Method Article

אינטגרציה של מיצוי שלב מוצק ממוזער ו LC-MS / MS איתור של 3-Nitrotyrosine בשתן האדם עבור יישומים קליניים

DOI:

10.3791/55778

⸱

July 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Pharmasan Labs, Inc., 2NeuroScience, Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כרומטוגרפיה סלקטיבית ורגישה כרומטוגרפית מסודרת (LC-MS / MS) שיטה בשילוב עם מוצק שלב מוצק שלב על מצב מעורבת קטיון (MCX) 96 מיקרופלטה גם פותחה למדידת חינם nitrotyrosine 3 ( 3-NT) בשתן אנושי עם תפוקה גבוהה, אשר מתאים ליישומים קליניים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חינם 3-nitrotyrosine (3-NT) כבר בשימוש נרחב כמו ביומרקר אפשרי עבור מתח חמצוני. רמות מוגברות של 3-NT דווחו במגוון רחב של מצבים פתולוגיים. עם זאת, שיטות קיימות חסרים את הרגישות ו / או הספציפיות הנדרשת כדי למדוד את רמת אנדוגני נמוך של 3-NT אמין והם מסורבלים מדי עבור יישומים קליניים. לפיכך, שיפור אנליטית יש צורך בדחיפות כדי לכמת במדויק את רמות 3-NT ולאמת את התפקיד של 3-NT בתנאים פתולוגיים. פרוטוקול זה מציג את הפיתוח של כרומטוגרפיה נוירומטית חדשה של ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) בשילוב עם מיצוי שלב מוצק מוצק (SPE) למדידה מהירה ומדויקת של 3-NT בשתן אנושי כמו ביומרקר לא פולשני עבור מתח חמצוני. SPE באמצעות צלחת 96-היטב להפשיט באופן משמעותי את התהליך על ידי שילוב ניקוי המדגם והעשרה אנליטית ללא derivatization מייגע צעדים אידוי, הפחתת צריכת ממס, סילוק פסולת, סיכון של זיהום זמן עיבוד הכולל. העסקת 25 מ"מ אמוניום אצטט (NH 4 OAc) ב pH 9 כמו פתרון elution SPE משופרת באופן משמעותי את הסלקטיביות. תגובת אותות ספקטרומטריית מסה השתפרה באמצעות התאמת מעברי הניטור המרובים (MRM). שימוש של 0.01% HCOOH כתוסף על עמודה pentafluorophenyl (PFP) (150 מ"מ x 2.1 מ"מ, 3 מיקרומטר) שיפור האות בתגובה עוד פי 2.5 וקצר את זמן הריצה הכולל עד 7 דקות. מגבלה נמוכה יותר של quantitation (LLOQ) של 10 pg / mL (0.044 ננומטר) הושגה, המייצג שיפור רגישות משמעותי על מבחני דיווח. שיטה פשוטה, מהירה, סלקטיבית ורגישה זו מאפשרת שתי צלחות של דגימות שתן (n = 192) להיות מעובדות תוך 24 שעות. בהתחשב בביצועים האנליטיים המשופרים במידה ניכרת, ובדגימת שתן לא פולשנית וזולה, המבחן המוצע מועיל לטיפול פרה-קליני וקלינילימודים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההשפעות של לחץ חמצוני על מצגת קלינית כבר דחף בחזית בשנים האחרונות 1 . אחד הביומרקרים הנבדקים הוא 3-nitrotyrosine (3-NT), מוצר יציב סוף נוצר כאשר מינים חנקן תגובתי (RNS) אינטראקציה עם טירוזין, מבשר נוירוטרנסמיטר catecholamine. בעוד 3-NT עשוי להיות ערך קליני כמו ביומרקר עבור RNS in vivo, שינויים משמעותיים של תכונות ותפקודים של טירוזין עלול להשפיע לרעה חלבונים המתאימים פונקציות הסלולר 1 , 2 . מחקר מתפתח הציע כי 3-NT עשוי לשחק תפקיד חשוב בתנאים דלקתיים 3 , הפרעות ניווניות 4 ,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים שעסקו בדגימות שתן של בני אדם נערכו תוך שמירה על ההליך שאושר על ידי מועצת המנהלים של המוסד הרפואי (Pharmasan / Neuroscience).

1. שתן אוסף דוגמאות וקריאטינין (Cr) קביעת

  1. איסוף 5 מ"ל של דגימות שתן בבוקר לאחר ca. 10 שעות צום לילה בצינור 5 מ"ל תחבורה המכיל 250 μL של 3 N HCl כמו משמר ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. הפשרה ו מערבולת 5 מ"ל שתן התחבורה צינור צנטריפוגה בצנטריפוגה ( למשל Sorvall) (2297 XG, 10 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 ממחיש כי 3-NT מופרד לחלוטין chromatographically אחרים דומים מבנית tyrosine דומה אנלוגים תחת תנאי LC אופטימיזציה, אשר מבטלת את שיתוף eluting הפרעות בשל אלה תרכובות מופרז בהרבה וכתוצאה מכך משפר את מידת הסלקטיביות assay. בנוסף, elution שיפוע עם 0.01% HCOOH כתוסף ב MA ו מתנול בקצב זרימה של 0.45 מ"ל / דקה מאפשר elution מהירה של 3-NT ( כלומר , 3 דקות עם זמן אספקה ​​של 7 דקות).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים משמעותיים בריכוזים שפורסמו בעבר בספרות עבור אנדוגני חינם 3-NT בדגימות שתן האדם לחשוף בעיות מתודולוגיות הקשורות מבחני זמין 8 , 9 , 10 , 11 . קביעה מדויקת של רמה בסיסית נמוכה של 3-NT בשתן אנושי נותרה משימה מאתגרת הדורשת אמצעי זהירות מיוחדים עבור הכנת המדגם וניתוח LC-MS / MS. פרוטוקול זה מתאר הליך SPE הרומן בשילוב עם סלקטיבי LC-MS / MS גילוי המאפשר .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים היו מודים סקוט הווארד אביגיל Marinack לתמיכה כללית ותיאום של עבודה זו.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-ניטרו-L-טירוזיןסיגמאN7389-5 גרם
3-ניטרו-L-טירוזין-13C<תת>9סיגמא652296-5.0 מ"ג
מפרט מסה שתן זהב גולדןווסט ביולוגיMSG 5000-1L
אואזיס MCX 96-באר ומיקרו; צלחת אלוטיוןמים186001830BA
2 מ"ל 96 צלחת איסוף בארותפנומנקס   AH0-7194
96 מעבד חיובימים 
LC-MS Ultra CHROMASOLV מתנול   Sigma14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV מיםSigma14263-2L
חומצה פורמית לספקטרומטריית מסהSigma94318-50ML-F
תמיסת אמוניום הידרוקסידSigma338818-1L
Ultra PFP פרופיל עמודיםRestek9179362
5500 Triple quadAB Sciex /צור קשר עם היצרן לפרטים נוספים
UFLC-XRShimadzu /צור קשר עם היצרן לפרטים נוספים
Integra 400 Plus רוש/קריאטינין בשתן Jaffé שיטת Gen 2
LCMS מוסמך 12 x 32 מ"מ בקבוקון צוואר בורגמים600000751CV
LCGC מוסמך 12 x 32 מ"מ צוואר בורג בקבוקון התאוששות כוללמים186000384C
5 מ"ל צינור הובלהפניקסTT-3205
50 מ"ל צינור צנטריפוגהקריסטלגן 23-2263
צינור צנטריפוגה 15 מ"לקריסטלגן 23-2266
eLine פיפטה אלקטרוניתSartorius730391
צנטריפוגה מיקרופוגה בקמן קולטרA46474
OHAUS איזון   קנדי סקאלס בע"ממערבל מערבולת 735
 ברנסטד תרמוליןM16715
186005521

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
    3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3 Nitrotyrosine DetectionSolid Phase ExtractionLC MS MS AnalysisHuman Urine SamplesOxidative Stress BiomarkerMiniaturized SPE MethodAmmonium Acetate ElutionPFP Column ChromatographyMultiple Reaction MonitoringLower Limit Quantitation

Related Articles