מאמר שיטה

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

DOI:

10.3791/55813

⸱

4 באוגוסט 2017

 ,  , 
1Center for Peptide Pharmaceuticals, Faculty of Natural Science, Ulm University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות שונות כדי לתפעל אדריכלות תלת מימדי המבוסס על חלבון hydrogels מוערכים פה לגבי תכונות החומר. הרשתות macroporous הן functionalized עם פפטיד תא-דבק, הכדאיות שלהם בתרבות תא מוערך באמצעות שתי שורות תאים מודל שונה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydrogels מזוהים כחומרי מבטיח ליישומים תרבות תא, בשל היכולת שלהם לספק סביבות תא רטוב מאוד. בתחום תבניות תלת-ממד עולה בשל הדמיון פוטנציאלי של החומרים האלה מטריצה חוץ-תאית טבעיים. Hydrogels חלבון מבוססת מבטיחים במיוחד כי הם יכולים בקלות להיות functionalized ולא ניתן להשיג מבנים המוגדרים עם מאפיינים physicochemical מתכווננת. עם זאת, ייצור תבניות תלת-ממד macroporous ליישומים התרבות תאים, תוך שימוש בחומרים טבעיים לעיתים קרובות מוגבל על ידי שלהם תכונות מכניות חלש יותר בהשוואה לאלו של חומרים סינתטיים. . הנה, הוערכו שיטות שונות כדי לייצר macroporous אלבומין שור (BSA)-מבוסס מערכות הידרוג, עם גדלים נקבובית מתכווננת בטווח של 10-70 מיקרומטר ברדיוס. יתרה מזאת, שיטה להפקת ערוצי בחומר זה חלבון מבוססת כי הם כמה מאות מיקרונים ארוך הוקמה. השיטות השונות כדי לייצר את הנקבוביות, כמו גם את השפעת גודל הנקבוביות על תכונות חומר כגון נפיחות יחס, pH, יציבות טמפרטורה, בהתנהגות השפלה אנזימטיות, נותחו. גודל הנקבוביות נחקרו במדינת מקומיים, נפוחות של hydrogels באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. הכדאיות ליישומים תרבות תא הוערך באמצעות שינוי פפטיד תא-דבק RGD של המערכת חלבון, שתי שורות תאים דגם: תאי סרטן השד אנושי (A549) ו- adenocarcinomic האנושי מכתשי הבזליים בתאי אפיתל (MCF7).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydrogels הם חומרים היוצרים לא מסיסים רשתות 3D מסוגל מחייב כמויות גדולות של מים. חומרים כאלה יכולים לספק תנאים סביבתיים מעולים עבור תאים חיים. כיום, שם הוא הגדלת עניין דור של מבנים תלת מימדיים הידרוג בהתפתחות תהליכים כדי להתאים שלהם מאפיינים כימיים ופיזיים. ברגע זו מושגת, תבנית עבור הצמיחה של תאים, המניפולציה של התנהגות הסלולר יכול להיות שנוצר1,2,3,4. אלה מבנים תלת-ממד לא רק ליצור סביבה יותר טבעי ומציאותי יותר גישות קונבנציונליות דו מימדי, אבל הם גם לחשוף בפניך אפשרויות חדשות לצמיחה של תאי גזע או גידול מודלים5. חומרים שונים בעלי טווח של מאפיינים התלויים בעיקר גודל הנקבוביות של ג'ל6. הנקבוביות לשחק תפקיד מכריע תא תרבות יישומים, הנדסת רקמות, וגידול מכוונת של תאי גזע. לדוגמה, חמצן וחומרים מזינים מפוזרת באמצעות המטריקס, ועל כמות מספקת להיות מסוגל להגיע את התאים7. מצד שני, מטבוליטים מזיקות להסירו מהר ככל האפשר, ועל די שטח עבור גדילת התאים להיות זמין7. כתוצאה מכך, המאפיינים של החומר, ובכך גודל הנקבוביות, להשפיע באופן חמור על יישומים אפשריים של האפשר והתועלת של המטריקס. תהליכי צמיחת תאים שונים בהתאם המאפיינים של החומר, יכול להתרחש תרבית תאים תלת-ממד, כולל הקמת מבנים עצביים; הצמיחה ואת התמיינות של תאים בעור או עצם; וגידול בבימויו של שורות תאי גזע מיוחד, כמו hepatocytes או fibroblasts2,3,8,9,10,11. עוד נקודה מכרעת המשפיעים על יישום אפשרי של חומר היא יציבותו כלפי גירויים חיצוניים12. לדוגמה, הידרוג חייב לשמור על שלמותה מכני תא תרבות בתקשורת או על גוף האדם.

בשנים האחרונות, מחקר על hydrogels תרבות תלת התא התעצמה, מחקרים רבים בוצעו כדי לפתור את ארכיטקטורות תלת-ממד של מערכות13. Hydrogels מורכב מרכיבים מסונתז כימית נחקרות הנפוץ ביותר כי הם יכולים להיות בקלות מסונתז והוא כימי ששינה שהם מייצגים את יציבות גבוהה (ראה ז'ו. et al., 2011 לסקירה)5. עם זאת, חלבונים יש תכונות מועילות רבות: כמו מה שנקרא "דיוק פולימרים," הם מסתיימים; יש להם באורך מוגדר; הם קלים יחסית לשינוי; . ויש להם מספר רב של היעד אתרים14,15. בהקשר זה, ניתן להפיק ספציפי מאוד, חדשני מבנים עבור יישום בתחומים רבים. במחקר זה, המבוסס על חלבון הידרוג16 שימש להפגין את היכולת של שיטות ומבוססת להשפיע על הארכיטקטורה תלת-ממד של החומר. יתר על כן, היכולת של ותחולה לדור נקבובית גם נחקר.

טכניקות רבות זמינות לשנות מבנים תלת-ממד, כולל שיטות פשוטות והן בטכניקות מתוחכם, מאוד מיוחדים מתחומים שונים של חומר מדעי. טכניקה נפוצה היא השימוש electrospinning כדי ליצור מבנים מוגדרים היטב17. סיבי טעונה נשלפות מקבוצת פתרון על ידי שדה חשמלי, ואז לחזק עם חשיפה לחמצן. בדרך זו, יכול להיות מיוצר סיבי בטווח של ננומטרים עד מספר מיקרונים. שיטות נוספות לכוון את גודל המבנה, הפצה של הנקבוביות בתוך המטריצה הם הדפס אבן רכה, פוטוליתוגרפיה, מיקוד hydrodynamic, אלקטרו ריסוס, ביו-הדפסה18,19,20. חיסרון משמעותי של טכניקות אלה הוא התלות שלהם על ציוד ספציפי, יקר ולא בחומרים כימיים מיוחדים או חומרים. יתר על כן, ניסיון עם טכניקות אלה הוא לעתים קרובות לא להעברה ישירות חומרים מבוססי חלבונים, רבים של כימיקלים והשיטות אינם תא תואם.

מצד שני, טכניקות רבות אין לסמוך על ציוד מיוחד, שהופך אותם קל וזול כדי להחיל ולאחר להתרבות. שיטה נפוצה עבור מבנה מניפולציה הוא הליהוק הממס21,22,23. חלקיקים נוספים לפני התגובה הפילמור ומופצים למשל כדי להרוות את הפתרון. לאחר הפילמור, שינוי של תנאי לדילול או שינוי pH, מוביל יוצרות של החלקיקים, בעוד הנקבוביות להישאר בתוך החומר. הכימיקלים שמשתמשים בהם בטכניקות אלו, כגון מלח, סוכר, פרפין, ג'לטין, גיר, הם זול וזמין. ב ליופיליזציה, hydrogels נפוחות מוקפאים. סובלימציה עוקבות של השלבים נוזלי תחת ואקום הוא ואז לבצע24,23,25. סובלימציה מים מן הרשת הוא עדין מספיק כדי לשמור על המבנים תלת-ממד מסוים של החומר. גז קצף, פתרון זרמו עם גז, ואילו הפילמור מתרחש, עוזב את הנקבוביות בתוך ג'ל21. ניתן להתאים את גודל ואת ההפצה של הנקבוביות בהתאם זרם הגז.

כדי ליצור את הידרוג חלבון, BSA היא הגיבה כלוריד phosphonium tetrakis (hydroxymethyl) (THPC) בתגובה Mannich-סוג כדי לאפשר היווצרות קשרים הדדיים בין אמינים ראשי הקבוצות הידרוקסי של מולקולה ארבע חמוש מקשר26. אפשרי intermediates מזיקים יוסרו על ידי שטיפה מוגזמת של החומר לאחר התגובה מתרחשת.

מחקר זה מדגים את האפשרות לטיפול חומר מבוסס-BSA עם טכניקות שונות כדי לשנות, להתאים את גודל הנקבוביות. כל אחת מהטכניקות יכול לשמש במעבדה כל ברחבי העולם, אין ציוד מיוחד הכרחי. בנוסף, פרמטרים שונים, כגון יחס נפיחות degradability אנזימטיות, pH ויציבות הטמפרטורה רגישות, היו בחן, לעומת אחד את השני, במיוחד מכבדים להשפעתם של הטכניקות השונות על הדור של ארכיטקטורות תלת-ממד. לבסוף, החומרים היו functionalized עם תא-דבק פפטידים לחקור אפשרי ליישום חומרי תרבית תאים. שתי שורות תאים מודל שונה שימשו: A549 ו- MCF7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הידרוג הכנה

  1. מערבבים 200 מ ג של BSA עם 1 מ"ל של יונים H2O ליצירת מלאי BSA 20% (w/v) (מניות פתרון A).
  2. µL 165 תערובת של THPC פתרון (134 mg/mL) עם 4.835 מ ל מים יונים כדי ליצור THPC במניה פתרון (פתרון מניות B).
  3. שוקל 1 מ ג של KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) פפטיד (או של פפטיד תא-דבק המקביל), למהול אותו ב- µL 100 סטרילי H2O להשגת פתרון 10 מ"ג/מ"ל (מניות פתרון C).
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי והוא רק צריך להיכלל אם הידרוג נועדה ליישום התרבות תאים.
  4. להסיר את החלק התחתון של צלחת 96-ובכן ולהחליף אותו עם ניילון נשלף.
    הערה: עבור לוחות המשמש כאן, התחתון אפשר להסיר בקלות על ידי הפעלת לחץ בתחתית כל טוב; בתחתית פלסטיק דק פשוט יפול החוצה.
  5. מיקס 100 µL של פתרון מניות BSA (א) ו- µL 100 של THPC במניה פתרון (B) (אופציונלי: 4 µL של מניות פתרון C hydrogels functionalized, תא-דבק) בצלחת 96-ובכן כדי לקבל 200 µL של הידרוג. לערבב את המרכיבים על ידי pipetting למעלה ולמטה לפחות 5 פעמים כדי להבטיח הידרוג אחיד לאחר הפילמור.
  6. מקם את הצלחת 96-ובכן בטמפרטורת החדר (RT) למשך כ- 10 דקות עד כל hydrogels הם polymerized כראוי.
  7. לאט ובזהירות להסיר את ניילון נצמד מהחלק התחתון של הלוח.
  8. הקש את hydrogels מהצלחת 96-ובכן באמצעות חותמת קטנה, להעביר אותם ל 1.5 mL צינורות עם PBS סטרילי, pH 7.4.
    הערה: hydrogels יש בצורת גליל, עם קוטר של 4 מ מ, גובה של 8 מ מ.
  9. אחסן את hydrogels באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 ° C עד מספר חודשים.

2. ליופיליזציה את Hydrogels

  1. למלא 1.5 mL צינורות µL 500 סטרילי יונים H2O, הסירי את הפקק. להעביר את hydrogels 1.5 mL התגובה הצינורות בעזרת מרית.
  2. לעטוף את הצינורות 1.5 mL בחוזקה עם פרפין הסרט--לפחות שלוש שכבות עבור כל מבחנה. שימוש במחט לנקב חורים קטנים בסרט כדי לאפשר שחרור הגז באמצעות הרכבת התחתית.
  3. המשך לאחד השלבים הבאים:
    1. להעביר את המבחנה חנקן נוזלי פתרון עבור 5 דקות כדי להבטיח כי המים של הידרוג לחלוטין להקפיא. מיד לאחר הסרת של החנקן הנוזלי, להעביר את הבקבוקונים ההקפאה מייבש כדי למנוע את החומר מפשיר.
      הערה: הליך זה תוצאות הנקבוביות על 10-15 מיקרומטר ברדיוס.
    2. שמור את הבקבוקונים ב-20 ° C בלילה לאט להקפיא את hydrogels. מיד לאחר הסרת מ-20 ° C, להעביר את הבקבוקונים ההקפאה מייבש כדי למנוע את החומר מפשיר.
      הערה: הליך זה תוצאות הנקבוביות על 50-60 מיקרומטר ברדיוס.
  4. לאחר 24 שעות (אידוי מוחלט של המים סביב את הידרוג), להפשיר את החומר על-ידי הסרתו מכוננים ההקפאה מייבש.
    הערה: ניתן לנתח את גודל הנקבוביות עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (שלב 5, "הידרוג ויזואליזציה").

3. חלקיקים שטיפת

  1. הכינו את הידרוג כמתואר בצעדים 1.1-1.5.
  2. לאחר ערבוב המרכיבים, להוסיף ישירות NaCl עד רוויה מתרחשת (36 מ"ג/מ"ל). מוסיפים מלח עד גביש מלח ניתן לראות בפתרון התמיסה לבן.
  3. להעביר את הצלחת 96-ובכן מטרף ומנערים עד הפילמור מתרחש (כ- 10 דקות). הסר את hydrogels הצלחת, כמתואר בצעדים 1.7-1.8.
  4. דגירה של hydrogels לפחות 24 שעות ביממה במלון RT במים סטריליים על מטרף (20 סל ד) כדי elute כל מלח מן התבנית הידרוג. לאחסן את hydrogels ב 4 ° C ב- PBS עבור אפילו מספר חודשים.

4. ערוץ היווצרות

  1. להכין hydrogels כפי שמתואר בשלב 1. להסיר את הידרוג הפתרון באמצעות מלקחיים ומרוקנים את המים העודפים עם נייר סופג מאוד, מניחים אותה על גוש קרח יבש.
  2. להקפיא את הידרוג ב-30 s בזהירות להסיר אותו מהגוש. לא לעשות נזק של הידרוג; בזהירות להשתמש מרית לגרד אותו הבלוק. להעביר את הידרוג צינור 1.5 מ"ל וזה יבש לילה ב 37 º C.

5. הידרוג ויזואליזציה

  1. הכן פתרון מניות rhodamine B על ידי דילול 1 מ ג של rhodamine B ב- 10 מ"ל ל- PBS. להכין לדילול טורי על-ידי דילול הפתרון rhodamine מניות ב- PBS עד ריכוז של 0.001 מ"ג/מ"ל (דילול פקטור: 100)
  2. הסר את הידרוג הפתרון אחסון (למשל, משלב 2.4.), להעביר אותו צינור 1.5 מ עם 1 מ"ל של 0.01 מ"ג/מ"ל rhodamine B פתרון. מכתים את הידרוג לילה ב- rhodamine B פתרון RT.
  3. למחרת, להעביר את הידרוג אשר ניתן לאבחן עד 10 מ"ל של PBS (pH 7.4) ושטוף במשך לפחות 3 שעות.
  4. להעביר את הידרוג לשקופית ממוצע-8 היטב, לכסות אותו. עם PBS.
  5. לחתוך פרוסות קטנות הידרוג (בערך גובה 0.5 מ מ בתוך) באמצעות סכין.
  6. באמצעות לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ, להמחיש את הידרוג באורך-גל של 514 nm (המטרה: EC תוכנית-Neofluar 40 x / 1.30 שמן DIC M27, המטוס במצב סריקה: 514 ננומטר, and זום: 1 X).

6. תא תרבות היתכנות

  1. מסנן סטרילי כל מלאי פתרונות (A, B ו- C) עם מסנן 0.45 מיקרומטר.
  2. הכינו את הידרוג כמתואר בצעדים 1.1-1.4, כולל את פפטיד תא-דבק לפני הידרוג הפילמור.
  3. לאחר ערבוב המרכיבים, מיד pipette את התערובת לתוך ממוצע-שקופית 8 טוב עד החלק התחתון מכוסה לגמרי.
    הערה: שלב זה חייב להתבצע ישירות ובמהירות לאחר ערבוב את הרכיבים, כמו הפילמור מתרחש בתוך דקות בשקופית.
  4. התרבות התאים אדהזיה, מעבר כדי לקבל השעיה תא בודד באמצעות טכניקות תרבות תא סטנדרטי. להעביר את התאים מראש ומחוממת, אמצעי סטרילי של תרבות תא DMEM בתוספת סרום שור עוברית (FBS, 10% (w/v)), פניצילין-סטרפטומיצין (1% (w/v)), והפתרון חומצת אמינו שאינן חיוניות (גברתי, 1% (w/v)).
  5. הרוזן את התאים עם נויבאואר ספירת קאמרית, בזהירות פיפטה µL 200 של מספר תאים (2 x 105 תאים/cm2) על גבי משטח הידרוג הרצוי.
  6. מכסה את ממוצע שקופית 8 עם המכסה, להעביר אותו אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2). תקופת דגירה של פחות 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  7. לאחר לפחות 4 שעות של קובץ מצורף הסלולר, לשטוף את התאים פעמיים עם 200 µL של תרבית תאים סטרילי PBS.
  8. לתקן את התאים µL 200 פורמלין 3.7 אחוזים (v/v) למשך 10 דקות ב RT. ולשטוף פעמיים עם PBS (~ 200 µL).
    הערה: ללבוש ציוד מגן אישי המתאים בעת טיפול פורמלדהיד.
  9. Permeabilize התאים עם 200 µL של 0.1% X טריטון עבור 5 דק לשטוף פעמיים עם PBS.
  10. כתם התאים עם phalloidin-rhodamine על-ידי ערבוב µL 5 מניות methanolic עם µL 195 ל- PBS והוספת זה לתאים-כתם RT. את התאים עבור 20 דקות בחושך. לשטוף פעמיים עם PBS.
  11. לחקור את מאפייני אדהזיה תא בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי 514 nm (המטרה: EC תוכנית-Neofluar 40 x / 1.30 שמן DIC M27, המטוס במצב סריקה: 514 ננומטר, and זום: 1 X). לנתח את התמונות באמצעות תוכנה מתאימה (ראה את הטבלה של חומרים).

7. הידרוג מאפיינים

  1. נפיחות יחס.
    1. יבש לחלוטין את hydrogels ב 37 מעלות צלזיוס לפחות ליום אחד.
    2. שוקל כל הידרוג ורשום את המשקל המדויק.
    3. למלא צינור תגובה 2 מ ל mL 1.5 ל- PBS.
    4. להעביר את הידרוג לתוך הצינורית התגובה הזאת 2 מ"ל, לגמרי לטבול אותו ב- PBS.
    5. להשאיר את הידרוג לפחות יומיים ב- PBS ב RT להגיע שיווי משקל עם טוב, מגניב.
    6. לאחר שלושה ימים, להסיר את הידרוג הפתרון, לייבש אותו עם ממחטת נייר כדי להסיר עודפי מים מפני השטח הידרוג.
    7. שוקלים את הידרוג.
    8. לחשב את יחס נפיחות באמצעות הנוסחה הבאה:
      figure-protocol-1
      כאשר Wd הוא משקל של הג'ל מיובשים (שלב 7.1.2.) ו- Ws הוא המשקל של הג'ל רטוב (שלב 7.1.7). הכפל עם 100 כדי לקבל את אחוז יחס נפיחות.
  2. יציבות pH וטמפרטורה.
    1. להעביר 5 מ של PBS צינור תגובה 15-mL.
    2. התאם את פתרון ה-pH המתאים (למשל, pH 2, 7 או 10) עם NaOH, HCl. הביאו הפתרון הטמפרטורה המתאימה (למשל, RT, 37 ° C או 80 ° C).
    3. להעביר את הידרוג זה להיחקר על יציבותו לתוך הפתרון המתאים. להתאים מחדש את ה-pH במידת הצורך.
      הערה: כל hydrogels צריך להיות לגמרי נפוחות בשלב זה (ראה את היחס נפיחות) כדי למנוע פרשנות שגויה של המשקל עקב הנפיחות של החומר.
    4. לאחר במרווחי זמן מסוימים, להסיר את הידרוג מהפתרון (למשל, כל שעה עד 2 ימים), לייבש אותו עם ממחטת נייר סופג מאוד להסיר את המים העודפים, שוקל אותה.
  3. השפלה אנזימטיות.
    1. להכין פתרון אנזים מניות של 300 U טריפסין, פפסין, לפי הוראות היצרן.
    2. להעביר את הידרוג (למשל, משלב 1.8) הפתרון המתאים.
      הערה: כל hydrogels צריך להיות לגמרי נפוחה בשלב זה כדי למנוע פרשנות שגויה של המשקל.
    3. לאחר במרווחי זמן מסוימים, להסיר את הידרוג מהפתרון (למשל, כל שעה), לייבש אותו עם ממחטת נייר סופג מאוד להסיר את המים העודפים, שוקל אותה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח הידרוג'ל הפך לאחד התחומים הבולטים ביותר במחקרים ביולוגיים הקשורים למחקר חומרים, עם אלפי ערכים המאונדקסים בארכיוני מחקר מדעי. למרות שהתנהגותן של מערכות רבות נחקרת היטב, מניפולציה של רשתות תלת מימד, במיוחד של חומרים מבוססי חלבון רגישים, היא לעתים קרובות נושא מרכזי במדעי החומרים. אתגר נפוץ נוסף שזלזל בו הוא המדידה הנכונה של המבנה המקורי של חומר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריו. הסיבה לכך היא שתהליך הכנת הדגימה (כלומר, ייבוש) משנה לעתים קרובות את תכונות ההידרוג'ל. כדי להתגבר על...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצור מטריצות מקרו-נקבוביות יכול להועיל לתחומים רבים ושונים. יש לו פוטנציאל טכני וכלכלי גבוה בשל המבנה המוגדר של ההידרוג'ל והיכולת לשלוט ולכוונן תכונות חומר ספציפיות. עם זאת, הכנסת אלמנטים מבניים סופרמולקולריים, כגון נקבוביות או תעלות, לתבנית תלת מימדית עשויה להשפיע על התכונות הכוללות של חומר, כגון יחס הנפיחות או הנוקשות. זה יכול לגרום לפירוק, השפלה או התמוטטות לא רצויים של הרשת, ובכך להפוך את החומר לחסר תועלת או פשוט לא ישים עבור היישום הרצוי12. לחלבונים יש פוטנציאל ידוע ליישום בהידרוג'לים בשל המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצה להודות באדן-וירטמברג Stiftung לתמיכה הפיננסית שלהם במסגרת "סינתזה חומר Bioinspired" (BioMatS-14).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני (גלוקוז גבוה)Life Technologies / תרמו פישר 11140-050
סרום בקר עוברי (FBS)Life Technologies / תרמו פישר 10270-106
פניצילין-סטרפטומיציןטכנולוגיות חיים / תרמו פישר 
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניותסיגמא אולדריץ'M7145-100 מ"ל
טריפסין EDTA 0.05% פנולאדום תרמו פישר 25300062
אתנול 99.8%, vergä lltÖ lfabrik Schmidt2133
NaCl קארל רות' 9265.1
אלבומין שבר Vקארל רות' 3854.2
THPCסיגמא אולדריץ'404861-100 מ"לרעיל
0.1% טריטון X-100סיגמא אולדריץ'X100-100 מ"למעט רעיל
פלואידין-רודמין לייף טכנולוג'יז / תרמו פישר ₪100
3.7% פורמלדהיד לייף טכנולוג'יז / תרמו פישר F8775-25MLרעיל
Bסיגמא אולדריץ'81-88-9
פילטרופור S 0.2 Sarsted Ag und Co.2 83.1826.001     
&מיקרו; שקופית 8 בארIbidi GmbH80826
KCSSGKSRGDS פפטידUPEP Ulmמותאמת אישית
אתנול 99.8%, vergä llt קארל רות' K928.5
פלקון 5 מ"ל שפופרת פוליסטרן עגולה תחתונה Sarsted Ag und Co.62.547.254     
שפופרות 50 מ"ל Sarsted Ag und Co.62.547.254     
שפופרות 1.5 מ"ל   Sarsted Ag und Co.72,690,001
שפופרות 2 מ"ל   Sarsted Ag und Co.72,691
מיקרופלייט תרבית תאים, 96 בארות, נ.ב. F-תחתוןגריינר655073
מייבש הקפאה אפסילון 1-6D,  Christ, Osterode am Harz, גרמניה
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי Carl Zeiss AG, Oberkochen, גרמניה
Zen Software Version 2012 Sp1, מהדורה שחורה, 407 גרסה 8,1,0,484Carl Zeiss AG, Oberkochen, גרמניה
GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, גרסה 419 3.8.7GSA GmbH
15140122 רודמין מערכת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
  2. Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
  3. Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  4. Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
  5. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
  6. Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
  7. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
  8. Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
  9. Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
  10. Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
  11. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
  12. Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
  13. Chiu, Y. -C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728(2013).
  14. Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
  15. Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker's yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
  16. Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
  17. Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
  18. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001(2010).
  19. Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
  20. Selimović, Š, Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
  21. Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
  22. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  23. Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
  24. Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977(2015).
  25. Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
  26. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
  27. Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
  28. Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
  29. Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
  30. Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
  31. Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
  32. Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
  33. Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763(2011).
  34. Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Protein based HydrogelsMacroporous HydrogelsPore Size AdjustmentSalt Leaching MethodGradient FreezingConfocal MicroscopyRGD Peptide ModificationCell Adhesion AnalysisHydrogel Freeze dryingBSA Hydrogel System

מאמרים קשורים