קביעת תדירות המעכבות האופטימלית עבור תאים סרטניים באמצעות גידול טיפול פילדס (TTFields)

פילדס טיפול גידול (TTFields) מתקיים וידוע אנטי המיטוטי לטיפול multiforme גליובלסטומה וסוגי סרטן אחרים בפוטנציה. השדות מועברות באמצעות יישום מתמשך של בעצימות נמוכה (1-3 V / ס"מ), בתדר ביניים (100-500 קילו-הרץ), לסירוגין שדות חשמליים לאזור של הגידול ^{1, 2.} יישום TTFields במבחנה ובחי הוצג לעכב גם את הצמיחה של שורות תאים סרטניות שונות ואת ההתקדמות של הגידולים במודלים שונים של גידולים בעלי חי ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.} ניסויים קליניים פיילוט ומחקרים אקראי גדול בחולים עם גידולים מוצקים, כולל גליובלסטומה וסרטן ריאות מסוג תאים לא קטנים, יש demonstדורג הבטיחות והיעילות של יישום ⁸ TTFields ^{הרציף, 9, 10.} יעילותה של TTFields נמצאה להיות: (1) תדירות תלויה, עם תדרי מיטביים ספציפיים שהובילו להפחתה הגבוהה ביותר ספירת התאים של שורות תאים ממקורות שונים ^{1, 2, 4, 5, 6, 7;} (2) עוצם תלוי שדה חשמלי, עם סף מינימאלי לפעילות בסביבות 1 V / סנטימטר ועוצמות ¹ גבוהות יותר ^{חזקות, 2, 7, 11;} (3) משופר כאשר משך הטיפול היה ארוך ^5; ו (4) גבוה יותר כאשר 2 TTFields כיוונית יושמו בניצב כל othאה, לעומת שדות חשמליים להחיל מ בכיוון אחד בלבד ^1. בהתבסס על הממצאים הנ"ל, ניתן ליישם TTFields לחולים עבור משכי זמן באמצעות 2 סטים של מערכים מתמרים המקומיים על העור של המטופלים על מנת למקסם את עוצמות שדה החשמליות במיטת הגידול ^{12, 13.}

חקר ההשפעה של TTFields על תאים סרטניים במבחנה מספק כיום הדרך היחידה לקבוע את התדירות האופטימלית לחול על סוג גידול ספציפי. בדיקה עבור התדר האופטימלי דורש מכשיר המאפשר יישום של תדרים שונים בטווח של 100-500 קילו-הרץ ו בעוצמות של עד 3 V / ס"מ שורש ממוצע הריבועים (RMS) לתרבות התא. כיישום TTFields מייצרת חום, מערכת היישום דורש את היכולת לפזר חום מופרז תוך שמירה על שליטה הדוקה על הטמפרטורה.

מספר התקנים were שפותחה לאורך השנים על מנת לאפשר יישום TTFields כדי תרביות תאים ^{1, 2, 5, 14, 15, 16.} בכל התקנים אלה, האלקטרודות השתמשו היו מבודדות כדי למנוע את האזהרות מעורבות עם השימוש אלקטרודות מוליך, כגון חילופי אלקטרונים על פני שטח האלקטרודה ואת שחרורו של יוני מתכת הרעילים לתוך המדיום ^1. ההבדל העיקרי בין מערכות יישום השונות TTFields נבדקות הוא הסוג של בידוד אלקטרודה בשימוש, גם עם אלקטרודות עשויות חוטי מתכת מבודדים עם שכבה דקה של מבדד ^{2, 14, 15, 16} או עם חומר דיאלקטרי-קבוע גבוה (למשל, titanat niobate-עופרת מגנזיום עופרתדואר (PMN-PT)) ^6. בעוד אלקטרודות התילים המבודדים להציע פתרון פשוט יחסית וחסכוני עבור יישום TTFields, הם מוגבלים לעתים קרובות על ידי המתח הגבוה הנדרש כדי להשיג עוצמות שדה חשמלי יעילות מעל סף 1 V / סנטימטר ועל ידי המשטח הזמין עבור ציפוי תא, כמו המרחק בין האלקטרודות הוא קטן יחסית. מערכות המבוססות על אלקטרודות מבודדים באמצעות חומר דיאלקטרי-קבוע גבוה דורשות יכולות עיצוב וייצור מיוחדות, ובכל זאת הם אינם דורשים מתח גבוה והוא יכול להציע שטח גדול יותר עבור צמיחת תאים בין האלקטרודות.

מערכת היישום במבחנה ב TTFields המשמשת בעבודה זו השתייך האחרונה של מערכות, עם יחידת הליבה להיות בצלחת פטרי (צלחת TTFields, ראה איור 1) מורכב גבוה דיאלקטרי-מתמיד קרמיקה (כלומר, PMN-PT). שני זוגות של אלקטרודות מודפסים בניצב על החיצוני וולLs של צלחת TTFields כדי לאפשר את היישום של שדות חשמליים מ 2 כיוונים. האלקטרודות מחוברות לגנרטור גל גל סינוסואידלי ומגבר, המאפשרות יישום TTFields בטווח התדר של 50-500 קילו-הרץ. על מנת להפיג את החום המוגזם, מנות TTFields נשמרות בתוך חממה בקירור, עם בקרת טמפרטורה בינונית שבוצעה באמצעות ניטור מתמיד של טמפרטורת צלחת והתאמות למתח המופעל על ידי המערכת. בפועל, הגדרת החממה לטמפרטורה נמוכה יותר תוביל לעוצמות שדה חשמלי גבוהות יותר, כאשר המערכת מגדילה את המתח עד לטמפרטורת המטרה בתוך המנה. ההבדל בין הטמפרטורה בתוך המנה ואת הטמפרטורה חממה עלול להוביל כמה אידוי, בהתאם gradients טמפרטורה; לפיכך, המדיום התרבות צריך להיות מוחלף כל 24 שעות כדי לשמור על תנאי צמיחה נאותים.

פרוטוקול להלןמתאר את ההליך הניסויי כדי לייעל את היישום של תדרים TTFields לתאי סרטניים, כך ירידה מקסימלית בספירת התאים ואת הפחתת הפוטנציאל של התאים שורדים כדי ליצור מושבות מושגות.

1. TTFields במערכת Application גופית - צלחת הבסיס ותחזוקה Dish

1. שוטפת כלים, מכסה צלחת תחת מים זורמים מהברז. לאחר מכן לשטוף עם מים ללא יונים ולמטה פנים יבש-אוויר.
2. אם סוכן / סמים כימותרפיות נוספו מנות בניסוי קודם, למלא כל מנה בתמיסת ניקוי 5% לאור ולהשאיר למשך לילה.
   1. יש לשטוף את הכלים ביסודיות תחת מים זורמים מברז כדי למנוע כל עקבות של חומר ניקוי בתוך הצלחת. יש לשטוף את הכלים ואת צלחת מכסה עם מים ללא יונים ופן אוויר יבש למטה.
3. הכנס את הכלים נקיים ויבשים שכריכותיהם לתוך שקיות עיקור. חותם ולמקם את התיקים ב חיטוי, עם המנות עם הפנים כלפי מטה. חיטוי במשך 30 דקות ב שלא יעלה על 121 מעלות צלזיוס.
4. הגדר את החיטוי על תכנית יבשה, חלקית לפתוח את דלת החיטוי, ולייבש את הכלים עבור 30 דקות.
5. נגב את צלחת הבסיס באמצעות מטלית ספוגה קלה עם אתנול 70%.
</ Ol>

2. הגדרת הניסוי

הערה: כל החומרים והחומרים המשמשים בפרוטוקול זה מתוארים ברשימת החומרים. כל השלבים הבאים צריך להתבצע בתוך ארון זרימה למינרית בעוד תנאים סטריליים נשמרים.

1. הכן את הכלים והמכסים הטפיליים והנקיים של TTFields, כמתואר בסעיף 1. נגב את צלחת הבסיס עם מטלית לחה קלות באתנול של 70%.
2. התקן את הכלים TTFields עם מכסה על צלחת הבסיס על ידי לחיצה בעדינות על צלחת סיבוב בכיוון השעון על ידי 5 מ"מ עד שפת המנעול נועל על שלושה סיכות על צלחת הבסיס. מניחים סטרילי 22 מ"מ coverslip (מטופלים פלסטיק או זכוכית) על החלק התחתון של כל מנה.
3. הכן את ההשעיה התא במדיום צמיחה מלאה (Dulbecco שונה של הנשר בינוני עבור U-87 MG ו F98, RPMI עבור A2780 ו OVCAR-3, בתוספת כמתואר ב רשימת חומרים).
   הערה: ה - CELl ריכוזים תלויים סוגי תאים משך הניסוי, 80% -90% התאים confluent התא לא צריך להיות חריגה עד סוף הניסוי.
   זהירות: קווי תאים אנושיים עשויים לייצג סיכון ביולוגי ויש לטפל בהם באמצעי הבטיחות המתאימים.
4. מקום 200 μL ההשעיה התא (בדרך כלל 5,000-20,000 תאים μL 200 לניסוי 72 שעות, בהתאם לזמן הכפלת) כמו ירידה במרכז coverslip כל לכסות את המכסה צלחת.
5. לדגור על 37 מעלות צלזיוס CO ₂ באינקובטור עד התאים לדבוק; הדגירה לילה אפשרי בשלב זה.
6. לשאוב את הנוזלים מן הירידה באמצעות פיפטה 200 או 1000-μL.
7. בעדינות פיפטה 2 מ"ל של המדיום צמיחה מלאה למלא כל מנה. השתמש קצה סטרילית פיפטה ו בשקט הקש על הקצוות coverslip לשחרר את בועות אוויר מדי פעם נתפס מתחת לשקופית.
8. מכסים את הכלים עם המכסים שלהם ומכניסים אותם פנימהIDE חממה CO ₂ ב 37 ° C עד תחילת הטיפול TTFields.

3. TTFields Application

1. מעביר את צלחות בסיס עם מנות TTFields המצורפות חממת CO ₂ בקירור.
   הערה: In vitro יישום TTFields יפיק חום; ולכן, חממה בקירור נדרשה לפצות על ההתחממות של המנות. עוצמות TTFields גבוהות תפקנה יותר חום תדרושנה בטמפרטורות סביבת חממה נמוכה (ראה טבלה 1). מבחינה קלינית בעוצמות TTFields הרלוונטי מושגות כאשר הטמפרטורה בחממה במשך יישום TTFields היא בטווח של 18-30 מעלות צלזיוס.
2. חבר את מחבר הנקבה הכבל השטוח צלחת הבסיס. החלף מחולל TTFields על.
3. התחל את TTFields בתוכנת מערכת יישום במבחנה ובחר את גדרות הניסוי.
   1. גדר ניסוי חדש. הקלד את השם של experiment ובעל הניסוי בממשק המשתמש של התוכנה על מסך המחשב. התאם את התדירות ואת טמפרטורת היעד עבור כל צלחת צלחת או בסיס.
4. הפעל את יישום TTFields באמצעות התוכנה.
5. ודא שכל הכלים מחוברים כראוי מופיע בצבע תכלת על הצג. אם צלחת שמקיפה אותה עם מסגרת אדומה (כלומר הוא אינו מחובר כראוי), ומהדק אותו בעדינות לסובב לאט קדימה ואחורה עד המגעים משוחזרים ואת המנה מופיעה תכלת.
6. השאר את TTFields במערכת יישום במבחנה פועל עד 24 שעות.
7. אם הניסוי מגיע נקודת הסיום שלו, להפסיק את הניסוי על ידי לחיצה על הכפתור סיים את הניסוי בתוכנה ולהמשיך לשלב 5. אם לא, לחצו על השהה ניסוי.
8. ניתק את מחבר הכבל השטוח מצלחת הבסיס. הסר את צלחת הבסיס עם מנות מן החממה לארון זרימה למינרית.
9. החלף את המדיום בכל צלחתEs כל 24 שעות ולהחזיר את צלחת הבסיס כדי חממה בקירור. חבר את לוח הבסיס לגנרטור באמצעות הכבל השטוח. המשך בניסוי על ידי לחיצה על הלחצן CONTINUE.

4. בקרת דוגמאות

הערה: לגדל תאים שליטה בתנאים דומים לתאי TTFields שטופלו, למעט יישום TTFields.

1. פלייט בקרת דגימות עם ההשעיה אותו על משטח דומה המשמש ציפוי דגימות TTFields שטופלו.
2. מניחים מנות שליטה CO ₂ באינקובטור ב 37 ° C.
3. החלף את המדיום במנות כל 24 שעות כדי להתאים את התנאים TTFields צלחת בינונית.

5. סיום הניסוי

1. לאחר לחיצה על END EXPERIMENT, המתן לתוכנה לאחזר את כל הרשומות מהמערכת ולשמור את הרשומות במחשב.
2. השתמש בלחצן REPORTS כדי לסקור את הטמפרטורה, זרם ההתנגדות והיומן התנגדותאיילס כל צלחת בסיס כדי לוודא שכל הכלים טופלו בהתאם לתכנית הניסיונית.
   הערה: כל הדיווחים והיומנים נשמרים במחשב לאחר תום הניסוי ניתן לעיין בכל עת.
3. כבו את הגנרטור TTFields.
4. ניתקתי את הכבל השטוח מצלחת הבסיס ולהסיר מן החממה.
5. כדי להסיר בצלחת, עיתונות קרמיקה מטה והופך את המנה בניגוד לכיוון שעון כדי לפתוח אותה צלחת הבסיס.
6. קחו את הכלים לארון זרימה למינרית בסביבה נקייה מחיידקים להסיר את coverslips. העבר אותם סטרילית צלחות פטרי המכילות בינוני טרי או פוספט שנאגר מלוח (PBS) לבדיקה והערכה נוספות.

6. הערכה של השפעת TTFields

הערה: תופעות TTFields יכול להיקבע במספר דרכים. השתמש באחת או יותר מהשיטות הבאות כדי להשוות תאים שטופלו לתאי קבוצת ביקורת:

1. תא ספירה
   1. הסר את המדיום / PBS מכל מאכל coverslip המכיל.
   2. להוסיף 0.5 מ"ל של 0.25% טריפסין / EDTA לכל צלחת לדגור עד 10 דקות (כלומר, עד שהתאים מתחילים לנתק מפני השטח coverslip) בשעה 37 ° C חממה ₂ CO.
   3. להוסיף 0.5 מ"ל של מדיום הגידול להשלים כדי לנטרל את טריפסין מחדש להשעות את התאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
   4. ספירת התאים באמצעות כל טכניקת ספירת תאים סטנדרטית התואמת לספור ריכוזי תא נמוכים (כלומר, בסביבות 20,000 תאים / מיליליטר).
2. assay clonogenic
   1. פלייט מספר דומה של תאים (100-500 תאים לכל צלחת) מכל מאכל על גבי צלחות פטרי חדש, סטרילי או צלחות 6-היטב המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול שלם טרי.
   2. מדגירי CO ₂ באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 שבועות (תלוי את המאפיינים של כל שורת תאים) עד המושבות מורכבות ~ 50 תאים נוצרים. להעריך את התאמספר מושבה על ידי מיקרוסקופ אור.
   3. הסר את המדיום ולשטוף עם PBS.
   4. הסר את PBS ולהוסיף מתנול קר כקרח (1 מ"ל). דגירה ב -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או יותר.
   5. הסר את המתנול.
   6. הוספת פתרון סגול קריסטל (0.1% w / V ב 25% V / V מתנול במים) ו דגירה במשך 20 דקות.
      זהירות: קריסטל ויולט הוא מסרטן פוטנציאלי; כפפות להשתמש תוך כדי עבודה עם קריסטל ויולט.
   7. הסר את סגול קריסטל, לשטוף 3 פעמים עם מים deionized, ויבש באוויר.
   8. ספרו את המושבות שנוצרו בכל מנה.

תוצאות לאחר יישום TTFields בעת סריקת תדרים שונים ניתן לכמת בהתבסס על מבחני שונים, כגון ספירת תאים, מבחני colorimetric, מבחני clonogenic, ובדיקות על השינויים במספר התאים הפולשים באמצעות תא Boyden ממוקם בתוך קיר גבוה TTFields גבוהה צלחת תרבות תאים. תכנון ניסיוני זהיר מבוסס על זמני הכפלת תאים קבועים מראש יאפשר לתאים להגיע למספר המקסימלי של אירועים מיטוטיים במהלך משך הטיפול, ובכך למקסם את תוצאות הטיפול.

איור 2 ממחיש תוצאת סריקת תדר טיפוסית לספירת תאים ממוצעת ( כלומר, מספר תאים) ואסאי clonogenic של A2780 ( כלומר, תאים סרטניים בשחלות האדם, איור 2 א ) 7 ו- F-98 ( כלומר, תאי עכברוש גליומה;"> האיור 2B) 1 שטופל בשני TTFields כיוונית (טווח תדרים: 100-500 kHz, RMS: 1.7 V / סנטימטר, וטמפרטורת חממה:. 18 ° C) התוצאות מראות ירידה משמעותית בספירה בכלל להחיל תדרים , עם ההפחתה המקסימלי ב 200 kHz עבור כל שורות התאים שנבדקו (ANOVA חד כיווני עם השוואה מרובה). התדירות האופטימלית שהובילה להפחתה הגבוהה ביותר את פוטנציאל clonogenic הייתה זהה עבור שני תאי A2780 ו- F98 (2B הדמוי ו- C) . מקדם המתאם פירסון בין מספר התא ואת ההשפעה clonogenic בכל תדר היה 0.967 (p = 0.002) ו 0.755 (p = 0.083) עבור A2780 ו- F98, בהתאמה.

איור 3 מדגים תוצאה תדירה סריקה עבור ספירת תאי ממוצע עבור OVCAR-3 (כלומר, תאים סרטניים בשחלות אנושיות; איור 3 א) ו- U-87 MG (כלומר, תאי גליומה אנושיים; איור 3B) תאים שטופלו בשני כיוונים של TTFields בעוצמות שונות (RMS: 1.7, 1.3, ו 1.0 V / סנטימטר, בהתאמה וטמפרטורת חממה: 18 ° C, 24 ° C, ו- 28 ° C, בהתאמה). התוצאות מראות כי בעוד עדיין יש ירידה משמעותית בספירת תאי OVCAR-3 לאחר טיפול עם TTFields 1.3-V / ס"מ (הטמפרטורה בחממה: 24 ° C), ההשפעה היא יחסית קטנה לעומת התוצאות המתקבלות כאשר התאים טופלו עם 1.7 V / ס"מ (הטמפרטורה בחממה: 18 ° C). U-87 תאים MG שטופלו 1.0-V / ס"מ TTFields (הטמפרטורה בחממה: 28 ° C) גם מדגימים מגמה דומה הפחתה של מספר התא כאשר מטופלים עם 1.7 V / ס"מ, אך ההשפעה לא הייתה משמעותית בעוצמות נמוכות .

Figure 1. מנות TTFields הותקנו על גבי יחידת צלחת בסיס מחוברות לכבל מלא TTFields השטוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. סריקות תדר עבור קביעת תדירות מעכבות TTFields האופטימלית (א) A2780 ו- (ב) בתאים F98. תאים שטופלו במשך 72 שעות עם TTFields של תדרים שונים (1.7 V / ס"מ 100-500 קילוהרץ). ההשפעה של טיפול TTFields הוערכה באמצעות ספירת תאי מבחני clonogenic. החץ מצביע על התדירות האופטימלית. התוצאות מייצגות ממוצעים ± SD מבוסס על לפחות 6 משכפל עבור כל התדרים הנבדקים. (ג) נציג תמונות של ים clonogenic אורביאל של A2780 תאים לאחר טיפול TTFields בתדרים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 . תדירות סריקות לקביעת תדר מעכב TTFields אופטימלי עבור (A) OVCAR-3 ו (B) U-87 תאים MG. תאים טופלו במשך 72 שעות עם TTFields של תדרים שונים (100-500 קילוהרץ) ועוצמות (OVCAR-3: 1.3 ו- 1.7 V / cm, U-87 MG: 1.0 ו- 1.7 V / cm). ההשפעה של טיפול TTFields נאמדה באמצעות ספירת תאים. החץ מציין את התדר האופטימלי. התוצאות מייצגות ממוצעים ± SD על סמך לפחות 6 משכפלים בכל תדר שנבדק."Target = 'pg _ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1. החממה טמפרטורת הסביבה ועוצמות TTFields צפוי בתוך צלחת TTFields.

פורת יערה, גלעדי משה, שניידרמן ס רוזה, בלאט רוני, Shteingauz אנה, זאבי עינב, מונסטר מיחל, וולושין טלי, Kaynan נועה, טל אורנה, ו Kirson ד אילון D משולמים לעובדים ב Novocure בע"מ, ישראל. וינברג אורי הוא שכיר של Novocure GmbH, לוצרן. יורם פלטי היא בעלת מניות ב Novocure בע"מ, ניו יורק.