הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מסגרת מתודולוגית מאוחדת למחקר שוואנומה שיווי המשקל

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55827

⸱

20 ביוני 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

המטרה של פרוטוקול זה הוא מתאר את אוסף ועיבוד של דגימות כירורגיות אנושיות עבור יישומים במורד הזרם רבים schwannoma שיווי המשקל מחקר שוואן התא.

תקציר

Schwannomas שיווי המשקל הם neoplasms הנפוצים ביותר של זווית cerebellopontine, מה שהופך את 6-8% אחוז של כל גדיולים תוך גולגולתיים. למרות שגידולים אלה גורמים לאובדן שמיעה חושי עד ל -95% מהנפגעים, המנגנונים המולקולריים שבבסיס אובדן השמיעה נותרים חמקמקים. מאמר זה מתאר את הצעדים שנקבעו במעבדה שלנו כדי להקל על איסוף ועיבוד של דגימות רקמות אדם שונות עבור יישומים במורד הזרם מחקר אינטגרלי ללימוד שוואנומות שיווי המשקל. באופן ספציפי, עבודה זו מתארת ​​מסגרת מתודולוגית אחידה לאיסוף, לעיבוד ולתרבות של שוואן ותאי שוואנומה מדגימות כירורגיות. זה משולב עם צעדים עיבוד מקבילים שנחשבים כיום חיוניים למחקר הנוכחי: אוסף של גידול הפרשות העצבים, שימור של רנ"א והפקת חלבון מ רקמות שנאספו, קיבוע של הרקמה להכנת סעיפים,ד את החשיפה של תאים אנושיים ראשוניים כדי adeno הקשורים וירוסים ליישום על טיפול גנטי. בנוסף לכך, עבודה זו מדגישה את הגישה התיראבינארית-כירורגית לאיסוף גידול זה כהזדמנות ייחודית להשגת אפיתל חושי אנושי מהאוזן הפנימית ומהפרילימף. טיפים לשיפור האיכות הניסיונית מסופקים ומלכודות נפוצות מודגשות.

מבוא

שוונומות שיווי המשקל (VS) הן הנפוצים ביותר של זווית cerebellopontine, מאובחנים 1 בכל 100,000 אנשים. אם כי לא גרורות, גידולים אלה משפיעים קשות על איכות החיים של המטופל 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . אנשים נפגעים בדרך כלל לחיות עם אובדן שמיעה, טינטון, ותחושה של מלאות aural. התסמינים הופכים יותר ויותר מתישים ככל הגידול גדל, גרימת בעיות איזון, שיתוק בפנים, ואת הליקוי של תפקודים עצביים גולגולתיים אחרים. סיבוכים מסכני חיים עקב דחיסת גזע המוח עשויים גם להתרחש 7 .

אפשרויות ניהול עבור VS מוגבלים בעיקר ממתין מחכה לגידולים סטטיים ו הקרנות סטריאוטקטיות או כריתה כירורגית לגידול גידולים 8. הסרה כירורגית של גידולים אלה בבתי חולים המזוהים עם מחקר מציעה הזדמנות לרכוש ולנתח רקמות סרטניות חדשות שנאספו במהלך ניתוחים לחולים. גישה כירורגית ספציפית ל VS, הניתוח של translabyrinthine, יכולה אף להציע גישה לאפיתל סנסורי אנושי חשוב מהאוזן הפנימית ומהפרילימף.

מכיוון ש - VSs נובעים מעצב חושי היקפי ( כלומר, עצב שיווי המשקל), חשוב להשוות בין תצפיות הקשורות ל - VS לבין אלו הנובעות מעצב בקרה מתאים, כגון עצב האאוריקולרי האנושי (GAN). גנים בריאים הם מקריבים באופן קבוע במהלך parotidectomies או חתכים הצוואר והוא יכול לשמש מודלים חזקים לבריאות פיזיולוגית התא Schwann 9 .

מאחר שאין תרופות המאושרות על ידי ה- FDA לטיפול או למניעת VS סדיר, חיוני שחוקרים יבהירו את המולה המולקולרית הבסיסיתNisms של המחלה כדי לזהות מטרות טיפוליות. חלבונים אשר הוכיחו כי הם ממלאים תפקיד בפתוגנזה של VS כוללים את המארלין, גורם הגדילה האנדותל של כלי הדם (VEGF), cyclooxygenase 2 (COX-2), גורם גרעיני kappa B (NF-κB), גורם נמק בגידול אלפא (TNF-alpha) , קולטן גורם גדילה של אפידרמיס (EGFR), ומולקולות איתות קשורות 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

ההתקדמות האחרונות הרחיבו ושיפרו פרוטוקולים לאיסוף, עיבוד, תרבות, ומחקר במורד הזרם של schwannomas וסטיבולרי ראשוני האדם ורקמות עצב בריא 18 , 19 . עם זאת, רוב הפרוטוקולים הקיימים נועדו להתאים את הכנהAtion של רקמות כאלה עבור יישום מחקר במורד אחד ( כלומר, תרבות התא לבד). מאמר זה מציג מסגרת מתודולוגית מאוחדת לעיבוד סימולטני של מדגם VS ראשוני יחיד או מדגם GAN ליישומים רבים במורד הזרם: סוג תא ספציפי תרבות, מיצוי חלבונים, שימור רנ"א, אוסף הפרשת הגידול וקיבוע רקמות. עבודה זו גם מפרטת את האוסף הכירורגי ואת העיבוד של נוזל המוח השדרה האנושי (CSF) ו perlymph במהלך כריתת VSS translanabyrinthine, כמו אלה רקמות הקשורות קשר הדוק עשוי לשמש מקורות חשובים של סמנים ביולוגיים עבור VS. לבסוף, פרוטוקול זה מציג שלבים התמרה ויראלי של תאים VS האדם העיקרי בתרבות כמו יישום חדשני של רקמה זו לשימוש בטיפול גנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הסכמה מדעת בכתב לאיסוף כל הדגימות התקבלה לפני הניתוח, והניסויים בוצעו על פי קוד האתיקה של האיגוד הרפואי העולמי (הצהרת הלסינקי). כל הסעיפים של פרוטוקול המחקר אושרו על ידי המוסד לביקורת מוסדית של מסצ 'וסטס עין ואוזן ובית החולים הכללי של מסצ' וסטס.

הערה: סעיפים 1-7 להלן מתוכננים להתבצע ברצף עם קבלת מדגם VS ראשוני או מדגם GAN מחדר הניתוח. עיבוד צריך תמיד להתחיל עם סעיף 1. אז, ככלל, RNA צריך להישמר הראשון (סעיף 2), ואחריו הכנת רקמות עבור אוסף של הפרשות (סעיף 3) ומיצוי חלבון (סעיף 4). רקמה להיות מתורבת (סעיף 5 עבור VS, סעיף 6 עבור GAN) יכול לשבת בינוני תרבות להשלים תוך סעיפים 2, 3, 4 מבוצעות. קיבוע הרקמה לקטע (סעיף 7) קצר מאוד ו- cיבוצע במהלך כל צעד צנטריפוגה. סעיף 8 (עיבוד perilemph) וסעיף 9 (עיבוד CSF) יכול להתבצע עם קבלת perilymph או CSF מחדר הניתוח במהלך כריתה VS translransrinthine. סעיף 10 (התמרה ויראלי) יכול להתבצע על גידול VS או תאים Schwann בתרבות.

1. הכנה וקבלת מדגם כירורגי

הערה: השלבים הבאים הם להתבצע בסביבה סטרילית, כגון ברדס תרבות רקמה או מכסה המנוע זרימה למינרית. היכרות עם טכניקה סטרילית בסיסית צפויה.

  1. הכנת בינוני VS האדם העיקרי או תרבות שוואן התא
    1. ההפשרה 50 מ"ל aliquot של בסרום שור העובר קפוא (FBS) ב 37 מעלות צלזיוס אמבטיה.
    2. הוסף 5 מ"ל של תערובת פניצילין / סטרפטומיצין לבקבוק 500 מ"ל של DMEM / F-12, וכתוצאה מכך דילול הסופי של 1: 100.
    3. מוסיפים את 50 מ"ל של FBS מופשר בקבוק 500 מ"ל של DMEM / F-12,וכתוצאה מכך דילול סופי של 1:10.
    4. לכתוב את התאריך, ראשי תיבות של מחקר, וכן מידע משלים ( למשל, 1% P / S, 10% FBS) על הבקבוק.
    5. מניחים את המדיום תרבות חדשה במקרר (4 ° C).
  2. קבלה וטיהור מדגם VS או GAN
    1. בחדר הניתוח, במקום מדגם VS שנקטפו או GAN טרי לתוך מלוחים סטרילית במיכל הדגימה. תחבורה המדגם על הקרח מחדר הניתוח כדי מכסה המנוע זרימה למינרית במעבדה.
      הערה: גודל הדגימה והמשקל משתנה באופן מובהק בין החולים על פי גודל הגידול הרלוונטי או כמות העצבים המבוטלים.
    2. הסר aliquots פתרון המניות של hyaluronidase (25,000 U / mL) ו collagenase (3,200 U / מ"ל) מן המקפיא ולתת האנזימים להפשיר בטמפרטורת החדר (נדרש עבור שלב 5.1.4 או 6.1.6, תלוי אם הדגימה היא VS או GAN).
      הערה: resuspension של אנזימים lyophilized iS המתואר בפירוט על גיליונות מידע המוצר. Collagenase ניתן resuspended ב כל סידן ללא פתרון מאוזן מלח ו hyaluronidase בפתרון של 0.02 M חיץ פוספט (pH 7.0), 77 מ"מ NaCl, ו 0.01% של 1 מ"ג / מ"ל ​​אלבומין בסרום שור. הפעילות הספציפית עבור כל אנזים lyophilized משתנה עם הרבה צריך להיות מאומת לפני resuspension.
    3. באמצעות סדרה של שלוש צינורות 1.5 מ"ל מלא 1.4 מ"ל של 1x PBS סטרילית, לשטוף את VS או גאן דגימה שלוש פעמים. בזהירות להעביר את הדגימה מצינור צינור עם מלקחיים סטרילית. סגור כל צינור פעם הוא מכיל את הדגימה, ולנער בעדינות כדי לשטוף.
      הערה: כדי למנוע הצפה של צינורות 1.5 מ"ל, פחות מ 1.4 מ"ל של PBS ניתן להשתמש לכל צינור אם חתיכת הגידול גדול.
    4. שים את המדגם לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ יבש ולהשתמש מלקחיים כדי להסיר את כל הרקמה המתה ( כלומר, מנות צרוב, אשר בדרך כלל לבן או אטום צבע) ואזורים עם כלי דם בולטים.
    5. השתמש ב- fOrceps או להב סכין מנת לחלק את המדגם לחתיכות נפרדות לשימור RNA, מיצוי חלבון, אוסף הפרשות, קיבעון, תרבות התא (ראה סעיפים 2 - 6, להלן).
    6. מעבירים את פיסת הדגימה המיועדת לתרבות תאים (סעיף 5/6) חדש 60 מ"מ צלחת תרבות המכיל 5-8 מ"ל של קר, בתוספת DMEM / F-12 בינוני (לחלופין, המכסה של צלחת התרבות הראשונה יכולה להיות משמש בשלב זה).
      הערה: כמות DMEM / F-12 בינוני צורך (משלב 1.1) יהיה תלוי בגודל של הגידול או עצב, אבל זה צריך ליפול בין 5 ל 8 מ"ל. חתיכת זה יכול לשבת בינוני תרבות תוך השלבים הבאים מבוצעות.

2. שימור RNA של VS ו- GAN רקמת (תקף גם עבור אפיתל חושי האדם)

  1. מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית, להעביר 1-1.2 מ"ל של פתרון ייצוב RNA לצינור 1.5 מ"ל חדש.
  2. לאחר שטיפת הדגימה עם PBS (שלב 1.2.3), לטבול קלות את העוגה קטנהCE של רקמות המיועדים לשימור RNA (כ 3 מ"מ 3 של VS או 5 מ"מ אורך של GAN) לתוך הפתרון ייצוב ייצוב. ודא כי הדגימה הוא שקוע לחלוטין הפתרון.
  3. הכן תווית צינור 1.5 מ"ל חדש. אחזר את הדגימה מן הפתרון ייצוב רנ"א, להעביר אותו לצינור החדש, ולאחסן אותו במקפיא -80 מעלות צלזיוס.

3. אוסף ההפרשות VS ו- GAN

  1. יום 1
    1. לאחר שטיפת הדגימה עם PBS (שלב 1.2.3), מניחים את חתיכת VS או GAN המיועד לאיסוף של הפרשות לתוך צינור ריק 1.5 מ"ל.
    2. הכן שתי צינורות 1.5 מ"ל נוספים פיפטה 500 μL של DMEM (לא בתוספת FBS) לתוך כל צינור.
      הערה: הצינור הראשון של DMEM ישמש לאסוף את הפרשות הגידול, ואת הצינור השני של DMEM ישמש כבקרה מתאימה. הפרשות ניתן לאסוף DMEM, כל בינוני תרבות טיפוסי אחר לאבתוספת סרום, או PBS.
    3. מקום אחד של DMEM המכילים צינורות על קנה מידה דיגיטלי מכויל. טרה את קנה המידה, כך שכאשר הצינור יושב על גבי הסולם, הוא קורא 0 מ"ג.
    4. הסר את הצינור של DMEM מן קנה המידה, במקום חתיכת הדגימה המיועדת אוסף של הפרשות לתוך הצינור, ולשקול אותו. הערה התוצאה, אשר מייצג את המשקל של הרקמה לבד.
    5. מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית, להתאים את עוצמת הקול של DMEM בצינור 100 μL לכל 10 מ"ג של הדגימה.
    6. מניחים את הצינור המכיל את דגימה רקמה ואת השליטה המותאמת שלה (DMEM לבד) לתוך חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) לתקופה בקנה אחד עם התוכניות לניסוי זה. דגירה הרקמה של לפחות 72 שעות כדי לאסוף כמויות שימושיות ביולוגית של הפרשה או עצבים 15 .
  2. יום 4
    1. לאחר הדגירה 72 שעות, להסיר את המדיום המכיל הפרשת מןהדגימה ( כלומר, בינוני מותנה רקמות) באמצעות פיפטה 1 מ"ל. כדי למנוע חוזרים חוזרים להקפיא הפשרה, aliquot המדיום לתוך צינורות חדשים על פי ניתוח במורד מתוכנן ( למשל, כדי להפעיל ELISA עם 4 בארות המחייבים 50 μL כל, aliquots של μL 210 יכול להיות מוכן).
    2. אם נדרש, להקפיא את חתיכת רקמות שנותרו הצינור המקורי (כבר שכותרתו ביום 1) ב -80 מעלות צלזיוס לניתוחים נוספים, כגון מיצוי DNA, במועד מאוחר יותר.
    3. אחסן את הרקמה, הפרשות, ובקרה DMEM במקפיא -80 ° C עד היישומים במורד הזרם הם יזמו ( למשל, ELISAs, LC-MS / MS, מערכים ציטוקינים, וכו ' ).

4. חלבון מיצוי VS או רקמת GAN

  1. הכנת חיץ RIPA מבוצר
    1. הוסף טבליה אחת של מעכב phosphatase וטבליה אחת של מעכב פרוטאז ל 10 מ"ל של חיץ RIPA בצינור 15 מ"ל; זה מבוצרחיץ RIPA.
      הערה: אחסן את המאגר RIPA ב 4 ° C והוסף את הלוחות רק לפני השימוש.
  2. חלבון מיצוי
    1. העברת 210 μL של חיץ RIPA מבוצר (שלב 4.1.1) לצינור 1.5 מ"ל חדש.
    2. לאחר שטיפת הדגימה עם PBS (שלב 1.2.3), להעביר את פיסת רקמה קטנה המיועדת לחלץ חלבון (כ 3 מ"מ 3 של VS או 5 מ"מ אורך של GAN) כדי RIPA מאגר המכיל מאגר ולהניח אותו על הקרח לפחות 10 דקות. אם בוחנים צורות phosphorylated של חלבונים, להשלים את המאגר RIPA עם מעכבי פרוטאז ו phosphatase 14 . בינתיים, צעדים עבור רכיבים אחרים של עיבוד רקמות, כגון קיבוע (סעיף 7), ניתן לבצע.
    3. מראש מגניב צנטריפוגה ל 4 מעלות צלזיוס.
    4. באמצעות עלי פלסטיק, homogenize הרקמה בצינור המכיל RIPA המכיל. Sonicate הרקמה של 10-15 s משרעת 20%. ודא כי הדגימהנשאר על הקרח, אפילו במהלך sonication.
    5. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב XG 15,000 ו 4 ° C.
    6. Aliquot supernatant ב 50 מדרגות μL לתוך צינורות 0.5 מ"ל חדש (בהתאם ליישומי במורד המיועד, כל גודל תוספת ניתן לבחור).
    7. חנות aliquots של lysate חלבון במקפיא -80 ° C עד היישומים במורד הזרם הם יזמו ( למשל, ELISAs או כתמים המערבי) 20 , 21 .

5. האדם העיקרי VS תרבות

  1. יום 1
    1. הפרד את הרקמה VS המיועד לתרבית תאים (אשר כבר יושב בינוני תרבות, כמתואר בשלב 1.2.6) לתוך כ 1 מ"מ 3 חתיכות באמצעות זוג מלקחיים בכל יד.
    2. לשאוב את המדיום המכיל חתיכת גידול עם פיפטה סרולוגית 10 מ"ל ולהעביר את כל התוכן צינור 15 חרוטי מ"ל.
    3. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב1,000 x 25 ° C.
    4. הכן בינוני התפרקות חדשה צלחת 60 מ"מ תרבות על ידי שילוב של 4.7 מ"ל של מדיום DMEM / F-12 בתוספת 250 μL של collagenase (ריכוז סופי: 160 U / מ"ל) ו 50 μL של hyaluronidase (ריכוז סופי: 250 U / mL) , עבור נפח סופי של 5 מ"ל.
      הערה: שני האנזימים צריך להיות מאוחסן במקפיא -20 מעלות צלזיוס, אבל מופשר לקראת ההכנה של המדיום הזה (שלב 1.2.2).
    5. לאחר צנטריפוגה, חתיכות הגידול יהוו גלולה בחלק התחתון של צינור חרוטי. בזהירות פיפטה לבטל להשליך supernatant.
    6. מוסיפים 2 מ"ל של המדיום התפורר טרי המכיל אנזים (שלב 5.1.4) כדי גלולה הגידול. פיפטה מעלה ומטה כמה פעמים כדי לגייס את הרקמה ולהעביר את הגידול המכיל בינוני כדי צלחת 60 מ"מ תרבות.
    7. מניחים את צלחת תרבות לתוך חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) במשך 18 שעות.
  2. יום 2
    1. חם DMEM / F-12 בינוני בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין (מוכן בשלב 1.1) ב 37 ° C אמבט מים.
    2. הסר את צלחת פטרי המכיל את התרבות VS מן האינקובטור (שלב 5.1.7). באמצעות מחט 22 G המצורפת מזרק 6 מ"ל, לשאוב את המדיום המכיל תרבות ולהעביר אותו צינור חדש חרוטי 15 מ"ל.
    3. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 37 ° C.
    4. בינתיים, להשתמש מלקחיים סטרילית למקום את המספר הדרוש של poly-D- ליזין ו- laminin מצופה coverslips זכוכית לצלחת תרבות 24 גם.
      הערה: מספר בארות להיות מתורבת תלוי בגודל של הדגימה; כ-24-32 בארות יכול להיות מתורבת מגידול 1 ס"מ 3 , ולכן עבור גידולים קטנים יותר, תכנון 8-16 בארות של תאים בתרבית מתאים.
    5. לאחר צנטריפוגה, להשמיד את supernatant ( כלומר, בינוני מועשר אנזים) ו resuspend גלולה תא שיורית טריים, בתוספת DMEM / F-12 בינוני, מראש חמיםEd בשלב 5.2.1.
      הערה: נפח שבו resuspend גלולה נקבעת על ידי מספר הבארות המתוכנן בשלב 5.2.4, להערכת 1 מ"ל של מדיום לכל מתוכנן היטב.
    6. לשאוב 2 מ"ל של המדיום התא resuspended (שלב 5.2.5) באמצעות פיפטה סטרולוגית 5 מ"ל. הפקדה 1 מ"ל של המדיום המכיל תאים סרטניים לתוך כל מוכן היטב של צלחת 24 גם.
    7. המשך השאיפה והפקדת בינוני המכיל תא גידול (aspirating במרווחים של 2 מ"ל, שממנו 1 מ"ל מופקד לתוך כל באר מתוכננת) עד ההשעיה תא הגידול מחולק באופן שווה בין כל בארות מוכן.
    8. מניחים את הצלחת 24-היטב לתוך 37 ° C חממה לילה.
  3. יום 3
    1. אם פסולת משמעותית הוא ציין על החלק התחתון של הבארות, בזהירות לשנות את המדיום בכל טוב כדי להשלים DMEM / F-12 בינוני תרבות, נזהר לא לעקור תאים חסיד. אם לא, להחזיר את הצלחת לחממה ולשנות thמדיום בפעם הראשונה ביום 5.
  4. ימים 5-7 ולאחר מכן
    1. שנה את המדיום כל 3 ימים.
      הערה: בתאי VS ראשוניים וגנים נשמרים בדרך כלל בתרבות עד לשימושם ביישומים במורד הזרם, בסביבות 14 יום של גיל. הטוהר תרבות פוחתת לאחר 19 זה.

6. התרבות האנושית העיקרית GAN

  1. יום 1
    1. תחת מיקרוסקופ לנתח, לבודד את הקשקשים מן הרקמה המיועדת לתרבות GAN (אשר ישבה במדיום התרבות, כפי שתואר בשלב 1.2.6).
      1. לבודד את fascicles מן epineurium ו נדן סיבי ידי משיכת perineurium באמצעות לא. 5 מלקחיים תוך הידוק epineurium עם לא. 3 מלקחיים.
    2. לאחר fascicles מבודדים מספיק מן epineurium סביב, להעביר אותם למאכל תרבות חדשה המכילה 2 מ"ל של sup טריבינוני.
    3. חותכים את fascicles לתוך 1 מ"מ חלקים 2 מ"מ באמצעות להב סכין מנתחים.
    4. פיפטה חתיכות קטנות fascicle ואת המדיום המקיף לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל של המדיום תרבות טרי משלים, כך הנפח הכולל של צינור 15 מ"ל הופך 5 מ"ל.
    5. צנטריפוגה הדגימה במשך 3 דקות ב 1000 xg ו 25 ° C.
    6. בינתיים, להפוך בינוני תרבית שוואן תרבות חדשה צלחת פטרי 60 מ"מ על ידי שילוב של 4.7 מ"ל של בתוספת DMEM / F-12 בינוני, 250 μL של collagenase, ו 50 μL של hyaluronidase, עבור נפח סופי של 5 מ"ל.
      הערה: חנות שני אנזימים ב -20 מעלות צלזיוס; להפשיר אותם בטמפרטורת החדר לפני הכנת בינוני זה (שלב 1.2.2).
    7. לאחר צנטריפוגה של הדגימה, את fascicles יהיה להתעבות לתוך גלולה קטנה בצינור חרוטי. מחק את supernatant.
    8. מוסיפים 2 מ"ל של המדיום התפורר טרי המכיל אנזים (שלב 6.1.6) כדי גלולה עצב. פיפטה למעלה דעצמו כמה פעמים כדי לגייס את הרקמה ולהעביר אותו צלחת 60 מ"מ תרבות חדשה.
    9. צלחת מקום באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) במשך 20-22 שעות.
      הערה: זהו דגירה ארוכה יותר מהנדרש עבור דגימות VS (שלב 5.1.7).
  2. יום 2
    1. חם בתוספת DMEM / F-12 בינוני באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    2. באמצעות מחט 22 G המצורפת מזרק 6 מ"ל, לשאוב את התרבות המכיל בינוני בתא ולהעביר אותו צינור חדש חרוטי 15 מ"ל.
    3. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 37 ° C.
    4. מחק supernatant ו resuspend המדגם חדש, מראש חימם, בתוספת DMEM / F-12 בינוני תרבות.
    5. השתמש מלקחיים סטרילית למקם את המספר הנדרש של coverslips מצופה לתוך הבארות של צלחת 24 תרבות גם.
      הערה: חישוב שתי בארות של תאים בתרבית לכל 1 ס"מ דגימה עצבית מקדם צמיחה תרבותית חזקה.
    6. הוסף 1 מ"ל של המדיום המכיל תרבות לכל אחדהמיועד היטב בצלחת 24 גם.
    7. מניחים את הצלחת 24-היטב לתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 .
  3. יום 3
    1. אם פסולת משמעותית צוין בארות, בזהירות להחליף את המדיום עם בינוני חדש DMEM / F-12 תרבות, נזהר לא לעקור תאים חסיד. אם לא, להחזיר את הצלחת לחממה ולשנות את המדיום בפעם הראשונה ביום 5.
  4. ימים 5-7 ולאחר מכן
    1. שנה את המדיום כל 3 ימים.

7. VS & GAN תיקון קיבוע

  1. פיפטה 1-1.2 מ"ל של paraformaldehyde 4% (PFA; זהירות) לתוך צינור 1.5 מ"ל חדש.
  2. לאחר שטיפת הגידול או עצב עם PBS (שלב 1.2.3), להעביר פיסת רקמה קטנה (כ 3 מ"מ 3 של VS או 5 מ"מ אורך של GAN) לתוך PFA 4% ומניחים את הצינור על שייקר ב 4 ° C ודא כי הדגימה שקוע לחלוטין tהוא פתרון.
  3. לאחר לפחות 2 שעות של קיבוע, לאחזר את הצינור מן שייקר ולהמשיך עם עיבוד נוסף ( למשל, הטבעה פרפין או אופטימלית חיתוך מתחם הטמפרטורה (אוקטובר) עבור אימונוהיסטוכימיה לאחר מכן או immunofluorescence) 22 , 23 , 24 . לחלופין, הרקמה יכולה להיות הצמד קפוא, כפי שתואר לעיל 25 , 26 .

8. איסוף ואחסון של פרילימף אנושי במהלך Transabyrinthine VS כריתה

  1. במקום שלושה צינורות סטרילי 1.5 מ"ל על הקרח.
    הערה: צינור אחד יישמר כגיבוי במקרה של זיהום.
  2. מילוי צינור 1.5 מ"ל עם כ 1.2 מ"ל של פתרון PBS כי כבר מסוננים פעמיים באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
    הערה: כדי לאסוף perlymmph במהלך כריתת VS translransrinthine, המנתח חייב קודם כל להבטיח את הניתוחשדה קל הוא ללא אבק עצם, דם או מלוחים. המנתח יכול להשתמש בצינור 21 או 24 יניקה של שוקנצ'ט ביד הלא דומיננטית למטרה זו.
    מקום טיפוסי שממנו ניתן לחלץ perlymphph היא תעלה semicircular לרוחב (עם זאת, תעלה semicircular האחורי או קרום חלון עגול ניתן לגשת גם, בהתאם העדפה של המנתח). המנתח צריך להסיר בזהירות את העצם labyrinthine עם בור יהלום (תוך שימוש השקיה יניקה רציפה) כדי לזהות את הקו הכחול ( כלומר, המבוך הממברני) של התעלה semicircular. התעלה semicircular הוא חדר דרך הקו הכחול באמצעות מחט 27 G ארוך המצורפת מזרק 1 מ"ל tuberculin.
  3. שאל את המנתח בעדינות לשאוב כמות קטנה של perilymph ולאחר מכן להעביר את המזרק ואת המחט המצורפת לאחות כירורגית.
    הערה: בדרך כלל, טיפה של perilemph או פחות נאסף. אם נפח שנצפה הוא גדול יותר, המדגם צפוי מזוהם עם אחרים f.
  4. פתח את הצינור מוכן, 1.5 מ"ל ריק ואת הצינור מלא PBS ישירות לפני השימוש. היזהר לא לגעת בפנים המכסים של הצינור בעת פתיחתם.
  5. לקבל את המזרק ואת המחט המצורפת מן האחות כירורגית לטהר את הנוזל לחלוטין לתוך הצינור ריק, נזהר לא לגעת בצינור עצמו עם המחט.
  6. בזהירות לנתק את המחט מן המזרק. אין לזהם את קצה המחט, ולהמשיך להחזיק אותו ביד אחת.
    הערה: נפח קטן מאוד של perilemph נאסף, כך נוזל מסוימים עשויים להישאר בקצה הארוך של המחט.
  7. עם היד השנייה, להשתמש במזרק עצמו (ללא המחט) למצוץ 0.2 מ"ל של תמיסת PBS מסוננים מן הצינור מוכן לתוך הגוף של המזרק.
  8. חבר מחדש את המחט למזרק. לגמרי לפנות את המזרק לתוך הצינור המכיל perilemph, באמצעות PBS סטרילית לשטוף את קצה המחט.
  9. סגור את הצינור perilymph ו- PBS המכילים ומקום זה על קרח.
  10. להשליך את המחט במיכל חדים.
  11. מניחים את הצינור המכיל perilemph במקפיא -80 מעלות צלזיוס בהקדם האפשרי.

9. איסוף ואחסון של CSF האדם

  1. מקום שלושה (או יותר) סטרילי 1.5 צינורות מ"ל על הקרח.
    הערה: צינור אחד יהיה גיבוי במקרה של זיהום או נפח המדגם כי הוא גדול מהצפוי.
  2. לאחר פתיחת דורה מאטר, לשאול את המנתח לאסוף CSF עם מזרק 3 מ"ל (ללא מחט המצורפת).
    הערה: כדי למנוע זיהום, אוסף CSF צריך להתבצע מיד לאחר פתיחת דורה מאטר.
  3. שאל את המנתח למסור את המזרק לאחות כירורגית.
  4. לקבל את המזרק מן האחות כירורגית לחלוטין לפנות את נפח הנדרש של CSF לתוך הצינור (ים).
  5. סגור את הצינור (ים) ומניחים אותם על הקרח.
  6. מניחים את הצינור (ים) במקפיא -80 ° C בהקדם האפשרי.
E "> 10. ניסויים התמרה ויראלי עבור תאים VS העיקרי

  1. באמצעות ריכוז המניות ויראלי כנקודת התייחסות, לחשב את מספר הגנום הרצוי (gc) מספר ריבוי של זיהום (משרד הפנים) הדרושים לניסוי התמרה המוצע; מלאי וירוס יכול להיות מדולל ישירות לתוך המדיום תרבות הוסיף.
    הערה: כל וקטור ויראלי מתאים התמרה התא העיקרי ניתן להשתמש; ראה Landegger et al. (2017) עבור השוואה מפורטת של שישה שונים adeno הקשורים וירוס סרוטיפים 27 . בנוסף, כאשר culturing תאים ראשוניים האדם, ספירת תאים אינם נקבעים בדרך כלל לפני ציפוי על coverslips. תאים VS ראשוני לא מגיבים היטב כדי trypsinization ו passaging, ולכן עבור חישוב אמין משרד הפנים, מספר תאים חסיד לכל טוב ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ בניגוד שלב. לחלופין, אם התאים קרובים מפגש, מספרים שלהם ניתן לאמוד באופן מהימן באמצעות ערכי צפיפות תאים רגילה עבורצלחת 24 גם ( למשל, 5 x 10 4 תאים לכל טוב).
  2. מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית, להכין בינוני נוסף המכיל את הסכום הרצוי של וירוס בצינור מעבדה חרוטי 15 מ"ל, כך 1 מ"ל של המדיום המכיל וירוס מוכן לכל טוב של תאים להיות transduced. פיפטה וירוס המכיל בינוני למעלה ולמטה כדי לערבב בעדינות אבל ביסודיות.
  3. באמצעות מלקחיים סטרילית, להעביר את coverslips המכילים תאים VS העיקרי (צעד 5.2.8) מן הצלחת 24-היטב המקורי לצלחת חדשה 24 גם. לאחר העברת כל coverslip הפרט, להוסיף 1 מ"ל של בינוני המכיל וירוסים. מערבולת את הצלחת בכל פעם מדיום נוסף על מנת להבטיח כי התאים מצופים באופן שווה עם הנגיף.
  4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס 5% CO2 למשך הניסוי המתוכנן.
    הערה: דגירות הנעים בין 48-120 שעות הראו כל תוצאות התמרה מבטיח 27 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תאים אנושיים VS ראשוני בתרבות, כפי שנקבע בסעיף 5, ניתן להתייחס כמודלים אינפורמטיבי עבור תהליכים הקשורים המחלה ביישומים מחקר במורד רבים ( איור 1 ). תאים בריאים Schwann מתורבת בסעיף 6 לספק נקודה ישירה ומאלפת של השוואה. כפי שמתואר להלן, נתונים נרחבים של VSs ו- GANs שעובדו על פי מסגרת מתודולוגית אחידה זו זמינים במספר מאמרים שפורסמו בעבר 12 , 13 ,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כתב יד זה מתאר מסגרת מתודולוגית אחידה למחקר VS, המתאר את העיבוד בו-זמני של דגימות VS ו- GAN אנושיים עבור יישומי מחקר במורד הזרם. כאשר מחקר VS נכנס לרפואה מדויקת, הכנת המדגם אותו בצורות המסוגלות לענות על שאלות מחקר רבות תאפשר גילוי של תובנות מולקולריות, תאיות, גנטיות ופרוטומטיות ספציפיות לחולים בודדים.

הטוהר של תא שוואן האנושי ותרבויות VS הוערכו ביסודיות לאורך זמן באמצעות אימונוציטוכימיה, תוך שימוש ביחס של תאים חי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של חירשות הפרעות תקשורת אחרות מעניקה R01DC015824 (KMS) ו T32DC00038 (תמיכה JES ו SD), משרד הביטחון מענק W81XWH-14-1-0091 (KMS), קרן ברטרלי (KMS) , Nancy Sayles Day Foundation (KMS), מרכז המחקר לאואר טיניטוס (KMS) וקרן בארנס (KMS).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 מ"מ #1 354087 כיסוי זכוכית גרמניתקורנינגאו הכינו כיסויים עם קורנינג למינין (CB-40232) ו-Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
צינורות צנטריפוגה CELLSTAR 15 מ"ל, תחתית חרוטית, סיום לימודים,גריינר סטרילי Bio-One188161
צינורות צנטריפוגה CELLSTAR 50 מ"ל, תחתית חרוטית, סיום לימודים,גריינר סטרילי Bio-One227261
צלחת תרבית תאים CELLSTAR, 60 מ"מגריינר ביו-וואן628160
קולגנאז מ-Clostridium histolyticum,סיגמא-אולדריץC1639
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates,קורנינג3526
DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד)Thermo Fisher ScientificD1306
DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט, ללא גלוטמין, 500 מ"לThermo Fisher Scientific10313-039
DMEM/F-12, 500 מ"לThermo Fisher Scientific11320-033
Dumont #3 מלקחיים, DumoxelFine Science Tools11231-30חיטוי לפני השימוש
Dumont #5 מלקחיים, קצה סטנדרטי, InoxFine Science Tools11251-20אוטוקלאב לפני השימוש
סרום בקר עוברי, מוסמך, אזורים מאושרים על ידי USDA, 500 מ"לThermo Fisher Scientific10437-028Aliquot בצינורות של 50 מ"ל ומאחסנים ב-20° מקפיא C
Hyaluronidase מאשכי בקר, סוג I-S, אבקת ליופיליזציהSigma-AldrichH3506
Millex-GP יחידת מסנן מזרק, 0.22 ומיקרו; m, פוליאתרסולפון, 33 מ"מ,סטרילי EMD MilliporeSLGP033RS
Paraformaldehyde, דרגת ריאגנט,סיגמא-אולדריץ'P6148לפני השימוש: קבע נהלי הפעלה סטנדרטיים המבוססים על פרוטוקולים זמינים באינטרנט
PBS, pH 7.4, 500 מ"לThermo Fisher Scientific10010-023אוטוקלאב לפני השימוש
בפניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL), 100 מ"לתרמו פישר סיינטיפיק15140-122
טבליות מעכב פוספטאז PhosSTOP טבליות מעכבפרוטאז Roche04906845001
PierceThermo Fisher Scientific88666
קצות פיפטות ופיפטות, 5/10/25 מ"למשתנה
פלסטיק הומוגניזציה עבור 1.5/2.0 מ"ל מיקרו-צינורותE& K ScientificEK-10539
מחטי PrecisionGlide, 27 גרם x 1 1/2ב-BD301629
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115
RNAlater (תמיסת ייצוב RNA)Thermo Fisher ScientificAM7021
צינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה, פוליפרופילן, 0.5 מ"לEppendorf022363719חיטוי לפני השימוש
צינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה, פוליפרופילן, 1.5 מ"לאפנדורף022363204חיטוי לפני השימוש
מי מלח - 0.9% הזרקת נתרן כלורי, בקטריוסטטי, 20 מ"לHospira0409-1966-05
להבי אזמל - #15Fine Science Tools10015-00
Schuknecht צינור יניקה 24 מדBausch + LombN1698 42שימושי לגישה הכירורגית (בנוסף למכשירים כירורגיים אוטולוגיים נפוצים) ולמשל סמן כירורגי כחול
מיכל דגימה, או סטרילי, 4OZMedlineDYND30331H
Stemi 2000-C מיקרוסקופ סטריאוZeiss000000-1106-133
שילוב מזרק/מחט, קצה Luer-Lok, 5 מ"ל, 22 גרם x 1 אינץ'.מזרק309630
בלבד, קצה החלקה, 1 מ"לBD309659
מזרק טוברקולין בלבד, קצה החלקה, 3 מ"לBD309656
הומוגנייזר אולטראסוני, סדרת 4710, בדיקה CV18Cole-ParmerCP25013
' מסונן סטרילי סטרילי גבישי טוברקולין BD

מקורות

  1. Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
  2. Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
  3. Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas. Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).
  4. Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. True incidence of vestibular schwannoma? Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).
  5. Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma? Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
  6. Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
  7. Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
  8. Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. Management of sporadic vestibular schwannoma. Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).
  9. Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
  10. Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
  11. Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
  12. Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
  13. Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
  14. Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
  15. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599(2015).
  16. Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
  17. Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
  18. Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
  19. Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
  20. Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
  21. Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
  22. Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
  23. Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
  24. Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
  25. Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
  26. Archibald, D. J., et al. B7-H1 expression in vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).
  27. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  28. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  29. Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215(2016).
  30. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
  31. Lysaght, A. C., et al. Proteome of human perilymph. J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).
  32. Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
  33. Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
  34. Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNAAdeno Associated Virus
מסגרת מתודולוגית מאוחדת למחקר שוואנומה שיווי המשקל
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.