המטרה של פרוטוקול זה הוא מתאר את אוסף ועיבוד של דגימות כירורגיות אנושיות עבור יישומים במורד הזרם רבים schwannoma שיווי המשקל מחקר שוואן התא.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מסגרת מתודולוגית מאוחדת למחקר שוואנומה שיווי המשקל
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
Schwannomas שיווי המשקל הם neoplasms הנפוצים ביותר של זווית cerebellopontine, מה שהופך את 6-8% אחוז של כל גדיולים תוך גולגולתיים. למרות שגידולים אלה גורמים לאובדן שמיעה חושי עד ל -95% מהנפגעים, המנגנונים המולקולריים שבבסיס אובדן השמיעה נותרים חמקמקים. מאמר זה מתאר את הצעדים שנקבעו במעבדה שלנו כדי להקל על איסוף ועיבוד של דגימות רקמות אדם שונות עבור יישומים במורד הזרם מחקר אינטגרלי ללימוד שוואנומות שיווי המשקל. באופן ספציפי, עבודה זו מתארת מסגרת מתודולוגית אחידה לאיסוף, לעיבוד ולתרבות של שוואן ותאי שוואנומה מדגימות כירורגיות. זה משולב עם צעדים עיבוד מקבילים שנחשבים כיום חיוניים למחקר הנוכחי: אוסף של גידול הפרשות העצבים, שימור של רנ"א והפקת חלבון מ רקמות שנאספו, קיבוע של הרקמה להכנת סעיפים,ד את החשיפה של תאים אנושיים ראשוניים כדי adeno הקשורים וירוסים ליישום על טיפול גנטי. בנוסף לכך, עבודה זו מדגישה את הגישה התיראבינארית-כירורגית לאיסוף גידול זה כהזדמנות ייחודית להשגת אפיתל חושי אנושי מהאוזן הפנימית ומהפרילימף. טיפים לשיפור האיכות הניסיונית מסופקים ומלכודות נפוצות מודגשות.
מבוא
שוונומות שיווי המשקל (VS) הן הנפוצים ביותר של זווית cerebellopontine, מאובחנים 1 בכל 100,000 אנשים. אם כי לא גרורות, גידולים אלה משפיעים קשות על איכות החיים של המטופל 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . אנשים נפגעים בדרך כלל לחיות עם אובדן שמיעה, טינטון, ותחושה של מלאות aural. התסמינים הופכים יותר ויותר מתישים ככל הגידול גדל, גרימת בעיות איזון, שיתוק בפנים, ואת הליקוי של תפקודים עצביים גולגולתיים אחרים. סיבוכים מסכני חיים עקב דחיסת גזע המוח עשו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הסכמה מדעת בכתב לאיסוף כל הדגימות התקבלה לפני הניתוח, והניסויים בוצעו על פי קוד האתיקה של האיגוד הרפואי העולמי (הצהרת הלסינקי). כל הסעיפים של פרוטוקול המחקר אושרו על ידי המוסד לביקורת מוסדית של מסצ 'וסטס עין ואוזן ובית החולים הכללי של מסצ' וסטס.
הערה: סעיפים 1-7 להלן מתוכננים להתבצע ברצף עם קבלת מדגם VS ראשוני או מדגם GAN מחדר הניתוח. עיבוד צריך תמיד להתחיל עם סעיף 1. אז, ככלל, RNA צריך להישמר הראשון (סעיף 2), ואחריו הכנת רקמות עבור אוסף של הפרשות (סעיף 3) ומיצוי חלבון (סעיף 4). רקמה להיות מתורבת (סעיף 5 עבור VS, סעיף 6 עבור GAN) יכול לשבת בינוני תרבות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תאים אנושיים VS ראשוני בתרבות, כפי שנקבע בסעיף 5, ניתן להתייחס כמודלים אינפורמטיבי עבור תהליכים הקשורים המחלה ביישומים מחקר במורד רבים ( איור 1 ). תאים בריאים Schwann מתורבת בסעיף 6 לספק נקודה ישירה ומאלפת של השוואה. כפי שמתואר להלן, נתונים נרחבים של VSs ו- GANs שעובדו על פי מסגרת מתודולוגית אחידה זו זמינים במספר מאמרים שפורסמו בעבר 12 , 13 ,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כתב יד זה מתאר מסגרת מתודולוגית אחידה למחקר VS, המתאר את העיבוד בו-זמני של דגימות VS ו- GAN אנושיים עבור יישומי מחקר במורד הזרם. כאשר מחקר VS נכנס לרפואה מדויקת, הכנת המדגם אותו בצורות המסוגלות לענות על שאלות מחקר רבות תאפשר גילוי של תובנות מולקולריות, תאיות, גנטיות ופרוטומטיות ספציפיות לחולים בודדים.
הטוהר של תא שוואן האנושי ותרבויות VS הוערכו ביסודיות לאורך זמן באמצעות אימונוציטוכימיה, תוך שימוש ביחס של תאים חי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של חירשות הפרעות תקשורת אחרות מעניקה R01DC015824 (KMS) ו T32DC00038 (תמיכה JES ו SD), משרד הביטחון מענק W81XWH-14-1-0091 (KMS), קרן ברטרלי (KMS) , Nancy Sayles Day Foundation (KMS), מרכז המחקר לאואר טיניטוס (KMS) וקרן בארנס (KMS).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 מ"מ #1 354087 כיסוי זכוכית גרמנית | קורנינג | או הכינו כיסויים עם קורנינג למינין (CB-40232) ו-Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) | |
| צינורות צנטריפוגה CELLSTAR 15 מ"ל, תחתית חרוטית, סיום לימודים, | גריינר סטרילי Bio-One | 188161 | |
| צינורות צנטריפוגה CELLSTAR 50 מ"ל, תחתית חרוטית, סיום לימודים, | גריינר סטרילי Bio-One | 227261 | |
| צלחת תרבית תאים CELLSTAR, 60 מ"מ | גריינר ביו-וואן | 628160 | |
| קולגנאז מ-Clostridium histolyticum, | סיגמא-אולדריץ | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, | קורנינג | 3526 | |
| DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט, ללא גלוטמין, 500 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 מלקחיים, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | חיטוי לפני השימוש |
| Dumont #5 מלקחיים, קצה סטנדרטי, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | אוטוקלאב לפני השימוש |
| סרום בקר עוברי, מוסמך, אזורים מאושרים על ידי USDA, 500 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot בצינורות של 50 מ"ל ומאחסנים ב-20° מקפיא C |
| Hyaluronidase מאשכי בקר, סוג I-S, אבקת ליופיליזציה | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP יחידת מסנן מזרק, 0.22 ומיקרו; m, פוליאתרסולפון, 33 מ"מ, | סטרילי EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, דרגת ריאגנט, | סיגמא-אולדריץ' | P6148 | לפני השימוש: קבע נהלי הפעלה סטנדרטיים המבוססים על פרוטוקולים זמינים באינטרנט |
| PBS, pH 7.4, 500 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | אוטוקלאב לפני השימוש |
| בפניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL), 100 מ"ל | תרמו פישר סיינטיפיק | 15140-122 | |
| טבליות מעכב פוספטאז PhosSTOP טבליות מעכב | פרוטאז Roche | 04906845001 | |
| Pierce | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| קצות פיפטות ופיפטות, 5/10/25 מ"ל | משתנה | ||
| פלסטיק הומוגניזציה עבור 1.5/2.0 מ"ל מיקרו-צינורות | E& K Scientific | EK-10539 | |
| מחטי PrecisionGlide, 27 גרם x 1 1/2 | ב-BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (תמיסת ייצוב RNA) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה, פוליפרופילן, 0.5 מ"ל | Eppendorf | 022363719 | חיטוי לפני השימוש |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה, פוליפרופילן, 1.5 מ"ל | אפנדורף | 022363204 | חיטוי לפני השימוש |
| מי מלח - 0.9% הזרקת נתרן כלורי, בקטריוסטטי, 20 מ"ל | Hospira | 0409-1966-05 | |
| להבי אזמל - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht צינור יניקה 24 מד | Bausch + Lomb | N1698 42 | שימושי לגישה הכירורגית (בנוסף למכשירים כירורגיים אוטולוגיים נפוצים) ולמשל סמן כירורגי כחול |
| מיכל דגימה, או סטרילי, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C מיקרוסקופ סטריאו | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| שילוב מזרק/מחט, קצה Luer-Lok, 5 מ"ל, 22 גרם x 1 אינץ'. | מזרק | 309630 | |
| בלבד, קצה החלקה, 1 מ"ל | BD | 309659 | |
| מזרק טוברקולין בלבד, קצה החלקה, 3 מ"ל | BD | 309656 | |
| הומוגנייזר אולטראסוני, סדרת 4710, בדיקה CV18 | Cole-Parmer | CP25013 |
מקורות
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and manage....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
