מאמר שיטה

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/55836

⸱

3 ביוני 2017

 , 
1Basic Sciences Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Biology, Indiana University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיפוי רחב של גנום של אינטראקציות DNA- חלבון הוא קריטי להבנת רגולציה גנטית, שיפוץ הכרומטין, ותהליכים אחרים הכרומטין תושב. פורמלדהיד crosslinking ואחריו immunoprecipitation הכרומטין ותפוקה גבוהה רצף (X-CHIP-Seq) שימש כדי לקבל תובנות רבות ערך לתוך ביולוגיה הגנום. עם זאת, X-Chip-seq יש מגבלות בולטות הקשורות crosslinking ו sonication. NIP צ'יפ ימנע את החסרונות הללו על ידי השמטת crosslinking, אבל לעתים קרובות התוצאות התאוששות לקויה של חלבונים הקשורים הכרומטין. בנוסף, כל השיטות מבוססות שבב כפופות לשיקולי איכות נוגדנים. שיטות אנזימטיות למיפוי אינטראקציות דנ"א של חלבון, הכוללות היתוך של חלבון בעל עניין לאנזים המשנה-דנ"א, שימשו גם למיקוד אינטראקציות DNA-חלבון. לאחרונה שילבנו שיטה כזו, מחשוב אנדוגני הכרומטין (ChEC), עם רצף תפוקה גבוהה כמו CHEC-seq. ChEC-seq מסתמך על היתוך של הכרומטין- AssocIated חלבון של עניין micrococcal nuclease (MNase) כדי ליצור מחשוף DNA ממוקד בנוכחות סידן בתאים חיים. CHEC-seq אינו מבוסס על immunoprecipitation ולכן עוקף חששות פוטנציאליים עם crosslinking, sonication, solobilization הכרומטין, איכות נוגדנים תוך מתן מיפוי ברזולוציה גבוהה עם אותות רקע מינימלי. אנו מאמינים כי ChEC-seq יהיה עמית חזק ל- CHIP, ויספק אמצעי עצמאי שבאמצעותו יאמת את ממצאי ה- CHIP-seq ויגלה תובנות חדשות לגבי הרגולציה הגנומית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיפוי של אתרי קשירה של גורמי שעתוק (TFs), remodelers הכרומטין, ושאר גורמים הקשורים הרגולציה הכרומטין הוא המפתח להבנת כל התהליכים מבוססי הכרומטין. בעוד הכרומטין immunoprecipitation ו-תפוקה גבוהה רצף (שבב- seq) גישות שימשו כדי לקבל תובנות חשובות רבות בביולוגיה הגנום, יש להם מגבלות בולטות. אנחנו לאחרונה הציג שיטה חלופית, כינה מחשוב אנדוגני הכרומטין תפוקה גבוהה רצף (CHEC-seq) 1 , כדי לעקוף את החסרונות.

שבב- seq מבוצע לרוב עם צעד פורמלין מראש crosslinking (X-CHIP-seq) כדי לשמר אינטראקציות DNA- חלבון. עם זאת, מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הצביעו על כך ש- X-CHIP-seq לוכד אינטראקציות דנ"א חולפות או בלתי ספציפיות ל- DNA , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , והוליד אתרי חיוב חיוביים כוזבים. בנוסף, sonication, נפוץ לשבר הכרומטין בניסויים X- שבב seq, מועדף מזמרה אזורים של הכרומטין פתוח, המוביל התאוששות מוטה של ​​שברי אלה אזורים 9 , 10 . Sonication גם מניב תערובת הטרוגנית של אורכי שבר, בסופו של דבר הגבלת רזולוציה האתר מחייב, אם כי תוספת של צעד עיכול exonuclease יכול לשפר באופן משמעותי את ההחלטה 11 , 12 . שיטות צ'יפ מקוריות כגון אזורים כבושים של גנומים מזיקה מטוהרים באופן טבעי בכרומטין (ORGANIC) 13 אינם משתמשים ב- crosslinking וברומטית של כרומטין עם noclease microococcal (MNase), המקלים על הטיות אפשריות הקשורות עם crosslinking פורמלדהיד ו sonication. למרות זאת,מסיסותם של חלבונים רבים הקשורים בכרומטין בתנאים הקלים יחסית הנדרשים להפקת הכרומטין היא גרועה, דבר שעלול להוביל למגוון דינמי מופחת ו / או לתשלילי שווא 14 .

בעוד שחידושים שונים של שבב- seq משמשים בדרך כלל למיפוי גנומי רחב של אינטראקציות DNA-חלבון, מספר טכניקות מיפוי המבוססות על היתוך של חלבונים בעלי עניין באנזימים שונים לשינוי דנ"א יושמו גם הם. גישה אחת כזו היא DNA adenine methyltransferase זיהוי (Damid) 15 , שבו חלבון מחייב הכרומטין של עניין הוא התמזגו גנטית לסכר ואת היתוך זה בא לידי ביטוי בתאים או בבעלי חיים, וכתוצאה מכך מתילציה של רצפים GATC הפרוקסימלי לאתרים מחייב עבור החלבון. Damid הוא יתרון בכך שהוא אינו מסתמך על immunoprecipitation ולכן נמנע crosslinking, נוגדנים, או solubilization הכרומטין. זה מתבצע גם in vivo . למרות זאת, את הרזולוציה של Damid מוגבל סולם קילובז ואת פעילות methylating של חלבון היתוך דאם הוא מכונן. שיטה שנייה המבוססת על היתוך אנזימטי היא קריאה כרטיס 16q, אשר מעסיקה היתוך של גורם של עניין טרנספוזיס, בימוי אינטגרציה ספציפית לאתר של טרנספוזונים. כמו Damid, קורא כרטיס seq אינו מבוסס על immunoprecipitation ולכן יש יתרונות דומים, עם יתרון נוסף של רזולוציה מוגברת. עם זאת, קורא כרטיס- Seq עשוי להיות מוגבל על ידי רצף הטיות של transposases והוא גם סומך על נוכחות של אתרי הגבלה קרוב אתרי ההכנסה טרנספוסון.

שיטה שלישית היתוך אנזימטית, שפותחה במעבדה Laemmli, הוא chromatin אנדוגני מחשוף (CHEC) 17 . ב CHEC, היתוך בין חלבון הקשורים הכרומטין MNase מתבטא בתאים, ועל תוספת סידן כדי להפעיל MNase, DNA הוא ביקע הפרוקסימלי לאתרים מחייב עבור מתויגגורם ( איור 1 ). בשילוב עם דרום סופג, ChEC שימש לאפיין מבנה הכרומטין וחלבון מחייב במספר loci הפרט בשמרים 17 , 18 , ו כבר בשילוב עם ניתוח microarray ברזולוציה נמוכה כדי לחקור את האינטראקציה של רכיבים נקבובית גרעינית עם שמרים הגנום 19 . ChEC מציעה הטבות דומות כמו DUMID ו Calling כרטיס SEQ, ואת הפתרון שלה הוא כמעט בסיס בסיס זוג כאשר ניתח על ידי הרחבה פריימר 19 . ChEC הוא גם controllable: חצץ DNA חזק על ידי MNase תלוי תוספת של סידן millimolar, להבטיח כי MNase אינו פעיל בריכוז סידן חינם חינם שנצפה בתאים שמרים חיים 20 .

בעבר, אנו presulated כי שילוב של CHEC עם תפוקה גבוהה רצף (ChEC-seq) יספק מפות ברזולוציה גבוהה של אתרי הקישור TF. ואכן, ChEC-seq שנוצר מפות ברזולוציה גבוהה של שמרים ניצני כללי כללי הרגולציה (GRFs) Abf1, Rap1, ו Reb1 על פני הגנום 1 . יש לנו גם ליישם בהצלחה ChEC-seq אל המתווך מודולרי מודולרי, משומר, תמלול תמלילי גלובלי חיוני 21 , להרחיב את תחולתם של CHEC-seq כדי מתחמי בגודל megadalton שאינם ישירות ליצור קשר עם ה- DNA עשוי להיות קשה למפות על ידי שבב- שיטות מבוססות. CHEC-seq היא שיטה רבת עוצמה הן עבור אימות עצמאי של תוצאות שבב- seq ו הדור של תובנות חדשות לתוך הרגולציה של תושבי הכרומטין תהליכים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד ליישום שיטה זו בשמרים ניצני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הדור של זנים שמרים

  1. צור זן שמרים הנושאת את גורם הריבית מתויג עם MNase.
    1. PCR להגביר את קלטת תיוג MNase מן הרצוי וקטור ( טבלה 1 ) באמצעות תערובת התגובה שצוין ( טבלה 2 ) ותנאי רכיבה ( טבלה 3 ). מערבבים 5 μL של התגובה PCR ו 1 μL של 6X DNA לטעון צבע. הפעל כל aliquot PCR על 0.8% agarose ג'ל ב 120 V במשך 40 דקות. גודל המוצר הצפוי הוא ~ 2.3 kb.
    2. להפוך את קלטת תיוג מוגבר לתוך זן של בחירה באמצעות שינוי סטנדרטי ליתיום אצטט 22 ולבצע הבחירה.
    3. אמת את האינטגרציה הנכונה של קלטת התיוג עם המושבה PCR.
      1. הכן את תערובת התגובה שצוין ( טבלה 4 ) עבור מספר המושבות להיות מוקרן. שמור על הקרח עד הצורך.
      2. בחר חלק מכל מושבה להיות tesTed לתוך החלק התחתון של צינור PCR באמצעות קיסם קיסרי או קצה pipet.
      3. מיקרוגל המושבות הרים ב כוח גבוה במשך 1 דקות.
      4. הוסף 50 μL של תערובת PCR ( טבלה 4 ) לכל מושבה microwaved ו pipet מעלה ומטה כדי לערבב. בצע את ה- PCR באמצעות תנאי האופניים שצוין ( טבלה 5 ).
      5. מערבבים את μL 50 של תגובה PCR ו 10 μL של 6X DNA לטעון צבע ישירות בצינור כל PCR. הפעל 10 μL של כל מדגם על ג'ל agarose 1% ב 120 V במשך 40 דקות. גודל המוצר הצפוי הוא ~ 700 bp.
        הערה: אם תרצה, לאמת ביטוי מתאים של חלבון היתוך MNase באמצעות סופג המערבי. A ~ 20.6 קילודלטון שינוי המשקל המולקולרי של חלבון מתויג צפוי.
  2. יצירת זן MNase חינם על ידי שיבוט מבוסס הומולוגיה של היזם של הגן של עניין לתוך pGZ136 (טבלה 1) ואת השינוי ואת הבחירה כמו בשלב 1.1.2.
    1. אלטרנטיביVely, להרכיב את היזם של הגן של עניין ו 3xFLAG-MNase-SV40 NLS לתוך וקטור פלסמיד, להפוך ולבחור כמו בשלב 1.1.2, ולהגדיל את הלחץ במצב סלקטיבי המתאים לתחזוקה של הפלסמיד.

2. ChEC

  1. בצהריים / ערב של היום לפני הניסוי ChEC, לחסן 3 מ"ל שמרים- peptone-dextrose (YPD) או בינוני סלקטיבי המתאים עם מושבה אחת של זן הנושא את MNase- מתויג גורם. דגירה זו תרבות לילה (180 סל"ד רועד, 30 מעלות צלזיוס).
  2. בבוקר של יום הניסוי ChEC, לדלל את התרבות לילה לתוך 50 מ"ל של מדיום לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600 ) של 0.2-0.3. דגירה זו תרבות (180 סל"ד רועד, 30 מעלות צלזיוס) עד שהוא מגיע OD 600 של 0.5-0.7. כאשר התרבות מתקרב OD 600 מתאים, להגדיר בלוק חום או אמבט מים ל 30 מעלות צלזיוס ולהתחיל להפשיר המאגר תוספים ( Ta6).
  3. הכן 5 מ"ל של המאגר תוספים פלוס ( טבלה 6 ) לכל תרבות. שמור על המאגר ב RT במהלך ההליך.
  4. הכן צינורות microfuge המכיל 90 μL של פתרון להפסיק ( טבלה 7 ) ו 10 μL של 10% SDS עבור כל נקודת זמן כדי לאסוף. עבור כל גורם חדש ניתח, לקחת דוגמאות ב 0 s, 30 s, 1 דקות, 2.5 דקות, 5 דקות, ו 10 דקות.
  5. תרבות למזוג לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ו צנטריפוגות ב 1500 xg וטמפרטורת החדר (RT) במשך 1 דקות.
  6. תאים resuspend ביסודיות 1 מ"ל של מאגר A ולהעביר את התאים resuspended לצינור microfuge. גלולה resuspended תאים microfuge ב 1500 xg ו RT במשך 30 s.
  7. לשאוב supernatant ו resuspend ביסודיות תאים 1 מ"ל של הצפת על ידי pipetting למעלה ולמטה. גלולה resuspended תאים microfuge ב 1500 xg ו RT במשך 30 s. חזור על שלב זה פעם אחת.
  8. תאים resuspend ביסודיות μL 570 של מאגר א הוסף 30 μL של digitonin 2%(0.1% ריכוז סופי) כדי לאפשר permeabilization של התאים, וכן להפוך לערבב.
  9. תאים Permeabilize בלוק חום או אמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  10. Pipet התגובה למעלה ולמטה כדי להבטיח הפצה אפילו של תאים. הסר aliquot 100 μL של תאים permeabilized כמו שליטה שלילית לצינור microfuge המכיל פתרון להפסיק ו SDS (שלב 2.4) ו מערבולת בקצרה לערבב.
  11. הוסף 1.1 μL של 1 M CaCl 2 (2 מ"מ ריכוז סופי) לתאים permeabilized להפעיל MNase ולהפוך כמה פעמים במהירות או מערבולת בקצרה לערבב. מיד להחזיר את התגובה המעורבת ב 30 מעלות צלזיוס ולהתחיל טיימר.
  12. בכל נקודת זמן כדי לאסוף, pipet התגובה מעלה ומטה כדי להבטיח הפצה אפילו של תאים, ולאחר מכן להסיר aliquot 100 μL של תאים permeabilized לצינור microfuge המכיל פתרון לעצור SDS ו מערבולת בקצרה לערבב. עבור כל גורם חדש ניתח, לקחת 0 (לא הוסיף CaCl 2 ), 30 s, 1 דקות, 2.5 דקות, 5 דקות ו 10 דקות נקודות זמן.
    הערה: ניסויים ChEC עם גורמים לדקלם במהירות DNA ב 30 מעלות צלזיוס יכול להתבצע בטמפרטורות נמוכות יותר להאט MNase מחשוף קינטיקה.
  13. לאחר כל נקודות הזמן נאספו, להוסיף 4 μL של 20 מ"ג / מ"ל ​​proteinase K לכל מדגם, מערבולת בקצרה לערבב, ו דגירה על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  14. הוסף 200 μL של 25: 24: 1 פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl על כל מדגם, מערבולת במרץ לערבב, צנטריפוגה במהירות מקסימלית RT ב microfuge למשך 5 דקות.
  15. הסר כל שלב מימית (~ 150 μL) לצינור חדש. הוסף 30 מיקרוגרם של גליקוגן 500 μL של אתנול 100%. וורטקס במרץ לערבב ו להאיץ על קרח יבש במשך 10 דקות או עד הפתרון הוא צמיג.
  16. גלולה דנ"א זירז במהירות מקסימלית ו 4 מעלות צלזיוס microfuge למשך 10 דקות.
  17. Supernatants למזוג ולשטוף כדורי עם 1 מ"ל של אתנול RT 70%.
  18. מוריד אתנול, הסרת שאר על ידי הפיכת אדבק בעדינות בצינורות על מגבת נייר. דגימות ספין בקצרה באמצעות צנטריפוגה benchtop ולהשתמש פיפטה כדי להסיר אתנול שיורית, נזהר לא להפריע גלולה. אוויר יבש כדורי עבור ב RT במשך 5 דקות.
  19. בעוד כדורי ייבוש, לעשות תערובת אב resuspend כדורי מיובשים ב 29 μL של Tris, pH 8.0 + 1 μL של 10 מ"ג / מ"ל ​​RNase כל אחד. Digest RNA ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  20. מערבבים 1 μL של 6X DNA לטעון צבע עם 5 μL של כל מדגם ולהפעיל על ג'ל agarose 1.5% ב 120 V במשך 40 דקות.

3. בחירת גודל

הערה: המטרה של בחירת גודל היא להסיר שברי multobase של DNA גנומי מן המדגם להיות רצף ולהעשיר שברי ~ 150 bp (בערך בגודל של DNA גרעיני) או קטן יותר. ב נתונים רצף, שברי <400 BP מועשרים, עם שיא ראוי לציון סביב בגודל של DNA נוקלאוזומלי (~ 150 BP) ו שיא או הפצה רחבה של שברי subnucleosalal.

  1. לכל מדגם, להוסיף 75 μL של שלב מוצק immobilization (SPRI) חרוזים ב פוליאתילן גליקול (PEG) פתרון 23 ו pipet למעלה ולמטה 10 פעמים לערבב. דגירה החרוז: תערובת DNA ב RT במשך 5 דקות.
  2. במהלך הדגירה חרוז SPRI, להכין צינורות microfuge המכיל 96 μL של 10 מ"מ טריס, pH 8.0 ו 4 μL של 5 Na NaCl עבור כל מדגם.
  3. מניחים צינורות במעמד מגנטי לאסוף חרוזים בצד הצינור. אפשר את החרוזים לאסוף בצד של הצינור במשך 2 דקות.
  4. מעבירים כל supernatant לצינור חדש המכיל Tris ו NaCl (שלב 3.2).
  5. הוסף 200 μL של 25: 24: 1 פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl על כל מדגם, מערבולת לערבב, ו צנטריפוגה במהירות מקסימלית RT ב microfuge למשך 5 דקות.
  6. הסר כל שלב מימית צינור חדש. הוסף 30 מיקרוגרם של גליקוגן 500 μL של אתנול 100%. לזרז DNA על קרח יבש במשך 10 דקות או עד הפתרון הוא צמיג.
  7. Pellet preciדנ"א pitated במהירות מקסימלית ו 4 מעלות צלזיוס microfuge למשך 10 דקות.
  8. Supernatants למזוג ולשטוף כדורי עם 1 מ"ל של 70% אתנול.
  9. אתנול למזוג, להסיר את שארית ידי היפוך בעדינות הקשה על צינורות על מגבת נייר. דגימות ספין בקצרה באמצעות צנטריפוגה benchtop ולהשתמש פיפטה כדי להסיר אתנול שיורית, נזהר לא להפריע גלולה. אוויר יבש כדורי עבור ב RT במשך 5 דקות.
  10. Resuspend גלולות מיובשות μL 25 של Tris, pH 8.0. קביעת ריכוז המדגם באמצעות assay רגישות גבוהה. עבור ניסויים TF CHEC, 10-100 ng DNA הוא שגרתי התאושש לאחר בחירת גודל.
  11. הכן ספריות רצף. פרוטוקולי הכנה לספריה שאינם מסתמכים על בחירת גודל, כפי שתואר לעיל 24 , רצוי לאפשר רצף של מגוון גדול של גדלים שבר (25-500 bp).
  12. ספריות רצף במצב משויך סוף. מינימום של 25 בסיסים של רצף על כל קצה נדרש קריאה באיכות גבוההמיפוי. בין 1 ל 2 מיליון קורא מספק כיסוי מספיק עבור מדגם ChEC.
    הערה: ניתוח נתונים ChEC-seq הוא הליך מורכב מעבר להיקף של מאמר זה. מידע מפורט על ניתוח נתונים ניתן למצוא בפרסומים קודמים 1 , 21 , ואת סקריפטים מותאמים אישית המשמשים לניתוח זמינים ב GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) יכול לשמש גם עבור ניתוח שורת הפקודה של נתונים ChEC-seq.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במקרה של ניסוי מוצלח של ה- CHEC, אנליזה של דנ"א על-ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל יגלה גידול תלוי סידן ב-שבר עודף DNA, כפי שצוין על ידי מריחה ו בסופו של דבר העיכול המלא של DNA גנומי. במקרים מסוימים, סולם של להקות דומות לזה שנראה עם עיכול MNase המסורתית הוא ציין לאחר העיכול המורחבת. זה המקרה של ניתוח CHEC של Reb1, גורם רגולציה כללי שקושר נוקלאוזום, מדולדל אזורים (NDRs) ( איור 2 ). מצאנו, במקרה של GRFs, העיכול המורחב מוביל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הראינו כי ChEC יכול למפות שיעורים שונים של חלבונים שמרים על הכרומטין, ולצפות כי יהיה זה ישים באופן רחב על משפחות שונות של TFs אחרים הכרומטין מחייב גורמים בשמרים. CHEC-seq הוא יתרון בכך שהוא אינו דורש crosslinking, solobilization הכרומטין, או נוגדנים. לפיכך, ChEC נמנע חפצים עשויים להיות נוכח X- שבב- seq, כגון חפץ היפר ChIPable 3 , 4 , ו CHIP יליד, כגון שליליות שווא בשל solobilization חלבון שלם 14 . ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למוסטפה סאלח ולג'יי טוריגני על קריאה ביקורתית של כתב היד וסטיבן האן וסטיבן הניקוף על הדרכה ותמיכה במהלך הפיתוח של CHEC-seq ויישומה למתווך המתווך. SG נתמך על ידי מענקים NIH R01GM053451 ו R01GM075114 ו GEZ נתמך על ידי קרנות ההפעלה של אוניברסיטת אינדיאנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
dNTPsNEBN0447
Q5 DNA פולימראז בנאמנות גבוההNEBM0491Lפולימראזות DNA אחרות בנאמנות גבוהה, כגון Phusion, עשויות לשמש להגברת קלטות.
TrackIt 1 Kb Plus סולם DNAThermoFisher Scientific10488085
Taq DNA פולימראזNEBM0273L
cOmplete מיני קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTASigma-Aldrich11836170001חשוב להשתמש בתערובת מעכבי פרוטאז ללא EDTA, כדי לא לעכב את מחשוף MNase על ידי כלציה של Ca2+.
PMSFACROS OrganicsAC215740010
Digitonin, טוהר גבוהEMD Millipore300410-250MGצור מלאי של 2% על ידי המסת 20 מ"ג דיגיטונין ב-1 מ"ל DMSO עם מערבולת נמרצת.
Proteinase K, 20 מ"ג/מ"לInvitrogen25530049
RNase A, 10 מ"ג/מ"לThermoFisher ScientificEN0531
Ampure XP חרוזיםבקמן קולטרA63880ניתן ליצור באמצעות פרוטוקול שפורסם (הפניה 24).
מתלה מגנטי MagneSpherePromegaZ5342
דמויי אמפור

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733(2015).
  2. Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
  3. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
  4. Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506(2013).
  5. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
  6. Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
  7. Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
  8. Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412(2014).
  9. Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241(2009).
  10. Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700(2009).
  11. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  12. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
  13. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
  14. Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042(2014).
  15. Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
  16. Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
  17. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  18. Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
  19. Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
  20. Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
  21. Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
  22. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  23. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
  24. Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
  25. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  26. Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
  27. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
  28. Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
  29. Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
  30. Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
  31. Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323(2013).
  32. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  33. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
  34. Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
  35. van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
  36. Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNASPRI

מאמרים קשורים