אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

Vishnu V. Krishnamurthy; Aurora J. Turgeon; John S. Khamo; Payel Mondal; Savanna R. Sharum; Wenyan Mei; Jing Yang; Kai Zhang

doi:10.3791/55823

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55823

⸱

15 ביוני 2017

Vishnu V. Krishnamurthy^*¹ , Aurora J. Turgeon^*² , John S. Khamo¹ , Payel Mondal¹ , Savanna R. Sharum¹ , Wenyan Mei² , Jing Yang² , Kai Zhang¹^,³^,⁴

¹Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, ²Department of Comparative Biosciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, ³Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, ⁴Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה optogenetic כדי לווסת מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAPK) פעילות במהלך התמיינות תאים והתפתחות עובריים Xenopus . שיטה זו מאפשרת הפעלה הפיכה של המסלול איתות MAPK בתרבית תאים יונקים ועל אורגניזמים חיים תאיים, כמו עוברי Xenopus , עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

תקציר

פעילות קינאז היא קריטית עבור שפע של פונקציות הסלולר, כולל התפשטות תאים, בידול, הגירה, אפופטוזיס. במהלך התפתחות עובריים מוקדם, פעילות קינאז הוא דינמי מאוד נפוץ על פני העובר. גישות פרמקולוגיות וגנטיות משמשים בדרך כלל לחקר פעילות קינאז. למרבה הצער, זה מאתגר להשיג רזולוציה מרחבית וטמפורלית מעולה באמצעות אסטרטגיות אלה. יתר על כן, אין זה אפשרי לשלוט בפעילות קינאז באופן הפיך בתאים חיים ואורגניזמים רב תאיים. מגבלה כזו נותרה צוואר בקבוק להשגת הבנה כמותית של פעילות קינאז במהלך הפיתוח וההבחנה. עבודה זו מציגה אסטרטגיה optogenetic כי מנצל מערכת bicistronic המכיל חלבונים photoactivatable ארבידופסיס thaliana cryptochrome 2 (CRY2) ו N- מסוף מושלם של cryptochrome אינטראקציה סליל בסיסי לולאה סליל (CIBN). רברסיהפעלת BL של מיגוגן המופעל קינאז חלבון (MAPK) נתיב איתות מושגת באמצעות טרנספורמציה חלבון אור בתיווך תאים חיים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על תרבויות תאים יונקים ועוברי חוליות לחיות. מערכת bicistronic זו יכולה להיות כללית כדי לשלוט בפעילות של קינאזות אחרות עם מנגנוני הפעלה דומים ניתן להחיל על מערכות מודל אחרים.

מבוא

גורמי גדילה מעורבים במגוון רחב של תפקודי תאים, כולל התפשטות, הבחנה, הגירה ואפופטוזיס, וכן תפקידים מרכזיים באירועים ביולוגיים רבים, כולל התפתחות עובריים, הזדקנות, והסדרת המעמד הנפשי ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ . גורמי גדילה רבים אותות דרך מפלי איתות תאיים מורכבים. אירועים אלה איתות מופעלים לעתים קרובות על ידי זירזון הפיך החלבון בצורה מסודרת במדויק ⁶ ^, ⁷ . לכן, הבנה של תוצאות איתות של קינאזות חלבון, אשר אחראים על זרחון ח....