחץ חיובי נמוך ( למשל , 3 psi) על מעבד הלחץ חיובי כדי לאפשר לתערובת לזרום thrצריך להספיג לאט, להתאים את הלחץ במידת הצורך.
  12. שטפו את הבארות על ידי מים זורמים עם HCOOH 2% (200 μL) דרך סורב.
  13. שטפו את הבארות על ידי מתנול זורם (200 μL) דרך sorbent.
  14. שטפו את הבארות על ידי מים זורמים (200 μL) דרך sorbent.
  15. יבש את הבארות לחלוטין עם הגדרת לחץ חיובי גבוהה ( למשל , 40 psi) על מעבד הלחץ חיובי.
  16. החלף את המאגר עם נקי 2 מ"ל 96-גם צלחת אוסף.
  17. החל 25 מ"מ NH 4 OAc ב pH 9 (50 μL) כדי elute שמרו את אנליטי ו- IS מהצלחת החילוץ.
  18. פיפטה LC-MS מים עם HCOOH 5% 5 (50 μL) כדי לנטרל את eluate.
  19. מערבבים עם פיפטה 8 ערוצים שלוש פעמים להגיש לתחנת LC-MS / MS לניתוח.

4. LC-MS / MS ניתוח

  1. מדוד במדויק 2,000 מ"ל של מים LC-MS עם גליל מדורגת ולהעביר אותו לתוך בקבוק 2 L.
  2. עמ 'Ipette 200 μL טהור μL לתוך בקבוק מעל המכיל LC-MS מים.
  3. מערבבים היטב ותווית כמו שלב נייד A (MA). כלול ראשי תיבות, תאריך הכנה ותאריך התפוגה.
  4. קח בקבוק 2 L של מתנול LC-MS ותווית כמו שלב נייד B (MB) עם תאריך ההתחלה ותאריך התפוגה.
  5. הגדר טמפרטורה של דוגם אוטומטי ל 4 ° C.
  6. מניחים את צלחת אוסף עם דגימות מוכן לתוך autosampler.
  7. מניחים עמודה PFP (150 מ"מ x 2.1 מ"מ מזהה, 3 מיקרומטר) ואת עמוד השומר בתנור.
  8. הגדר את טמפרטורת התנור ל 30 ° C.
  9. לאזן 10 דקות באמצעות שיטת הרכישה עם elution הדרגתי LC כפי שמוצג בטבלה 1 .
זמן (דקות) מודול אירועים פָּרָמֶטֶר
0 משאבות משאבה ב 'קונק. 5
0.5 משאבות משאבה ב 'קונק. 20
1 משאבות משאבה ב 'קונק. 50
3 משאבות משאבה ב 'קונק. 80
4 משאבות משאבה ב 'קונק. 90
4.01 משאבות משאבה ב 'קונק. 95
5.5 משאבות משאבה ב 'קונק. 95
5.6 משאבות משאבה ב 'קונק. 5
7 בקר תפסיק

טבלה 1: כרומטוגרפיה נוזלית

  1. יצירת רשימת אצווה כוללסטנדרטים, QC ו דגימות שתן.
  2. התחל את אצווה על ידי הזרקה של דגימות מוכן (12 μL).

5. זיהוי שיא, אינטגרציה ועיבוד נתונים

  1. שליטה רכישת נתונים ועיבוד באמצעות התוכנה.
  2. לזהות ולשלב 3-NT ו פסגות IS עבור כל הדגימות.
  3. להקים עקומת תקן עם טווח של 10-2,500 pg / mL עבור quantitation 3-NT על ידי רגרסיה ליניארית של יחס שטח שיא של 3-NT ו- IS לעומת ריכוז נומינלי 3-NT עם גורם שקלול של 1 / x.
  4. לכמת את כל הדגימות באמצעות עקומת תקן.
  5. לקבוע אם דגימות QC ליפול בטווח הוקמה.
  6. להמיר את הריכוזים זוהה של דגימות שתן לתוצאות הסופיות ביחידה של nM או nmol / mmol Cr.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 ממחיש כי 3-NT מופרד לחלוטין chromatographically אחרים דומים מבנית tyrosine דומה אנלוגים תחת תנאי LC אופטימיזציה, אשר מבטלת את שיתוף eluting הפרעות בשל אלה תרכובות מופרז בהרבה וכתוצאה מכך משפר את מידת הסלקטיביות assay. בנוסף, elution שיפוע עם 0.01% HCOOH כתוסף ב MA ו מתנול בקצב זרימה של 0.45 מ"ל / דקה מאפשר elution מהירה של 3-NT ( כלומר , 3 דקות עם זמן אספקה ​​של 7 דקות).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים משמעותיים בריכוזים שפורסמו בעבר בספרות עבור אנדוגני חינם 3-NT בדגימות שתן האדם לחשוף בעיות מתודולוגיות הקשורות מבחני זמין 8 , 9 , 10 , 11 . קביעה מדויקת של רמה בסיסית נמוכה של 3-NT בשתן אנושי נותרה משימה מאתגרת הדורשת אמצעי זהירות מיוחדים עבור הכנת המדגם וניתוח LC-MS / MS. פרוטוקול זה מתאר הליך SPE הרומן בשילוב עם סלקטיבי LC-MS / MS גילוי המאפשר ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים היו מודים סקוט הווארד אביגיל Marinack לתמיכה כללית ותיאום של עבודה זו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-ניטרו-L-טירוזיןסיגמאN7389-5 גרם
3-ניטרו-L-טירוזין-13C<תת>9סיגמא652296-5.0 מ"ג
מפרט מסה שתן זהב גולדןווסט ביולוגיMSG 5000-1L
אואזיס MCX 96-באר ומיקרו; צלחת אלוטיוןמים186001830BA
2 מ"ל 96 צלחת איסוף בארותפנומנקס   AH0-7194
96 מעבד חיובימים 
LC-MS Ultra CHROMASOLV מתנול   Sigma14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV מיםSigma14263-2L
חומצה פורמית לספקטרומטריית מסהSigma94318-50ML-F
תמיסת אמוניום הידרוקסידSigma338818-1L
Ultra PFP פרופיל עמודיםRestek9179362
5500 Triple quadAB Sciex /צור קשר עם היצרן לפרטים נוספים
UFLC-XRShimadzu /צור קשר עם היצרן לפרטים נוספים
Integra 400 Plus רוש/קריאטינין בשתן Jaffé שיטת Gen 2
LCMS מוסמך 12 x 32 מ"מ בקבוקון צוואר בורגמים600000751CV
LCGC מוסמך 12 x 32 מ"מ צוואר בורג בקבוקון התאוששות כוללמים186000384C
5 מ"ל צינור הובלהפניקסTT-3205
50 מ"ל צינור צנטריפוגהקריסטלגן 23-2263
צינור צנטריפוגה 15 מ"לקריסטלגן 23-2266
eLine פיפטה אלקטרוניתSartorius730391
צנטריפוגה מיקרופוגה בקמן קולטרA46474
OHAUS איזון   קנדי סקאלס בע"ממערבל מערבולת 735
 ברנסטד תרמוליןM16715
186005521

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
  3. Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).
  4. Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association? J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).
  5. Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
  6. Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).
  7. Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).
  8. Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).
  9. Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).
  10. Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).
  11. Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).
  12. Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).
  13. Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).
  14. Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).
  15. Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).
  16. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).
  17. Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).
  18. Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).
  19. Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).
  20. Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).
  21. Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).
  22. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
  23. Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).
  24. Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).
  25. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).
  26. Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. , Mannheim. Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html 2011-2011 (2011).
  27. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
  28. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3 Nitrotyrosine DetectionSolid Phase ExtractionLC MS MS AnalysisHuman Urine SamplesOxidative Stress BiomarkerMiniaturized SPE MethodAmmonium Acetate ElutionPFP Column ChromatographyMultiple Reaction MonitoringLower Limit Quantitation

Related Articles