פיתוח HiPSC נגזר סרום חינם גופים embryoid לחקירת 3-D תא תרבויות גזע באמצעות מבחנים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית

Andre W. Phillips; Jonathan E. Nestor; Michael W. Nestor

doi:10.3791/55799

מאמר שיטה

פיתוח HiPSC נגזר סרום חינם גופים embryoid לחקירת 3-D תא תרבויות גזע באמצעות מבחנים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית

DOI:

10.3791/55799

⸱

20 ביולי 2017

Andre W. Phillips¹ , Jonathan E. Nestor¹ , Michael W. Nestor¹

¹The Hussman Institute for Autism

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לפתח מערכת תלת ממדית (3-D) מתאי גזע של האדם המושרה-פלוריפוטנט (hiPSCs) הנקראת גוף העובר החופשי בסרום (SFEB). מודל זה 3-D ניתן להשתמש כמו תרבות פרוסה organotypic כדי מודל התפתחות קליפת המוח האנושי ועל חקירה פיזיולוגית של פיתוח מעגלים עצביים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שמספר מודלים של מחלות חוץ-גופית פותחו באמצעות hiPSCs, מגבלה אחת היא שמערכות דו-מימדיות אלו (2-D) אינן מייצגות את המורכבות הקיטורית והפונקציונלית הבסיסית של החולים הנגועים הנושאים גרסאות חשודות של המחלה. מודלים 2-D קונבנציונאלי להישאר ייצוגים שלמים במבנים דמויי vivo ואינם ללכוד כראוי את המורכבות של המוח. לכן, יש צורך המתעוררים יותר 3-D מודלים מבוססי hiPSC שיכולים לשחזר טוב יותר את אינטראקציות הסלולר פונקציות לראות במערכת vivo .

כאן אנו מדווחים פרוטוקול לפתח מערכת 3-D מ hiPSCs בלתי מובחנים על בסיס הגוף העובר ללא תמותה (SFEB). מודל תלת-ממדי זה משקף היבטים של ניאוקורטקס מתפתח ומאפשר מחקרים לתפקודים אינטגראליים לתאים עצביים חיים ורקמות שלמות כגון הגירה, קישוריות, תקשורת ומחצלתרוויה. באופן ספציפי, אנו מדגימים כי SFEBs באמצעות פרוטוקול שלנו ניתן לחקור באמצעות מבחני התא רלוונטיות פיזיולוגית גבוהה תוכן מבוסס כגון הדמיה סידן, ומערכות אלקטרודה רב (MEA) הקלטות ללא cryosectioning. במקרה של הקלטות MEA, אנו מראים כי SFEBs להגביר את פעילות ספייק פעילות ברמת הרשת מתפרץ במהלך תרבות לטווח ארוך. פרוטוקול SFEB זה מספק מערכת חזקה וניתנת להרחבה ללימוד פיתוח רשת במודל תלת-ממדי, אשר לוכד היבטים של התפתחות קליפת המוח.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לנו בעבר דיווחו על מודל 3-D מודל, שנוצר מחולה נגזר האדם המושרה בתאי גזע pluripotent המושרה (hiPSCs) כי recapitulates כמה היבטים של פיתוח רשת קליפתית מוקדם ¹ . זה מודל 3-D, גוף ללא עוברים בסרום (SFEB), משפר על מודלים פשוטים לשעבר hiPSC צבירה ² ^, ³ . גוף גדל והולך של עבודה הוא חושף כי 3-D מבנים כמו SFEBs שלנו, ההיבטים המקורבים של התפתחות עצביים נפוץ נצפה in vivo ובנקודת זמן מוקדמת יותר מאשר שנצפה 2 מימדי (2-D) / monolayer hiPSC מודלים ⁴ ^, ⁵ . מחקרים ראשוניים כבר התמקדו המורכבות של ארגון העצמית של גופי 3-D ללא הוכחת המורכבות ² הפיזיולוגיות שלהם.

הפרוטוקול המתואר כאן נעשה שימוש על hiPSCs מובחנים הנגזרים fibroblasts ו תאי דם מונונוגרעיניים היקפיים (PBMCs). תאים אלה נשמרים על מזוהמים עכבר מזוהמים γ (MEFs). מושבות אלה hiPSC מנוקים באופן ידני של תאים מובחנים ספונטנית, שנקטפו אנזימטית, resuspended בינוני המכיל Rho-Kinase מעכב Y-27632 (ROCKi). Uniferentiated hiPSCs נתונים דיסוציאציה ו צנטריפוגה לפני מועברים 96 נמוך נמוך הידבקות V- צלחות התחתונה. לאחר ציפוי, אינדוקציה עצבית היא יזמה באמצעות עיכוב SMAD כפול (SB431542 ו LDN193189 יחד עם dickkopf 1 (DKK-1)) לנהוג הקדמי חזיתית הקדמית forberrain neuronal- גורל השושלת ⁶ . לאחר 14 ימים, SFEBs מועברים מוסיף תרבות התא בצלחת 6-היטב. לאחר שהועברו, SFEBs עגול מתחילים להתפשט ודק, תוך שמירה על חיבורי הרשת המקומית כפי שנצפה לעתים קרובות בהכנות בהיפוקמפוס organotypic פרוסה תרבות באמצעות הוספת תאים דומים תרבות ¹ ^,Ss = "xref"> 7.

השימוש SFEB מבוסס 3-D פלטפורמת בפורמט זה מקובל הייצור היעיל של רשתות קליפת המוח, כי ניתן לחקור באמצעות מבחני פיזיולוגיים מבוססי תא כגון הדמיה סידן או מבחני אלקטרופיזי כגון הקלטות תא בודד או רב אלקטרודה מערך (MEA ) ¹ . למרות 3-D מערכות לשאת את סמנים של התפתחות קליפת המוח מוקדם, מחקרים אחרים הראו כי אלה 3-D גופים עשויים לדרוש פעמים הדגירה ארוכה כדי לאפשר את קצב איטי מטבעו של התפתחות רקמת האדם ⁸ . זה פרוטוקול SFEB בהצלחה מייצר 3-D SFEBs מ hiPSCs לא מובחן כי לוכדת היבטים של התפתחות מוקדמת של קליפת המוח.

הפוטנציאל של SFEBs כדי מודל סטיות רשת בהפרעות נוירולוגיות הוא כוח של מערכת זו. את hiPSCs נגזר רקמת החולה ניתן לגדל לתוך התאים של מערכת העצבים כי הם כפופים התחתAys הקשורים לביולוגיה התא, כמו גם ביטוי גנטי במקביל. משתמשים ב- iPSCs כדי לבדוק את הפרופיל הגנטי של קבוצות גדולות של אנשים עם הפרעות נוירולוגיות שונות עם אטיולוגיות מורכבות כגון הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD), סכיזופרניה ⁹ , תסמונת רט, ¹⁰ ואלצהיימר ¹¹ ^, ¹² . עד לאחרונה, מודלים iPSC היו בדרך כלל ההכנות monolayer, כי בעוד בקיאים בהערכת אינטראקציות מולקולריות, לא היו מספיק לפענח את האינטראקציות הסלולר המורכב לראות in vivo . מודלים של בעלי חיים היו תחליף ברירת המחדל עבור מחדש את פלטפורמת האיבר כולו. מודלים אלה של בעלי חיים סובלים מתרגום גרוע של הממצאים ויש להם יכולת מוגבלת לשכפל פרופילים גנטיים אנושיים שזוהו על ידי מחקרים גדולים של בדיקות גנטיות. לפיכך, הפיתוח של מערכות תלת ממדיות מ- iPSCs מוסיף שכבה של מורכבות אנושיתדוגמנות ¹³ ^, ¹⁴ . השלב הבא עבור פלטפורמות hiPSC 3D היא להתאים את דרישות בקנה מידה גדול של הקרנה תפוקה גבוהה באמצעות מבחני תאים מבוסס ¹⁵ .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הדור של תאים עצביים עצביים

שמור hiPSCs נגזר fibroblasts ו PBMCs ב 6 גם צלחות על γ- מוקרן העכבר עובריים מזין (MEF) שכבת התא במדיום iPSC האדם בתוספת קטנה מולקולות (ראה את טבלת החומרים).
הערה: תחזוקה יומית היא גרסה שונה של פרוצדורות שדווחו בעבר ^, ¹ ^, ¹⁶ .
1. צלחת 6 x 10 ⁵ MEFs על גבי כל היטב של 6-רקמה צלחת כיתה תרבותית 300 בינוני μL / מומלץ גם (להלן פרוטוקול של היצרן).
2. לאחר 48 שעות, להחליף בינוני MEFs עם 300 μL / מדיום hiPSC היטב עבור 1 שעות לפני הוספת hiPSCs.
3. להפשיר במהירות hiPSCs אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים לאט להוסיף 1 מ"ל hiPSC dropwise בינוני. מעבירים את hiPSCs בינוני עד צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף בינוני כדי להביא את הנפח הכולל ל 5 מ"ל. צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 129 xg, לשאוב את supernataNt, בעדינות מחדש להשעות את גלולה במדיום 1 מ"ל hiPSC עם מעכב ROCK ב 1: 1 ריכוז.
4. פלייט ההשעיה התא (בדרך כלל seeded ב 300,000 תאים / טוב) על שכבת תא MEF ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ , לחות 95%.
5. צג תרבות iPSC מקרוב באמצעות מיקרוסקופ אור. לאחר 48 שעות, להסיר תרבויות בעלות קצוות לא אחידים, גדלו להיות כמו סיסטיק או להיראות חום צהבהב תחת מיקרוסקופ אור כדי למזער בידול ספונטני.
  הערה: לאחר 7-10 ימים, מושבות hiPSC צריכות להיווצר. המושבות צריכות להיות עגולות, עם גבולות מוגדרים בבירור וצפיפות תאים אחידה, נטולי תאים לא אחידים רופפים.
6. באופן ידני לבחור מושבות hiPSC כדי לנקות את התרבות של תאים מובחנים באופן ספונטני. הרחב את המושבות על ידי הצבת אותם על שכבות חדשות MEF. הרחב 1: 3 כל 7 ימים כאשר תרבויות ליד confluency להקפיא ¹ ^, ¹⁶ .
לאחר הרחבת תאי הקפאה (לגיבוי), לגדול מושבות hiPSC על צלחות עד שהם מגיעים 50 - 75% מפגש.
שבעה ימים לאחר ציפוי, להשתמש בטיפול אנזימטי קלה (5-10 דקות עם 300 μL 300 של פתרון האנזים) וטחינה דקה עדינה (2-4 פעמים עם 1,000 μL pipet) למסוק ולהכין hiPSCs עבור הבדל תאים עצביים מבשר.
צנטריפוגה ההשעיה תא ב XG 129 במשך 4 דקות, לשאוב supernatant, ו resuspend גלולה ב 5 מ"ל iPSC בינוני האדם. מעבירים את ההשעיה תא על 0.1% ג 'לטין מצופה 5 ס"מ צלחת תרבות התא עבור 1 שעה ב 37 ° C לחסל MEFs כדי למקסם את התשואה hiPSC. מעבירים את המדיום (עם תאים שאינם חסיד) כדי עוד 5 ס"מ צלחת מצופה ג 'לטין.
מעבירים את התאים שאינם חסיד לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל באמצעות טפטפת העברת. בעדינות לשטוף את הצלחות עם בינוני 3 מ"ל ולהוסיף אותו לצינור 15 מ"ל.
צנטריפוגה ההשעיה התא 129 xg במשך 4 דקות, לשאוב את סופרNatant, ו resuspend בעדינות גלולה בינוני. קבע את ספירת התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. פלייט 9,000 תאים / גם צלחת 96-נמוך נמוך V- התחתונה.
צנטריפוגה את הצלחת ב XG 163 במשך 3 דקות. לדגור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס, לחות 95% ו 5% CO ₂ . באמצעות פיפטה, לשנות בינוני 50% מדי יום ביומו על ידי הסרת חצי המדיום והחלפתו עם בינוני טרי מוגדרים כימית בינוני 1 (DM1, איור 1 , טבלה של חומרים) במשך 14 ימים.

2. סרום ללא עוברים גוף Embuction (SFEB) אינדוקציה ( איור 2 )

מקום 40 מיקרומטר תא התרבות מוסיף צלחות 6-היטב ולהוסיף בינוני 1 מ"ל DM1 לפחות 1 שעות לפני תוספת של אגרגטים.
ביום 14, להעביר את אגרגטים עם בינוני 20 μL באמצעות 200 μL קצה הפה רחב על 40 מיקרומטר תרבית תאים מוסיף ולשנות את המדיום כדי DM2.
הערה: מוסיף תרבית תאים הם התוספות מיוחדים כי לשבת מעט את החלק התחתון של הבאר מורכב קרום polytetrafluoroethylene תלוי על מסגרת פלסטיק. קרום זה biocompatible והוא יכול ביעילות לחזק את חומרי הזנה וחמצן התחבורה SFEBs, אשר ממוקמים על גבי. הם נפוצים עם תרבויות פרוסות בהיפוקמפוס organotypic נלקח עכבר או חולדה ⁷ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ .
1. העברת 4-6 אגרגטים לתרבות אחת התא להוסיף ולאפשר מרחב הולם בין אגרגטים. הסר כמו פתרון עודף ככל האפשר באמצעות קצה פיפטה בסדר ( למשל 200 עצה μL).
  הערה: זה מקובל להפריע לזמן קצר SFEB כפי שהם יעברו על תרבית תרבות התא כמו פתרון הוסר סביב SFEBs.
2. לשמור על תרבויות 1 מ"ל של DM2 ב 37 ° C, לחות 95% ו 5% CO ₂ . באמצעות פיפטה, לשנות 75%מדי יום ביומו על ידי הסרת שלושה רבעים של המדיום והחלפה עם שלושה רבעים בינוני טרי. לדוגמה, להסיר 750 μL של המדיום ולהוסיף 750 μL של המדיום הטרי.
לאחר 14 ימים של תרבות, לעבור המדיום DM3 עם 75% בינוני לשנות כל יום אחר במשך 16 ימים נוספים.
כדי לשמור על SFEBs על הוספת תרבית תאים מעבר 30 יום, לשנות את המדיום כל יום אחר עבור 60, 90 ו - 120 ימים.
הערה: SFEBs יגדל ל כ 1000 מיקרומטר בקוטר והם בדרך כלל 100-150 מיקרומטר עבה ¹ .

3. קביעת הרכב SFEB

לנתק את SFEBs מן להכניס ידי pipetting בעדינות בינוני באמצעות 200 μL רחב פיפטה קצה פיפטה. כדי להעביר את SFEBs, השתמש קצה פיפטה רחב פה לשאוב בעדינות את הגופים לתוך קצה פיפטה. לאחר טעינת SFEB לתוך קצה פיפטה, בעדינות להעביר צלחות 12 גם ולשטוף עם 300 μL פוספט שנאגרו מלוחים(PBS) לכל טוב.
הערה: SFEBs יושעה בפתרון 12 צלחות. זה חשוב כדי לאפשר חדירה מלאה של מקבע, פתרון חסימה, ונוגדנים. אם משתמשים SFEBs מרובים עבור מכתים, עד 10 SFEBs ניתן להוסיף היטב של צלחת 12 גם. זה יהיה לשמר פתרונות ונוגדנים.
תקן SFEBs עם μL 300 לכל paraformaldehyde טוב 4% בטמפרטורת החדר למשך 30-45 דקות. לשטוף SFEBs קבוע פעמיים עם 300 μL PBS, 3-5 דקות כל לשטוף.
זהירות: ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת טיפול paraformaldehyde.
הערה: בדוק עבור immunoreactivity לסמנים לקבוע בגרות, סוג התא וכו 'לסימון נוירונים במחקר זה עוף-Tuj1 שימש ב 1: 500, עבור סמנים נוספים אנא ראה טבלה 2 והפניות ¹ ^, ¹⁶ .
Permeabilize ולחסום עם 0.1% Triton-X100 ב PBS ו 10% בסרום חמור רגיל (חסימת פתרון; 300 μ, L לכל טוב) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
הסר את פתרון חסימת ולטפל SFEBs עם 300 נוגדנים העיקרי μL בפתרון חסימה. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף SFEBs שלוש פעמים (3-5 דקות לכל לשטוף) ב 300 μL PBS המכיל 0.1% Triton-X.
הכן נוגדנים משני 1: 1000 ב חסימת פתרון. דגירה SFEBs במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר עם נוגדנים משני. לשטוף SFEBs עם 300 μL PBS, 3 פעמים במשך 3-5 דקות כל אחד.
הערה: בשלב זה SFEBs יכול להיות מוכן הדמיה.
כדי תמונה, SFEBs פיפטה על גבי שקופית זכוכית באמצעות פיפטה רחב נשא. הסר פתרון עודף סביב SFEB באמצעות יניקה עדינה.
הערה: עבור תנאי מכתים דומים, SFEBs מרובים ניתן להציב על שקופית זכוכית זהה.
הוסף טיפה של המדיום הרכבה על SFEBs, במקום coverslip זכוכית, ולחץ בעדינות כדי לוודא שאין בועות אוויר. אפשר המדיום גובר להתקדם ולהמשיך הדמיה וכימות (שלב 3.8).
הערה: לאחר התקשות המדידה, SFEBs מוכנים להדמיה.
בצע כימות תאים על ידי לקיחת מספר אזורים של עניין (ROI) על פני SFEB ושימוש z- מחסנית בשילוב עם תמונה היטל מקסימלי דרך החזר על כל ROI על מיקרוסקופ confocal רגיל כמתואר הפניות ¹ ^, ¹⁶ .
הערה: כל SFEBs ניתן לכמת באמצעות ריצוף תמונה מבוסס (ראה הפניות ¹ ^, ¹⁶ לפרטים). מאז SFEBs דק כ 100 מיקרומטר, יש פיזור מינימלי של אור הרקמה ולכן אין צורך במיקרוסקופ 2 פוטון. שימושים קודמים של פרוטוקול זה עם iPSCs נגזר fibroblast הפיק מפת הגורל SFEB כי גילה מבנה מורכב ומגוונים עם subpopulations של interneurons עם זהויות תעתיק הדומה CGE ו קדמי forebrain גורל ¹ ^, ^16.

4. הקלטה הפעילות העצבית SFEBs באמצעות MEAs

הכן 12-היטב MEA צלחות לפי הוראות היצרן.
לשטוף את צלחות MEA 3 פעמים במשך 5 דקות עם סטרילי H ₂ O תחת תנאים aseptic לניקוי. לשטוף במשך 5 דקות עם אתנול 75% ולאחר מכן עם אתנול 100% לעקר את הצלחת.
אופים את הצלחת הפוכה בתנור במשך 4-5 שעות ב 50 ° C כדי להשלים את תהליך העיקור.
הוסף 500 μL תמיסת polyethyleneimine 0.2% (PEI) כדי היטב כל דגירה 1 שעה בטמפרטורת החדר. לשאוב PEI ולשטוף את הבארות 4x עם סטרילי מזוקק H ₂ O. האוויר יבש במכסה המנוע בן לילה.
הכן 20 μL פתרון / מ"ל של laminin במדיום L15 ולהוסיף 10 laminin μL למרכז של כל טוב.
הערה: אין לכסות את ההתייחסות הסמויה ואת האלקטרודות הארקה.
הוסף סטרילי dH ₂ O על המאגרים הסובבים כדי למנוע אידוי בינוני או laminin.דגירה את הצלחת עבור 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס.
הוסף SFEBs (ראה סעיפים 1 ו -2) כדי laminin מצופה צלחות MEA ידי יניקה בעדינות אותם לתוך קצה פיפטה פה רחב ולהעביר אותם. הוסף 200 מדיום DM2 μL היטב כל דגירה לילה ב 37 ° C, לחות 95% ו 5% CO ₂ .
הוסף בינוני 200 μL נוסף לאחר 24 שעות ולאפשר לו להתאושש במשך 30 דקות ב 37 ° C, לחות 95%, 5% CO ₂ לפני קריאת הצלחת.
מניחים את הצלחת MEA בקורא צלחת (שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) כדי להקליט פעילות העצבית. פעילות שיא במשך 10 דקות עם תוכנת הקלטה MEA הקשורים. למידע נוסף, עיין בסעיף ¹⁹ .
יצירת נתונים גולמיים רציף זרמים מגרשים סריקה של הפעילות העצבית באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי ¹⁹ .
הערה: הקלטות MEA נלקחים 7 ימים לכתוב SFEB ציפוי. עבור מחקר זה, הקלטות נלקחו במשך 10 דקות כדי לזהות פעילות פרץ ברשת, conעקבות רזה, מגרשים רסטר. SFEBs ניתן להישמר לטווח ארוך על לוחות MEA והוא יכול להיות מוקלט על פני תקופות זמן ארוכות יותר באמצעות תנאים בשליטה סביבתית ( איור 6 ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SFEBs גדל באמצעות הטכניקה שלנו הניב רקמה עם מאפיינים מורפולוגיים הדומים לאזור תת קליפת המוח המוקדם קליפת המוח גדוש נוירונים חיוביים Tuj1 חיובי, כמו גם אבות עצביים ( איור 3 א ). רבים פיתחו שושנות קליפת המוח נצפו השכבות החיצוניות השכבות הפנימיות של SFEB ( איור 3 ב ). הקצה החיצוני של SFEB דומה צלחת קליפת המוח המכיל נוירונים postmitotic. זה נתמך על ידי הביטוי של Brn2, סמן עבור אבות עצביים בשכב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מספק את התנאים להבדיל מקור hiPSC לתוך מבנה 3-D כי recapitulates בשלב התפתחותי מוקדם של קליפת המוח הקדמית. הליך זה מניב מבנים שניתן לחקור עבור electrophysiology בעת גם להיות מקובל למיקרוסקופ. מורפולוגיה הסופי של SFEB דומה לזו של תרבויות פרוסות המוח organotypic ומאפשר הדמיה confocal מפורט באיכות גבוהה. פרוטוקול זה יכול בהצלחה לייצר SFEBs משני fibroblast ו היקפי דם mononuclear תאים נגזר hiPSCs. SFEBs שנעשו מן הדם ההיקפי mononuclear התא הנגזרות hiPSCs התערוכה מאפי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים אליזבת Benevides להגהה את המאמר. אנו מודים לד"ר. ג 'ון Hussman ו ג' ין בלאט על דיונים מועילים שלהם הערות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>SFEB התמיינות עצבית מדיה של תרבית תאים. ריאגנטים. רכיבים
STEMdiff מדיום אינדוקציה עצבית (hiPSC Media)	STEMCELL Technologies	0-5835	250 מ"ל
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
Name	Company	<חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
<חזק>DM1 רכיבי מדיה
D-MEM/F-12 (1x), נוזל גלוטמקס, 1:1	Invitrogen	10565018	385 מ"ל
החלפת סרום	Invitrogen	10828028	20% 100 מ"ל
עט/סטרפטוקוקוס	Invitrogen	15140122	5 מ"ל
גלוטמקס 200 מ"מ	Invitrogen	35050061	5 מ"ל
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות 10 מ"מ (100x),	אינוויטרוגן		11140050 5 מ"ל
2-מרקפטואתנול (1,000x), אינוויטרוגן נוזלי		21985023	900 μ L
Name	Company	<חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
><חזק>DM2 רכיבי מדיה
D-MEM/F-12 (1x), נוזל גלוטמקס, 1:1	Invitrogen	10565018	500 מ"ל
גלוטמקס 200 מ"ל	Invitrogen	35050061	5 מ"ל
עט/סטרפטוקוקוס	Invitrogen	15140122	5 מ"ל
תוסף N-2 (100x),	Invitrogen	נוזלי 17502048	10 מ"ל
<חזק>שם	<חזק>חברה	<חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
<חזק>DM3 רכיבי מדיה
NEUROBASAL בינוני (1x),	אינוויטרוגן		21103049 500 מ"ל
תוסף B-27 מינוס ויטמין A (פי 50),	אינוויטרוגן	12587010	10 מ"ל
גלוטמקס 200 מ"מ	Invitrogen	35050061	5 מ"ל
עט/סטרפטוקוקוס	Invitrogen	15140122	5 מ"ל
<חזק>שם	<חזק>חברה	>מספר קטלוגי	Comments
מולקולות קטנות
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	2 μ M
SB431542	Stemgent	04-0010-10	1:1,000 (10 μ M)
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024	1 μ M
LDN-193189	Stemgent	04-0074-10	250 nM
Y27632 (ROCKi)	Stemgent	04-0012-10	10 μ מ
<חזק>שם	<חזק>חברה	מספר קטלוגי	Comments
>Recombinant Protiens
DKK-1	Peprotech	120-30	200 ng/
mLName	Company	Catalog Number	Comments
Components/Materials
; M, קוטר 30 מ"מ	Millicell	PICM0RG50
עכבר פיברובלסטים עובריים	GlobalStem	GSC-6301G
96 באר V תחתון עם מכסים	ירוק עד	222-8031-01V
StemPro Accutase מגיב דיסוציאציה של תאים	ThermoFisher	A1110501
TritonX-100	ThermoFisher	85111
פוספט חוצץ מלח (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 מ"ל
סרום חמור רגיל	Jackson Labs	017-000-121
L-15 ThermoFisher בינוני של לייבוביץ		11415114	500 מ"ל
DRAQ5 (סמן גרעיני)	ThermoFisher	65-0880-96
MEA צלחות	Axion Biosystems	M768-GL1-30Pt200
6 באר פלקון תחתון שטוח		353046
<חזק>שם	<חזק>חברה	<חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
><נוגדן>חזק<חזק>
נסטין	מיליפור	MAB5326
Brn-2	חלבון טק	14596-1-AP
VGLUT1	מערכות סינפטיות	135 303
Pax6	abcam	ab5790
קלרטינין	abcam	ab702
Calbindin	abcam	ab11426
CoupTFII	R& D Systems	PPH714700
Nkx 2.1	abcam	ab12650
Tuj1	abcam	ab41489
Reelin	Millipore	MAB5364
Tbr1	Millipore	MAB2261
NFH	Dako	M0762

נוזלי נוזלי נוזלי Cell Culture מוסיף 0.4 &mu

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418(2014).
Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547(2014).
Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer's research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223(2015).
Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910(2012).
Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

iPSC

פיתוח HiPSC נגזר סרום חינם גופים embryoid לחקירת 3-D תא תרבויות גזע באמצעות מבחנים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים