הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

8.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55795

⸱

3 באוגוסט 2017

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

במאמר זה

סיכום

עבודה זו מדגימה גישה חדשנית להעריך את התפשטות, הבחנה, ואת היכולת להרכיב פוטנציאל של תאי גזע אנדותל כלי הדם (VESCs) באמצעות השתלת כרית שומן החלב ואחריו הכנת רקמות הר שלם עבור תצפית מיקרוסקופית. א השושלת מעקב אחר אסטרטגיה לחקור את ההתנהגות של VESCs in vivo מוצג גם.

תקציר

תאי האנדותל (ECs) הם אבני הבניין הבסיסיות של הארכיטקטורה הווסקולארית ותווך את צמיחת כלי הדם ואת שיפוץ כדי להבטיח פיתוח כלי תקין הומיאוסטזיס. עם זאת, מחקרים על היררכיה השושלת האנדותל להישאר חמקמק בשל היעדר כלים כדי לקבל גישה, כמו גם להעריך באופן ישיר את ההתנהגות שלהם in vivo . כדי לענות על חסרון זה, מודל רקמות חדש ללמוד אנגיוגנזה באמצעות כרית שומן החלב פותחה. בלוטת החלב מתפתחת בעיקר בשלבים שלאחר הלידה, כולל גיל ההתבגרות וההריון, שבמהלכם התפשטות האפיתל החזקה מלווה בשיפוץ נרחב של כלי הדם. שומני שומן החלב לספק שטח, מטריקס, עשירים אנגיוגניים גירויים מן האפיתל החלב גדל. יתר על כן, רפידות שומן החלב ממוקמות מחוץ חלל הצפק, מה שהופך אותם אתר השתלת נגיש בקלות להערכת פוטנציאל angiogenic של תאים אקסוגניים. עבודה זו מתארת ​​גם יעילותNt מעקב הגישה באמצעות עכברים כתב פלואורסצנטי במיוחד התווית האוכלוסייה ממוקדת של תאי גזע אנדותל כלי הדם (VESCs) ב vivo . שיטה זו מעקב השושלת, יחד עם רקמות שלאחר מכן מיקרוסקופ הר שלם, לאפשר הדמיה ישירה של תאים ממוקד הצאצאים שלהם, שדרכו יכולת התפוצה ניתן לכמת את המחויבות בידול יכול להיות מיפוי גורל. באמצעות שיטות אלה, אוכלוסייה של Bipotent חלבון C קולטן (Procr) להביע VESCs זוהו לאחרונה במערכות כלי הדם מרובים. Procr + VESCs, המביא הן ECs חדשים pericytes, לתרום באופן פעיל אנגיוגנזה במהלך פיתוח, הומאוסטזיס, תיקון פציעה. בסך הכל, כתב היד הזה מתאר השתלה חדשה כרית שומן החלב ב vivo השושלת מעקב טכניקות שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את תכונות תאי גזע של VESCs.

מבוא

במהלך הפיתוח והומיאוסטזיס, צמיחת כלי הדם ושיפוצם נאמנים בהתאם לצמיחת איברים ולתיקונם. אנגיוגנזה מתאר את הדור של כלי דם חדשים מכלי הדם הקיימים, ונחשב לכוח מרכזי המתווך את השינויים הדינמיים הדינמיים. כל כלי דם הוא פנימי שורות עם שכבת תאי האנדותל (ECs), והם נראים הבסיס של הארכיטקטורה כלי השיט. במשך זמן רב, המנגנון שדרכו הבריכה EC מתחדשת במהלך ההומיאוסטזיס נותרה לא ברורה, והועלו טיעונים על השאלה אם מחזור כלי הדם הוא תוצאה של התפשטות הבשלות האירופית או תרומת הפעילות של תאי גזע ו / או אב. בשל היעדר ראיות פיזיולוגיות ישירות, הקיום והזהות הסלולרית של תאי גזע אנדותליים (VESCs) נותרו גם הם שנויים במחלוקת.

אחת הגישות הנפוצות ביותר לאימות התנהגות תאי גזע היא באמצעות הטרנספלאןTation של תאי גזע putative לתוך עכברים מקבלי. שיטה זו מודדת את פוטנציאל הגזע של תאי גזע מועמדים in vivo. ההשתלה יושמה לראשונה על המחקר של תאי גזע של מח עצם 1 , אשר תרמו להקמת המאפיינים ההיררכיים של המערכת ההמטופויטית 2 . בתחום האנדותל, מטריצת קרום במרתף ( למשל, matrigel) תקע מוכנס תת עורי מתחת לעור האגף כבר תקן assay angiogenesis vivo בשימוש כדי להתמודד עם יכולות היווצרות כלי שיט של ECs המושתלים. שיטות ניסיוניות מרובות, כולל היווצרות המושבה במערכות תרבות 3D השתלה, הציעו אבות פוטנציאליים EC / אוכלוסיות VESC 3 , 4 , 5 , 6 . עם זאת, מאז ECs מוטבע במטריצה ​​בממברנה במרתף נפרדים יחסיתהרקמה שמסביב, זה אינו מספק את הסביבה נישה אופטימלי הנדרש כדי לחקור את הפוטנציאל angiogenic של תאים המושתלים. כתוצאה מכך, כלי שנוצרו בתוך תקע המטריצה ​​הם בעיקר נימיות כמו והם ניתנים למדידה באופן פונקציונלי.

בלוטת החלב מתפתחת לאחר הלידה, עם הצמיחה החזקה ביותר המתרחשת במהלך ההתבגרות וההריון. בשלב הבגרותי, האפיתל החלב עובר התרחבות מהירה, כדי לתפוס את כל פנקס השומן החלב, מלווה שיפוץ יעיל של מבנים וסקולריים שמסביב. לפיכך, בלוטת החלב מציעה מודל מצוין לחקר אנגיוגנזה. הוא מספק מרחב, מטריקס ועשירים גירויים אנגיוגניים מן האפיתל החלב גדל ולכן הוא אתר השתלת אידיאלי להערכת פוטנציאל angiogenic של תאים אקסוגניים. בנוסף, פנקס שומן החלב מאפשר כלי אקסוגניים נוצרו להשתלב עם מערכת מחזור המארחת, ומאפשר f נוספתהערכה לא-פונקציונלית ומייצגת יתרון על פני השתלות תת-עורית.

למרות מבחני culturing והשתלות במבחנה הם דרך יעילים כדי לחקור את מאפייני ההתחדשות של אוכלוסיית תא, ידוע כי מבחנים כזה עלולים לעורר פלסטיות כתאים נלקחים מן הגידול הטבעי שלהם, ושינויים עלולים להיגרם כאשר תאים מנותקים הסביבה הפיזיולוגית שלהם 7 . לכן, קבלת ראיות ישירות vivo גורל התא היא הגישה העיקרית לקידום ההבנה הנוכחית של ההתנהגות של אוכלוסיות האנדותל.

מיפוי גורל גנטי ( כלומר, ב vivo השושלת מעקב) הוא הכרחי לזיהוי של VESCs ו לחקירת תכונותיהם במערכת הגוף, כפי שהוא יכול לגלות התנהגות התא גזע vivo בהקשר הפיזיולוגי שלה, ואת הגזע בפועל יכול להיות מוֹעֳרָך. השושלתNg מספק ראיות ישירות להתמדה ארוכת הטווח ( כלומר, התחדשות עצמית) של VESCs המועמדים ויכולתם לייצר סוגי תאים עבור רקמת המוצא ( כלומר, כוח ההבחנה).

פרוטוקול זה מתאר רומן חזה רומן חדש השתלת טכניקה שיטת השושלת השורש כדי לבחון את יכולת ייצור כלי של VESCs. טכניקות אלה להתגבר על חסרונות של מבחני זמין כיום ולספק דרך חדשה כדי להעריך באופן אופטימלי את תכונות תאי גזע של VESCs. גישות אלה הם כלים יעילים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את ההתנהגות ואת כלי יצירת המאפיינים של אוכלוסיות האנדותל, כמו גם לקבוע שינוי פוטנציה תא כוח כלי הדם בתוך סביבה פתולוגית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

נהלים ניסיוניים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ושימוש ועדת שנחאי המכון לביוכימיה וביולוגיה התא, האקדמיה הסינית למדעים תחת פרוטוקול מאושר SIBCB-NAF-15-002-S335-003.

1. בידוד של VESCs מן בלוטת החלב עכבר

  1. קציר בלוטת החלב ועיכול רקמות.
    1. השתמש 8 בן אקטין- GFP בוגרת כתבת בעכברים הכתב, עם משקולות טווח בין 20 ל 25 גרם, כמו תורמים רקמות.
      הערה: תאים שמקורם התורם ניתן לעקוב בקלות על ידי ביטוי GFP.
    2. הכן רקמות בסיס עיכול בינוני המורכב של 5% בסרום שור עוברית (FBS), 1% עט / סטרפט, ו 25 מ"מ HEPES ב RPMI1640. מסננים את התערובת באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לעקר מראש לחמם אותו ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    3. להקריב את העכברים בתא CO 2 . לנתח את הצמד הרביעי של בלוטות החלב משפיעה על ידי ביצוע הראשון עור אנכי אניNcision על קו האמצע התחתונה התחתונה באמצעות אזמל (או מספריים כירורגיים). בעדינות לקלף את העור בצד אחד כדי לחשוף את בלוטת החלב בשדיים באמצעות מלקחיים. השג את בלוטות החלב הרביעיות משני הצדדים וחתך אותן לחתיכות יפות בצלחת פטרי 6 ס"מ בעזרת מספריים.
      1. למדוד את המשקל הכולל של הרקמה טחון ומניחים אותו צינור 50 מ"ל.
        הערה: ודא כי רקמה וכתוצאה מכך הוא קטן מ 1 מ"מ 3 בגודל עבור כל חתיכה. תשואה טיפוסית היא כ -5,000 VESCs לכל בעל חיים.
    4. הכן בינוני בסיס העיכול בצינור 50-מ"ל צנטריפוגה capped בנפח של 10 מ"ל לכל 1 גרם של רקמת בשר. הוסף collagenase סוג 3 בריכוז של 300 יחידות לכל 10 מ"ל של המדיום עיכול בסיס להוות למאגר העיכול. מערבבים באופן שווה ומוסיפים אותו לרקמה.
    5. אופקית במקום צינור 50 צנטריפוגה מ"ל על פלטפורמת נדנדה ולהגדיר את המהירות עד 100 סל"ד ואת הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס. לְהַתְסִיסרקמת החלב עבור 2 שעות. בדוק ידני לנער את הצינור כל 20 דקות כדי להבטיח עיכול תקין.
      הערה: מטרת העיכול ברקמות לפני FACS היא להכין פתרון תא בודד מ רקמות מוצקות. לכן, עד סוף העיכול, התוכן צריך להיות פתרון עבה ללא חתיכות רקמות גלוי.
  2. יחיד פתרון התא הכנה.
    1. לאחר העיכול, למעלה למעלה צינור 50 צנטריפוגות מ"ל עם מראש חימם, סטרילי PBS ולהפוך את הצינור לערבב באופן שווה. צנטריפוגה הצינור ב XG 200 במשך 5 דקות כדי להשיג גלולה התא.
    2. הסר את supernatant וסובב את החלק התחתון של הצינור כדי לשחרר את גלולה התא. הוסף ב 3 מ"ל של תאי דם אדומים lysing חיץ (ראה טבלה של חומרים) ו דגירה ברדס תרבות רקמה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות כדי לחסל את כדוריות הדם האדומות.
    3. הוסף 10 מ"ל של PBS סטרילית להפוך את הצינור לערבב באופן שווה. צנטריפוגה התוכן רקמות ב 200 xg במשך 5 דקות דיסקארד supernatant. הוסף 3 מ"ל של מחומם מראש 0.05% טריפסין ולאחסן את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לעכל עוד את הרקמה הנותרת.
    4. הוסף ב 3 מ"ל של חימם מראש IMDM ולאחר מכן להוסיף 100 μL של DNase אני פתרון (0.25 מ"ג DNase אני מדולל 1 מ"ל של PBS). חנות הצינור על 37 מעלות צלזיוס כדי לשבור את החוטים DNA. לעבור את תערובת רקמות דרך מסננת 70 מיקרומטר התא כדי להשיג את הפתרון התא. שוטפים את מסננת פעמיים עם 2 מ"ל של PBS + 5% FBS לנטרל את העיכול האנזימטי.
    5. צנטריפוגה תערובת התא ב XG 200 במשך 5 דקות כדי גלולה התאים. מחק supernatant ו resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של PBS + 5% FBS עבור מכתים נוגדן.
  3. FACS המבוסס על FACS + בידוד VESC.
    1. נושא תערובת התא המתקבל רקמת החלב התורם מכתים נוגדן בעקבות פרוטוקולים שגרתית שפורסמו 8 .
      הערה: נוגדנים הבאים שימשו: אנטי עכבר(FICC), FTCC, אנטי עכבר CD31 (PECAM1) -PECY7, אנטי עכבר CD105-APC (כולם בשימוש בריכוז של 1 מיקרוגרם / מ"ל), anti-mouse CD201 (Procr) -botin (בשימוש בריכוז של 2.5 מיקרוגרם / מ"ל), ו streptavidin-v450 (בשימוש בריכוז של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל).
      1. לאחר מכתים נוגדנים, למעלה את התאים עם PBS + 5% FBS ואז צנטריפוגה ב 200 גרם במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend התאים עם 1 מ"ל של PBS + 5% FBS. מסנן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. מקום על הקרח עד FACS מיון.
    2. המשך לבצע מיון מבוסס FACS כדי לבודד Procr + VESCs.
      1. לנתח את המדגם unstained וכל צבע אחד שליטה כדי לקבוע את המתח עבור כל צבע. חישוב הפרמטרים פיצוי כדי למנוע אוטומטי הקרינה או מכתים ברקע. הגדרת התבנית עבור gating נכונה ומיון עבור אוכלוסיות תאים הרצוי.
      2. כדי לקבוע את ההיררכיה של מיון FACS, תחילה לסלק פסולתכל האירועים ולאחר מכן להשליך הכפילים או אשכולות תא דבק ידי מפעילה עם רוחב. שער מחוץ לתאי שושלת דם ולאחר מכן להשתמש CD31 + ו CD105 + כדי להגדיר את אוכלוסיות האנדותל.
        הערה: התאים + Procr בודדו מ- CD31 + CD105 + ECs בהשוואה לבקרת FMO. תרשים ניתוח FACS נציג מוצג באיור 1 . A VSC מבודד האוכלוסייה VESC צריך להיות מושעה IMDM + 50% FBS ומאוחסנים על הקרח עד עיבוד נוסף.

2. ב VIVC VIVC VIVC VISC באמצעות לוח שומן החלב

  1. הכן ECs העיקרי להשתלה.
    1. למעלה- FACS תאים מיון עם 10 מ"ל של PBS + 5% FBS ואז צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ליישב את התאים למטה לתחתית.
    2. לשאוב את הנוזל בזהירות, לספור את מספר התא באמצעות hemocytometer, ו resuspend תא גלולה עם תערובת הממברנה במרתף במרתף (קונסיעוקץ של 50% במרתף בממברנה במרתף ו PBS עם 20% FBS, בתוספת 100 ng / mL rmVEGF ו 60 U / מ"ל ​​הפרין) להגיע לריכוז עבודה של 15,000 תאים / 15 μL.
      הערה: תערובת הממברנה במרתף צריך תמיד להיות מאוחסן על הקרח.
    3. סדרתי לדלל את מיון תאים ממוינים ונספרו להגיע לריכוז קלט הנדרש מיקרוטייז 1.5 מ"ל, ולוודא כי נפח הזרקה הסופי לא יעלה על 15 μL בסך הכל. הוסף 0.1% Trypan כחול לכל צינור כדי להדמיה תוכן טוב יותר במהלך ההשתלה. פיפטה ביסודיות לערבב. אחסן את הצינורות על הקרח עד לשימוש.
      הערה: ייצור ספינות מוצלח יכול להיות מושגת עם מינימום של 100 VESCs.
  2. השתלת ECS ראשוני כדי פנקס שומן החלב.
    1. לחטא את מכשירים כירורגי benchtop. אם באמצעות אותם מכשירים על בעלי חיים מרובים, sterilzer חרוז יכול לשמש לחיטוי.
    2. להרדים 3 בן שבוע BALB / c mic עירוםE באמצעות פרוטוקול ההרדמה המומלץ על ידי הווטרינר של המוסד שלך IACUC. הנח כל עכבר במצב שכיבה, עם הגב על שולחן הניתוח. לשתק את איבריה באמצעות סרט דבק.
    3. טובלים מטלית כותנה לתוך תמיסת חיטוי מבוסס יוד. נגב את אזור הבטן כולו של העכבר ביסודיות לעקר את פני העור לפני הניתוח.
    4. החזק ולהרים את העור הבטן של העכבר עם מלקחיים. השתמש באזמל כירורגי לבצע חתך אנכי קטן, 1 ס"מ. לעשות שני חתכים על 0.5 - 1 ס"מ אורך, כל לכיוון הרגל האחורית, כדי להשיג חתך הפוך, בצורת Y.
      1. השתמש מלקחיים ו צמר גפן כדי להפריד בעדינות את העור מן הבטן ואת סיכות העור לצדדים כדי לחשוף את בלוטות החלב משפיעה. מניחים את העכבר תחת stereoscope ולהגדיר את ההגדלה 2.0X. הקפד להתאים את המיקוד כך פנקס שומן החלב ניתן לראות בבירור ומופעל על.
    5. מניחים 27G 1/2 "אינפלE על קרח כדי מראש צמרמורת. ראש מזרק 1 מ"ל עם תערובת הממברנה במרתף במרתף מראש כדי להסיר בועות אוויר אפשרי לכודים באזור המחט מצרף. פיפטה 15 μL של פתרון מעורב על הכובע של הצינור microcentrifuge ולאחר מכן לשאוב את נפח כולו לתוך מזרק דרוך.
    6. החזק את פנקס השומן החלב מול הצומת הלימפה המפשעת, באמצעות פינצטה בסדר, ולהרים אותו קלות עבור הזרקת קל. הכנס על 1/4 של המחט מזרק בעדינות לתוך כרית שומן.
      1. שחרר את פינצטה מ בלוק תחביב לאחיז ולייצב את המחט מזרק. להזריק את הפתרון באיטיות כדי למנוע דליפת נוזלים. החזק במשך כמה שניות כדי לוודא תערובת התא הוא מוצק כדי למזער את הדליפה בעת משיכת המחט.
    7. סגור את דש העור עם התפרים absorbable. תפר את דש העור באמצעות גודל 5-0 non-reactive monufilament תפר ולסגור את הפצעים עם קשרים בסגנון המנתח, כל קירוב knotAtely 0.3 ס"מ זה מזה. לחלופין, סגור את העור עם סיכות הפצע.
    8. מקום עכברים פעלו בכלוב נפרד להתאוששות. מניחים מנורת חימום מעל הכלוב כדי למנוע את עכברים מורדמים סובל היפותרמיה. מניחים נייר רך וכותנה בחלק התחתון של הכלוב כדי לשמור על עכברים חמים שלאחר הניתוח.
      1. שימו לב לעכברים בזהירות עד שכל הנמענים ערים לחלוטין. במשך כמה ימים, יש ליישם משככי כאבים לאחר הניתוח מראש לכל בעלי החיים או על פי הוראות הרופא הוטרינר. החל אנטיביוטיקה על פי פרוטוקול חיה מאושרת אם הפצע מתרחש. אם הפצע כירורגי היה סגור עם סיכות פצע, להסיר את קליפים הפצע 10 ימים לאחר הניתוח, כאשר הפצע נסגר לחלוטין.

3. שלם הר רקמת הכנה עבור תצפית מיקרוסקופית

  1. קציר רקמות
    1. ב 2 - 4 שבועות לאחר ההשתלה, להרדים את הנמען BALB / cעכברים בעירום תוך הזרקת intra-פריטוני של סוכן הרדמה 2.5% במינון של 0.12 מ"ל לכל 20 גרם של bodyweight, כמו בשלב 2.2.2.
      הערה: צמיחה של כלי שיט חיובי יכולה להיות מזוהה 2-4 שבועות לאחר השתלת תאים.
    2. תווית מחזור מערכתית הנמען עם הזרקת וריד הזנב של צבע isolectin-647 במינון של 50 מיקרוגרם / 25 גרם של bodyweight, resuspended ב 50 μL של סטרילי PBS. אפשר מנוחה של 5 - 10 דקות. להקריב את העכברים באמצעות CO 2 .
    3. לנתח את האזור של רקמות החלב שבו התאים הוזרקו תחילה בעקבות שלב 2.2.4; להשתמש במספריים כירורגיים. באמצעות להב כירורגי, לקצוץ את הרקמה לתוך בערך 3 עד 4 מ"מ 3 קוביות בצלחת 6 ס"מ פטרי.
  2. עיכול רקמות הכנה מכתים נוגדן.
    1. לעכל את חתיכות רקמות צינור צנטריפוגה 15 מ"ל מלא 10 מ"ל של מראש חימם בסיס בסיס העיכול (שלב 1.1.2) בתוספת קולגן 3(300 U לכל 10 מ"ל).
    2. מניחים את צינור צנטריפוגה 15 מ"ל אופקית על פלטפורמת נדנדה עם מהירות להגדיר 100 סל"ד והטמפרטורה מוגדר 37 מעלות צלזיוס למשך כ 1 שעות כדי לשחרר את מבנה הרקמה כדי להסיר רקמת אדיפוציטים מוגזמת.
      הערה: אדיפוציטים נוטים לייצר אוטומטי פלואורסצנציה אשר עלולה לגרום רקע פלואורסצנטי רועש. בסוף העיכול, חתיכות רקמה צריך להיות מראה רך, מעונן. תקופת עיכול אופטימלי תלוי בגודל של רקמות קצוצות חתיכות ולכן צריך להיות מותאם בהתאם להשיג את התוצאות הטובות ביותר. מאז vasculature הרקמה כבר שכותרתו עם Isolectin פלואורסצנטי מתויג, כל ההליכים הבאים צריך להתבצע מוגן מפני האור.
    3. לשטוף את חתיכות רקמות עם PBS ב RT במשך 10 דקות. תקן את הרקמה כולה הר ידי בזהירות הנחת חתיכות לתוך צלחת 6 פטרי ס"מ חצי מלא עם PFA 4% (pH 7.2 - 7.4) כדי לשמר את הקרינה. מניחים את צלחת פטריעל פלטפורמת נדנדה בעדינות להתסיס את הרקמה למשך 30 דקות ב RT.
      הערה: PFA הוא מסרטן ויש לטפל בו בזהירות.
    4. הסר את PFA הנותרים לשטוף את הרקמה הקבועה שלוש פעמים עם כל הר חיץ לשטוף (0.1% tween ב PBS), עם מרווח של 10 דקות בין כל לשטוף.
  3. מכתים נוגדן רקמות שלם.
    1. לדלל את הנוגדן העיקרי במאגר מכתים נוגדן בצינור צנטריפוגות 2 מ"ל. דגירה הרקמה עם נוגדן העיקרי לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: עכברוש נגד CD31 (ריכוז: 10 מיקרוגרם / מ"ל) או עכברוש נגד VE-Cadherin (CD144 / Cdh5, ריכוז: 2.5 מיקרוגרם / מ"ל) שימשו נוגדנים ראשוניים. שניהם CD31 ו- VE-Cadherin הם פני השטח סמנים המשמשים לזהות האנדותל. 5x חיץ נוגדנים מוכן עם 500 מ"מ חומצה malic, pH 7.5; 750 מ"מ NaCl; ו 0.5% (v / v) tween להתמוסס PBS. רק להוסיף נפח מתאים בסרום (5%) בעת הכנת פתרון עבודה טרי 1x9 .
    2. הסר את המאגר מכתים נוגדן לשטוף את רקמת הר כולו שלוש פעמים עם חיץ לשטוף, עם מרווח 10 דקות. דגירה הרקמה עם נוגדנים משני (ראה טבלה של חומרים ) בתוספת DAPI ב RT במשך 4 שעות על פלטפורמת נדנדה או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: השתמש DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) בריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​לדמיין את הגרעינים.
    3. לשטוף את רקמת הר כולו עם חיץ לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד. דגירה חתיכות רקמות גליצרול 80% או סוכרוז 80% לילה לייבש את הרקמה לשימור טוב יותר.
    4. מניחים את חתיכות רקמות בודדים על גבי שקופית זכוכית להסיר את חיץ יתר של התייבשות. מכסים את הרקמה עם המדיום הרכבה, במקום coverslip, בעדינות לסחוט את הרקמה כדי להגדיר אותו.
    5. ביצוע confocal התמונה הרכישה מיקרוסקופית. עבור כל בלוטות החלב הר, לרכוש תמונות באמצעות 40X עם NA = 1.3 שמן אובייקטיש. רכישת אריחי סריקה של Z- ערימות על רזולוציה סעיף אופטי של 1,024 x 1,024 ואת הפרדת שכבת של 1.0-1.2 מיקרומטר.
      הערה: כדי ללכוד את האור הנכון פלואורסצנטי האור, מסנן קרן ספליטר צריך להיות מוגדר משולש dichroic (TD) 488/553/638, עם הגדרת רווח ב PMT רווח 600-800. מקורות עירור / פליטה הבאים יש להשתמש: mGFP, עם מקסימום עירור / פליטה של ​​488/509 ננומטר; MTomato עם מקסימום עירור / פליטה של ​​532/588 ננומטר; Alexa-647, עם מקסימום עירור / פליטה של ​​594/665; ו DAPI, עם עירור / פליטה מקסימום של 350/470.

4. השושלת מעקב באמצעות מודל עכבר מהונדס גנטית

  1. זיהוי Procr + VESCs באמצעות מודל העכבר.
    1. השתמש Procry CreERT2-IRES-tdTomato / + (המכונה Procr CreERT2 ) לדפוק את זן העכבר.
      הערה: במודל עכבר זה, קלטת CreERT2-IRES-tdTomato 10 מוכנס לאחר קודון ה- ATG הראשון של Procr 11 .
      1. קרוס Procr עכברים Crebert2 עם mttomatomGFP Rosa26 (המכונה R26 mTmG ) זן כתב להתחקות אחר גורלו של Procr + אנדוגני ECs in vivo 11 . לזהות את כל מסומן אנדרוגני + ECs וצאצא שלהם באמצעות ביטוי GFP.
    2. ניהול תמיסת טמוקסיפן 11 (10 מ"ג טמוקסיפן מומס ב -1 מ"ל של שמן בוטנים + אתנול 10% להמציא פתרון מלאי של 10 מ"ג / מ"ל) intraperitoneally במינון של 4 מ"ג / 25 גרם bodyweight במהלך שלב ההתבגרות (5 שבועות הישן) כדי לעקוב אחר גורלם ההתפתחותי של Procr + ECs.
    3. ניתוח יעילות שיבוט שיבוט של תאים שכותרתו על ידי immunostaining הר כולו בעקבות שלבי הכנה המתוארים בשלב 3. השג רפידות שומן החלב מעכברים שטופלו הן לאחר קצר טווח (2 ימים) ותקופות זמן ממושכות (עד 10 חודשים). ראה איור 3 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

VESCs החלב בידוד:

כדי לבודד את האוכלוסייה האנדותל עבור assay ההשתלה כתוצאה, בוגרת (8 שבועות), בלוטות החלב הבתולה בתולה נקצרו כחומר התורם. תאים אנדותל בודדו באמצעות טכניקה מיון תא נוגדן מבוסס. חלקות נציג של ניתוח FACS של האוכלוסייה VESC ב 8 שבועות בן C57BL / 6 בלוטות החלב ECS מוצגים באיור 1 (איור מותאם יאו ואח '

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מבחני אנגיוגנזה מייצגים גישה ניסויית טובה לדינמיקה של כלי הדם. עכבר הרשתית של הרשתית, המתפתח לאחר הלידה, הוכח כמודל אטרקטיבי ללימוד אנגיוגנזה 12 . למרות היותו נגיש יחסית, מניפולציה בפועל בתוך המיטה הרשתית הרשתית היא די קשה. עד כה, המתואר הכי טוב ב השתלת vivo כבר assay תקע, אשר מקיף תאים בתוך המסה מטריצה ​​הממברנה במרתף השתלים ניתוחית / הזרקת תת עורית באזור האגף של העכבר הנמען. זה assay angiogenesis יעיל בבדיקת פוטנציאל regenerative ויכולת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31530045 ו- 31371500 ל- YAZ, 31401245 ל- QCY), משרד המדע והטכנולוגיה של סין (2014CB964800), האקדמיה הסינית למדעים (XDB19000000 ל- YAZ) והסינים חברה לביולוגיה של התא (מלגות מוקדמות לקריירה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% טריפסין-אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) (1x)Gibco (Life Technologies)25300-0620.05% טריפסין
0.22 ומיקרו; מ יחידת סינוןMerck Millipore בע"מSLGP033RB0.22 ומיקרו; m מסנן
2-מתילבוטנול-2, ריאגנטפלוססיגמא-אולדריץ'24, 048-6טרט אמיל אלכוהול
222, טריברומתנולסיגמא-אולדריץ'T48402-25 גרם222, טריברומתנול
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)InvitrogenD1306DAPI
70 ומיקרו; מסננת תאים mBD FAL35235070 ומיקרו; m מסננת תאים
הידבקות מיקרוסקופ שקופיותCITOGLAS188105זכוכית שקופיות
נגד עכבר CD105 APCeBioscience17-1051-82, שיבוט MJ7 / 18לשימוש באנלוזה FACS ב 1 ומיקרו; g/mL
Anti-mouse CD201 BiotineBioscience13-2012-82לשימוש באנלוזיס FACS ב-2.5 ומיקרו; g/mL
נגד עכבר CD31 PE-ציאנין 7eBioscience25-0311-82, שיבוט 390לשימוש באנלוזיס FACS ב-1 ומיקרו; g/mL
BD FACSJazz ממיין תאיםBD Biosciences655489FACS
סרום בקר אלבומיןסיגמא100190332BSA
צנטריפוגהאפנדורף5810Rצנטריפוגה
קולגנאז סוג 3וורת'ינגטון-ביוכימיה#LS004183קולגנאז III
מיקרוסקופיה קונפוקליתLeicasp8קונפוקלי
Deoxyribonuclease I מלבלב בקרSigmaD2463-5VLDnase I
Donkey anti-Rat Cy3Jackson ImmunResearch712-165-150נוגדן משני, שימוש ב-0.5 ומיקרו; g/mL
Dumont ForcepsWPI500342Froceps
Dumont Corpps - טיפים מיקרו-קהיםFST11253-20מלקחיים
סרום בקר עובריHycloneSH30396.03FBS
FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119BioLegend78022קוקטייל שושלת דם לניתוח FACS, שימוש ב-25 ומיקרו; L לבדיקה
גליצרולסיגמאG6279גליצרול
מעובד של Iscov's Dulbecco's MediumGibco (Life Technologies)12440-053IMDM
Isolectin GS-IB4 מ-Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora  647InvitrogenZ32450Isolectin-647
Matrigel  מטריקס (גורם גדילה מופחת)BD356231עכבר מטריג'ל
(Actin-GFP)Jax Laboratories3773Actin-GFP
זן עכבר (C57BL/6)SLACC57BL/6C57BL/6
זן עכבר  (BALB/c עירום)SLACBALB/c עירוםעכברים
עירומים ParaformaldehydeSigmaP6148PFA
פניצילין סטרפטומיציןGibco (Life Technologies)5140-122עט/סטרפטוקוקוס
פוספט חוצץ מלח (pH7.2) 1xGibco (Life Technologies)c20012500BTPBS
PRIM1640Gibco (Life Technologies)c11875500CPPRIM1640
ProLong Gold antifade ReagentLife TechnologiesP36934הרכבה
בינונית חולדה אנטי CD144BD Biosciences550548לניתוח הרכבה שלמה, אנטי-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy לצומת הדוק אנדותל, שימוש ב-2.5 ומיקרו; g/mL
Rat anti CD31-biotinBD Biosciences553371לאנלוזה שלמה, נוגדן נגד CD31/PECAM1 למולקולת הידבקות משטח אנדותל, שימוש ב-10 ומיקרו; g/mL
מאגר ליזה של תאים אדומיםSigmaR7767-100MLמאגר ליסינג של תאי דם אדומים
ישר/חד-קהה/10 ס"מFST14028-10מספריים עדינים
Streptavidin eFluor 450eBioscience48-4317-82לשימוש בניתוח FACS ב-0.5 ומיקרו; g/mL
TamoxifenSigma101551374TAM
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-250MLTritonX
משי קלוע מצופה שעווה (גודל 5-0 USP (1 מטרי), 18 אינץ' (45 ס"מ) שחור על מחט C-1)תפר COVIDIENS1173nbsp;
שכמה חד פעמית סטריליתSwann Morton#10אזמל
BetadineYifengתמיסת חיטוי20160101
זן & רפואית

מקורות

  1. Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
  2. Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
  3. Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
  4. Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407(2012).
  5. Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
  6. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
  7. Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).
  8. Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
  9. Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
  10. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
  11. Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
  12. Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  13. Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012(2014).
  14. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  15. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
  16. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  17. Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

השתלה של רקמותמיקרוסקופיה של דגימה שלמה (Whole-Mount)מיון FACSמיקרוסקופיה קונפוקליתרספטור ל-Protein Cסימון באיזולקטיןסביבה אנגיוגניתמעקב אחר שושלת תאים (Lineage Tracing)
רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.