מאמר שיטה

הכנה בינונית של תסיסנית עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

DOI:

10.3791/55804

⸱

30 במאי 2017

 ,  ,  ,  , 
1Biology Department, University of Massachusetts Boston, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם) והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש ביישומים proteomic במורד הזרם, כגון זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS ).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח אינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI) הפך לגישה הכרחית לחקר תהליכים ומנגנונים ביולוגיים, כגון איתות תא, התפתחות אורגניזם ומחלות. זה רצוי לעתים קרובות להשיג מידע PPI באמצעות חומר vivo , כדי לקבל את התצוגה הטבעית ביותר ללא דעות מוקדמות של רשתות האינטראקציה. זבוב הפירות תסיסנית melanogaster היא פלטפורמה מצוינת ללמוד PPIs in vivo , וכן משאיל את עצמו גישות פשוטות לבידוד חומר ניסויים ביוכימיים. בפרט, עוברי זבוב הפירות מייצגים סוג נוח של רקמות לבדיקת PPI, בשל הקלות באיסוף בעלי חיים בשלב ההתפתחותי הזה והעובדה שרוב החלבונים באים לידי ביטוי בעובר, ובכך מספקים סביבה רלוונטית לחשוף את רוב ה- PPI. כאן אנו מציגים פרוטוקול אוסף של עוברי תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם), אשר הוא סכום אידיאלי עבור מגוון רחב שליישומי proteomic, כולל ניתוח של PPIs על ידי זיקוק טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS). אנו מתארים את העיצובים שלנו עבור כלובים 1 L ו 5 L עבור אוספים העובר כי ניתן בקלות ובזול להגדיר במעבדה כלשהי. כמו כן, אנו מספקים פרוטוקול כללי עבור אוסף העובר ואת החילוץ חלבון לייצר lysates כי ניתן להשתמש ישירות ביישומים במורד הזרם כגון AP-MS. המטרה שלנו היא לספק אמצעי נגיש לכל החוקרים לבצע את הניתוחים של PPIs in vivo .

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מסכים גנטיים, ולאחרונה, גישות גנומיות חוללו מהפכה במחקר של פונקציות ביולוגיות. עם זאת, מידע סלולרי חשוב מקודדים חלבונים האנסמבל שלהם של שותפים אינטראקציה. בעוד המסכים הגנטיים המסורתיים יכולים לזהות את רכיבי המסלול המגבילים את קצב התגובה ולהחלים אינטראקציות עקיפות, כוחן של הגישות הפרוטאומטיות טמון ביכולתן לזהות רשתות של אינטראקציה מיידית של חלבונים בעלי עניין. פרוטאומיקס היא אפוא שיטת אורתוגונלית חשובה כדי לחקור מערכות ביולוגיות, ומשלימה גנומים, תמלילי טקסטים ומסכים גנטיים מסורתיים. זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS) הוכיח להיות גישה רבת עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון חלבון (PPIs) בסביבתם הטבעית בתאים ורקמות 1 , 2 . שיטה זו מאפשרת זיהוי של אינטראקציות ישירות או עקיפות בפיתוח ספציפיאל השלבים או רקמות, והוא שימש בהצלחה לזהות PPIs רומן חדש במגוון מסלולים התפתחותיים (הנסקרת בהתייחסות 1 ). למרות ההצלחה הבלתי מעורערת של מחקרים PPI, רובם בוצעו בתאים בתרבית, שבו חלבונים "הפיתיון" של עניין היו overexpressed. ישנם שני נושאים עם חקר PPIs בתרבית תאים: הראשון, קו תא מסוים לא יכול לספק להשלים מלא של אינטראקציות בשל חוסר ביטוי של חלבונים מסוימים. שנית, overexpression גבוה בדרך כלל מועסקים ב ניתוחים כאלה עלול להוביל חפצים כגון חלבונים misfolding או זיהוי של אינטראקציות חיוביות כוזבות.

שתי המגבלות הללו ניתן להתגבר על ידי ניתוח PPIs in vivo . צעד מגביל בניסויים כאלה הוא הזמינות של חומר המוצא לטיהור קומפלקסים חלבונים. תסיסנית melanogaster מזה זמן רב שימש מודל לניתוח פונקציונליSis, ולאחרונה זה הוכח גם להיות מערכת מצוינת לחקר PPIs in vivo . תסמונת עוברים תסיסנית מייצגת סוג רקמה אטרקטיבי במיוחד כדי למדוד PPIs, כי עוברי ניתן לאסוף בקלות בכמויות גדולות, וגם בגלל שרוב הגנים (> 88%) באים לידי ביטוי במהלך embryogenesis, ובכך לספק עשיר בסביבה vivo לאיתור רלוונטי PPIs 3 .

באופן מסורתי, מחקרים ביוכימיים זבובים השתמשו מאוד בקנה מידה גדול אוספים אוספים (100-150 גרם), כגון אלה הדרושים לטהור lysates תעתיק פונקציונלי 4 , 5 . מחקרים קודמים AP-MS ב תסיסנית גם צורך כמויות גדולות של עוברים (5-10 גרם), כי הם הסתמכו על גישה טיהור שני שלבים כגון טיהור זיקה טנדם (TAP), עם אובדן הקשורים של חומר בכל שלב 6 . Amoun גדולTS של חומר המוצא הכרחי הגדרת אוספי העובר בכלובים האוכלוסייה גדול, אשר יכול להיות גם יקר (כאשר רכש מסחרית) ודורש זמן כדי לשמור ולנקות 7 , 8 , 9 .

ההתקדמות לאחרונה בפיתוח של זוויות צעד אחד טיהור זיקה, כמו גם את הרגישות הגוברת של ספקטרומטרים המונית, צמצמו את הכמות הנדרשת של חומר המוצא על ידי סדר גודל. באמצעות תגים כגון פפטיד מחייב streptavidin (SBP) או חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו החל מ 1 גרם של עוברים, ניתן לבודד את כמויות של חלבון הפיתיון רכיבים אינטראקציה זה יהיה מספיק עבור זיהוי על ידי ספקטרומטריית מסה 10 , 11 .

מטרת הפרוטוקול המוצג כאן היא לסייע לחוקרים overcoלי מחסום נתפס ניתוח ביוכימי של PPIs in vivo . לשם כך, אנו מספקים הליך פשוט וזול כדי לאסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם), ואחריו הכנה צעד אחד של תמציות חלבון שלם התא המתאימים לניתוח שלאחר מכן על ידי AP-MS או גישות אחרות . השיטה שלנו מסתמכת על שימוש בכלובי אוכלוסייה מותאמים אישית של 1-L או 5-L שניתן לייצר בקלות על ידי כל מעבדה. יתר על כן, תנאי החילוץ המוצגים כאן אומתו במספר מחקרים, הן בתאים בתרבית והן ב- vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת 5 L כלובי זבוב (כדי להתאים 15 ס"מ צלחות)

  1. השג את החומרים הדרושים: מיכל 5-quart (4.7-L) עם מכסה ( איור 1 א ' ), רשת ניילון, סכין גילוח.
  2. סמן מעגל בקוטר 12 ס"מ לחתוך חור בחלק התחתון של המיכל באמצעות סכין גילוח ( איור 1 ב ). חותכים חור בקוטר 15 ס"מ במכסה ( איור 1C ).
  3. גזור רשת ניילון לתוך 25 x 25 ס"מ ריבועים.
  4. מניחים את הרשת מעל השפה העליונה של המיכל ולחץ למטה עם המכסה ( איור 1 ג ). ודא את הרשת הוא הדוק ואת המכסה אינו מוטה. הכלוב מוכן להיות מאוכלס עם זבובים (ראה שלב 5.3).

2. הכנת 1 L כלובים זבוב (כדי להתאים 10 ס"מ צלחות)

  1. השג את החומרים הדרושים: מקדחה חשמלית, 3 אינץ '(76 מ"מ) כלי חיתוך ( איור 1E ו Fצורה 1F), צנצנת פלסטיק חד צדדית עם מכסה, רשת ניילון, סכין גילוח, נייר זכוכית, משקפי מגן וכפפות עבודה.
  2. חותכים 3 אינץ '(76 מ"מ) חורים בתחתית המכסה של צנצנת פלסטיק ( איור 1G ), עם מכסה דפוק בחוזקה על המיכל בעת קידוח. מקם את כלי חיתוך במרכז המעגל כאשר מתחילים לעשות חור.
    זהירות: ללבוש הגנה על העיניים וכפפות עבודה במהלך שלב זה.
  3. להחליק את הקצוות של החורים עם סכין גילוח ונייר זכוכית.
  4. גזור רשת ניילון לתוך 18 x 18 ס"מ ריבועים.
  5. מניחים את הרשת מעל השפה העליונה של הצנצנת ולהדק על ידי הברגה את המכסה על ( איור 1G ). ודא את הרשת הוא הדוק ואת המכסה אינו מוטה. הכלוב מוכן להיות מאוכלס עם זבובים (ראה שלב 5.3).

3. הכנת מיץ תפוחים (AJ) צלחות

  1. הוסף 19 גרם אגר ו 1 L של 18.2 MΩ · מים ס"מ לתוך בקבוק 2 L.מוסיפים את הסיר ומערבבים בקצרה.
  2. החיטוי למשך 30 דקות. בינתיים, להפשיר 100% מיץ תפוחים להתרכז מלאי קפוא, ולהכין 10 מ"ל של 10% (משקל / נפח) מתיל 4-hydroxybenzoate פתרון באתנול.
  3. לאחר החיטוי, להתחיל לערבב את אגר על צלחת ומערבבים, ולהוסיף 80 מ"ל של 100% מיץ התפוחים להתרכז 10 מ"ל של 10% (משקל / נפח) מתיל 4-hydroxybenzoate פתרון הבקבוק. בואו להתקרר בטמפרטורת החדר עם ערבוב מתמיד.
  4. יוצקים 15 ס"מ צלחות פטרי (עבור 5 כלובים L) או 10 ס"מ צלחות פטרי (עבור כלובים 1 L), כך רמת אגר בכל מנה הוא כ 5 מ"מ עובי. אפשר לחזק בטמפרטורת החדר, לעטוף בשקיות ניילון. לוחות AJ ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים.
    הערה: ניתן לשטוף את הכלים של פטרי ולעשות בהם שימוש חוזר.
  5. הכן להדביק שמרים רטובים: לשפוך קצת שמרים יבשים פעיל לתוך מיכל 100 מ"ל עם מכסה שיאפשר ערבוב קל, ולהוסיף מים בכמויות קטנות תוך ערבוב, כדי לקבל עבה אבל מעורבב היטבלְהַדבִּיק. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.

4. הכנת ריאגנטים תמוגה

  1. הכן חיץ 5x תמוגה: 250 מ"מ טריס pH 7.5, גליצרול 25%, 1% octylphenoxy פולי (ethyleneoxy) אתנול (IGEPAL CA-630), 7.5 מ"מ MgCl 2 , 625 מ"מ NaCl, 125 מ"מ NaF, 5 מ"מ Na 3 VO 4 .
    1. כדי להפוך 200 מ"ל: להמיס לחלוטין 1 גרם אבקת NaF ו 184 מ"ג Na 3 VO 4 אבקה ב 71 מ"ל מים עם ערבוב מתמיד. הוסף 50 מ"ל 1 M טריס pH 7.5, 2 מ"ל 100% IGEPAL, 1.5 מ"ל 1 M MgCl 2 , ו 25 מ"ל 5 M NaCl. ואז מוסיפים 50 גליצרול מ"ל (להוסיף האחרון) ולהמשיך לבחוש במשך 1 שעות.
    2. סנן לעקר באמצעות 250-מסנן יחידות מסנן. צעד זה יכול להיות איטי, אבל סינון הפתרון חשוב להסיר חלקיקים מסיסים. Aliquot ידי 10 מ"ל צינורות 50 מ"ל לחנות ב -80 מעלות צלזיוס.
  2. הכן 1 M dithiothreitol (DTT) פתרון במים. חנות ב -20 מעלות צלזיוס 1 aliquots מ"ל.
  3. השג פרוטאיןטבליות קוקטייל אסאי, עם חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA). חנות ב 4 ° C.
  4. השג 10 מזרקים מ"ל מסננים מזרק: 26 מ"מ קוטר, ללא פעילי שטח תאית אצטט (SFCA), 0.45 מיקרומטר גודל הנקבוביות.

5. אוסף של עוברי זבוב

  1. להגביר את קווי זבוב מהונדס נושא את החלבון מתויג עניין בקבוקים (כ -100 זבובים לכל בקבוק), ולהעביר את הבקבוקים כל יומיים עד 25-30 בקבוקים הם צברו עבור כל קו לעוף. להגביר את מלאי שליטה ( למשל את קו yw ) בצורה דומה.
  2. חם AJ צלחות לטמפרטורת החדר (כ 1-2 שעות, ניתן לעשות בן לילה). באמצעות אצבע כפפה, להפיץ קצת שמרים לחות להדביק במרכז צלחות AJ, כדי לעשות כ. מעגל 6 ס"מ עבור צלחת 15 ס"מ ומעגל 4 ס"מ עבור צלחת 10 ס"מ.
  3. להרדים את הזבובים עם זרימת דו תחמוצת הפחמן באמצעות תקן שלב תסיסנית שלב, ולהעביר לתוךהכלובים (כ -15 בקבוקי זבובים גדולים לכלוב 5 L, 5 בקבוקים לכלוב 1 L).
    1. מכסים את תחתית כלוב עם צלחות AJ מוכן משלב 5.2, ואת הקלטת צלחת AJ לכלוב באמצעות שתי רצועות של קלטת ( דמויות 1D ו 1H ). זה שימושי לקפל מעל קצות הקלטת כי ללכת על הצלחת לקילוף קל בעת שינוי צלחות.
    2. לאחר זבובים להתאושש הרדמה, לשמור על הכלובים עם הצלחות בתחתית רשת מעל.
      הערה: חשוב לחכות עד זבובים לחלוטין להתאושש, כפי שהם אחרת מקל על צלחת AJ ואת שמרים להדביק.
    3. בסוף הניסוי, כדי להכין את הכלוב לניקוי, במקום הכלוב במקפיא במשך כמה שעות. השריית הרשת במים למשך מספר שעות תאפשר ניקוי.
  4. דגירה הכלובים עם זבובים בטמפרטורת החדר במשך 2-3 ימים ולשנות צלחות AJ פעמיים ביום. כדי לשנות את הצלחות, להפוך את הכלוב במהופך,לקלף את הקלטת מהצלחת, אבל להחזיק את הצלחת לכלוב, להקיש את הכלוב בעדינות על הספסל, ולהחליף במהירות את הצלחת הישנה למגש חדש, בניסיון לא לאפשר לזבובים לברוח.
    הערה: זבובים צריך להתאים את הכלוב יהיה להטיל הכי טוב החל ביום 3. הם ימשיכו הנחת ברמה שיא במשך כ 4-5 ימים. שני 5 כלובים L בראש קיבולת הנחת יכול לייצר עד 1 גרם של עוברים באוסף לילה. השתמש בכלובים 1 L עבור ניסויים בקנה מידה קטן יותר.
  5. אפשר זבובים להניח עוברים על לוחות AJ טריים לילה (כ 16 שעות), או לכל אורך אחר הרצוי.
  6. למחרת בבוקר, סמן ולשקול מכולות רשת עבור אוסף העובר, אחד לכל קו לעוף בשימוש.
  7. הכן חיץ 1x תמוגה, באמצעות ריאגנטים מקטע 4 (הערה: מוכן לשימוש 1x תמוגה חיץ צריך להיות מוכן ממש לפני החילוץ): להוסיף 40 מ"ל מים ל 10 מ"ל של 5x חיץ תמוגה מרוכז (מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס) בצינור 50 מ"ל.
    1. הוסף 50 μL של 1 MDTT לריכוז סופי של 1 מ"מ, מערבבים היטב נפרדים לשני צינורות 50 מ"ל, 25 מ"ל בכל. כדי אחד הצינורות, להוסיף אחד מעכב פרוטאז מעכב לסובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בעוד הטבליה הוא המסת, לאסוף עוברי dechorionate (צעדים 5.8 עד 6.6). בדוק כדי לוודא את הטבליה יש מומס לחלוטין, ולשמור את המאגר על הקרח.
      הערה: הצינור השני של חיץ 1x עם DTT ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס יהיה רק ​​דורשים תוספת של הלוח לפני הניסוי הבא. 25 מ"ל של חיץ תמוגה מספיקה עד 2 דגימות, תוך לקיחה בחשבון שוטף הבאים במהלך טיהור חלבון צעדים.
  8. סמן את לוחות AJ על הכלובים עם גנוטיפים של הקווים זבוב בשימוש, להחליף את הצלחות עבור אלה טריים.
    הערה: עודף שמרים להדביק ניתן לגרד את הצלחת בשלב זה. עוברים ניתן הזדקנות על צלחות ב 25 ° C או בטמפרטורת החדר כדי לקבל את החלון הרצוי של זמן התפתחותי.
  9. הוסף מספיק מים לאO לכסות כל צלחת AJ. בעדינות לעקור את העוברים מהצלחת עם מברשת צבע רכה (ראש שטוח כ 10 מ"מ רחב עובד היטב עבור צלחות גדולות). יוצקים את העוברים לתוך שקלול בעבר מיכל רשת מסומנים, ולנקז עודף מים.
    1. אם יש צורך, לבצע שטיפה השני צחצוח של הצלחת כדי להסיר את כל העוברים. שלב את העוברים מצלחת נוספת (ים) עבור אותו לטוס לקו לתוך מיכל רשת זהה.
  10. קצר כתם את הרשת על מגבות נייר כדי להסיר עודף מים.

6. העובר Dechorionation

  1. חצי למלא צלחת פטרי 6 ס"מ עם אקונומיקה 50% (כרך / כרך פתרון במים).
    הערה: ראה תגובה חשובה על המותג אקונומיקה בטבלה של חומרים ריאגנטים.
    זהירות: ללבוש כפפות ולהימנע אקונומיקה על בגדים.
  2. הכינו 2 מנות פטרי גדול עם מים.
  3. לטבול את מיכל רשת עם עוברים ב 50% אקונומיקה במשך 90 s. הקש את הרשת בעדינות במהלך incuBation כמה פעמים כדי להשעות את העוברים בפתרון אקונומיקה.
  4. בסוף הדגירה 90 s, לשטוף את מיכל רשת בכל אחד 2 מנות עם מים על 10 שניות.
  5. שוטפים את מיכל רשת היטב עם מים 18.2 MΩ · ס"מ באמצעות בקבוק גמירה. כמו כן, לשטוף את הצדדים ואת החיצוני של מיכל רשת.
    הערה: אין ריח אקונומיקה צריך להיות מזוהה לאחר לשטוף יסודי.
  6. כתם את מיכל הרשת על מגבות נייר. לשקול את מיכל רשת עם העוברים ואת להפחית את המשקל של מיכל ריק שהושג בשלב 5.6. רשום את המשקל המתקבל של העוברים. כמות טובה של עוברים לכוון הוא 0.5 - 1 גרם.

7. הכנת תמצית העובר

  1. הוסף 1 מ"ל של חיץ תמוגה עם מעכבי פרוטאז (משלב 5.7) כדי homogenizer זכוכית dounce ולשמור אותו על הקרח. מעבירים את העוברים מן המיכל רשת לתוך homogenizer.
    הערה: עוברים ניתן הרים עם סוף שטוח oמתכת spatula או מברשת ומועברים ישירות למאגר. בצע את כל השלבים בסעיף זה על קרח.
  2. לשטוף את העוברים הנותרים על הרשת עם חיץ נוסף 1 מ"ל תמוגה ולהוסיף חומר homogenizer. בואו העוברים להתיישב לתחתית homogenizer, בזהירות לשאוב supernatant.
  3. הוסף חיץ תמוגה עם מעכבי פרוטאז (משלב 5.7) כדי homogenizer, מכוון 5-6 מ"ל של חיץ תמוגה לגרם של עוברי.
  4. Homogenize את העוברים על ידי 4-6 משיכות עם עליון רופף.
    הערה: במהלך שבץ הראשון, תהיה התנגדות יותר. נסו להזיז את העלי בתנועה מתמשכת כדי להימנע מתיז הפתרון.
  5. Homogenize את העוברים על ידי 8-10 משיכות עם העלי הדוקה.
  6. דגירה homogenate על קרח במשך 20 דקות.
  7. מעבירים את homogenate לתוך צינורות microcentrifuge ו צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות במהירות העליון (כ 13,000 XG).
  8. AvoidiNg את כדורי ואת השכבה העליונה מאוד השומנים, להעביר supernatants לתוך צינורות microcentrifuge טריים צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות במהירות הגבוהה ביותר (כ 13,000 XG).
  9. בזהירות לשאוב supernatants עם קצה 1 מ"ל עומס לתוך מזרק 10 מ"ל מזרק עם 0.45 מיקרומטר מסננים המצורפת (לשלב aliquots של אותו מדגם לתוך מזרק אחד). דחוף את כל הפתרון לתוך צינור שכותרתו 15 מ"ל על הקרח. תמצית ניתן להשתמש באופן מיידי עבור ניסויים טיהור חלבון הבאים או הצמד קפוא בחנקן נוזלי נשמר ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
    הערה: עדיף להקפיא את תמציות ולא את העוברים, כי במהלך ההפשרה הבאים של פרוטאזות עוברי עשוי להיות מופעל ולהוביל השפלה חלבון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להמחיש את השימוש בפרוטוקול זה בניסוי טיהור חלבון מורכב, יצרנו קו זבוב הומוזיגואי קיימא, הזרוע EGFP-ERK , המבטא EGFP מתויג תסיסנית תאיים אותות קינאז מוסדר (ERK, מקודד על ידי הגן מגולגל ) תחת שליטה של ארמדיל לידי ביטוי בכל מקום ( זרוע ) האמרגן 18 , 19 . יוזם הזרוע פעיל במהלך רוב השלבים של תסיסנית עוברי 19

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוצג כאן הוא הליך פשוט כללי להקמת כלוב האוכלוסייה תסיסנית בקנה מידה בינוני ועושה תמציות חלבון התא כולו מעוברים. תמציות וכתוצאה מכך ניתן להשתמש במגוון של יישומים במורד הזרם, כגון טיהור של מתחמי חלבון על שרף זיקה. זה קריטי לבצע את שלבי החילוץ על קרח ולהשתמש עיכוב פרוטאז חזקה, כדי למזער השפלה חלבון. כמתואר, הפרוטוקול מתאים לבידוד של רוב cytoplasmic וכמה קרום חלבונים גרעיניים מסיסים 6 , 10 ,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לחברי המעבדה Veraksa להערות מועילות על כתב היד והצעות לשיפורים בפרוטוקול. AV נתמך על ידי NIH מענקים GM105813 ו NS096402. LY נתמך על ידי אוניברסיטת מסצ 'וסטס בוסטון סנופי Genzyme דוקטורט אחוות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Leaktite 5-Qt. מיכל מולטי מיקס טבעי (חבילה של 3)הום דיפו209330להכנת כלובי 5 ליטר.
Leaktite 5-Qt. מכסה מולטי מיקס טבעי (חבילה של 3)הום דיפו209320קוטר 8.37 אינץ'. מכסים לכלובי 5 ליטר.
כלי פטרי פישרברנד עם מכסה שקוף, 100 על 15 מ"מחומר FB0875712 פישר סיינטיפיקפוליסטירן. לשימוש עם כלובי 1 ליטר.
צלחות פטרי פישרברנד עם מכסה שקוף, 150 על 15 מ"מחומר FB0875714 פישר סיינטיפיקפוליסטירן. לשימוש עם כלובי 5 ליטר.
כלי פטרי פישרברנד עם מכסה שקוף, 60 על 15 מ"מחומר FB0875713A פישר סיינטיפיקפוליסטירן. משמש במהלך הפחתת עוברים.
רשת ניילון ספר NITEXספר03-180/44180 מיקרון, 44% שטח פתוח, משמש לכלובי זבובים.
מילווקי 3 אינץ'. מסור חורים דחפור חורים עם ארבורהום דיפו49-56-9670כלי חיתוך 3 אינץ' להכנת כלובי 1 ליטר.
צנצנות PMP עם פה רחב עם פה ישר עם סגירת בורג פוליפרופילן לבןפישר סיינטיפיק11-823-33להכנת כלובי 1 ליטר. חתול תרמו מדעי # 21171000. ניתן להשתמש במיכלים חלופיים של 1 ליטר.
שמרים יבשים של הכוכב האדום הפעיל, נרתיק של 2 פאונדכוכב אדום ניתן לרכוש מספקים Amazon.com או אחרים.
תרכיז מיץ תפוחים 100% קפוא ניתן לרכוש במכולת. צריך לומר "100% מיץ תפוחים" על הפחית.
מתיל 4-הידרוקסיבנזואטAcros OrganicsAC126965000הידוע גם בשם מתילפרבן, או טגוספט. משמש כחומר משמר בצלחות AJ.
IGEPAL CA-630 לביולוגיה מולקולרית, 100 מ"לSigmaI8896המשמש להכנת מאגר ליזה.
יחידות מסנן חד פעמיות סטריליות סטריליות של Nalgene עם קרום CN פישר סיינטיפיק09-740-2A0.2 μ גודל נקבוביות מ '. משמש לסינון מאגר ליזה פי 5. חתול תרמו סיינטיפיק # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete מעכב פרוטאז קוקטיילסיגמא11697498001בקבוקון של 20 טבליות. משמש לעיכוב פרוטאז במאגר ליזה.
מסנני מזרק קורנינג SFCA פישר סיינטיפיק09-754-21ממברנת SFCA, קוטר 26 מ"מ, גודל נקבוביות 0.45 μm. משמש לסינון דגימות תמצית סופיות.
BD  מזרקים חד פעמיים Luer-Lok ללא מחטיםFisher Scientific14-823-2Aלסינון דגימות תמצית סופיות. חתול BD # 309604.
אקונומיקהקלורוקסהמשמשת לפירוק עוברים ב-50% (נפח/נפח) במים, ניתן לרכוש בכל סופרמרקט. חשוב להשתמש במותג Clorox, מכיוון שמותגים אחרים עלולים לגרום לניקוי לא שלם או עלולים להיות רעילים לעוברים.
Corning Costar Netwell PlatesFisher Scientific07-200-213מיכלי רשת לאוספי עוברים. 74 μ גודל רשת M, 6 בארות.
מטחנות רקמות Wheaton Dounce, קיבולת 15 מ"להומוגנייזר Fisher Scientific06-435Bלעוברים, עם עליים רופפים ומהודקים. חתול ויטון # 357544.
: : :

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
  2. Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
  3. Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
  4. Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
  5. Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
  6. Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
  7. Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
  8. Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
  9. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
  10. Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
  11. Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).
  12. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
  13. Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
  14. Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
  15. Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).
  16. Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
  17. Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
  18. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  19. Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
  20. Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
  21. Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
  22. Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Drosophila MelanogasterWestern BlottingGFP

מאמרים קשורים