מאמר שיטה

Microfluidic דימות זרימת cytometry ידי אסימטרית איתור זמן למתוח אופטי מיקרוסקופית (ATOM)

DOI:

10.3791/55840

⸱

28 ביוני 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, The University of Hong Kong

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את היישום של זמן א-סימטרי איתור למתוח מערכת מיקרוסקופית אופטית עבור הדמיה תא בודד זרימה microfluidic מהירים ויישומים שלה cytometry זרימת הדמיה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינוי קנה המידה של מספר פרמטרים מדידים, אשר מאפשר ניתוח נתונים רב ממדית ועל כך גבוהה יותר סטטיסטית תוצאות סטטיסטיות, כבר המגמה העיקרית בפיתוח מתקדם של cytometry הזרימה. יש לציין, הוספת יכולות הדמיה ברזולוציה גבוהה מאפשרת ניתוח מורפולוגי מורכב של מבנים הסלולר / תת הסלולר. זה לא אפשרי עם cytometers זרימה סטנדרטית. עם זאת, הוא בעל ערך לקידום הידע שלנו על פונקציות הסלולר יכול להפיק תועלת מחקר מדעי החיים, אבחון קליני, ניטור סביבתי. שילוב יכולות הדמיה לתוך cytometry זרימת פשרות התפוקה assay, בעיקר בשל מגבלות על מהירות ורגישות בטכנולוגיות המצלמה. כדי להתגבר על מהירות זו או אתגר התפוקה מול cytometry זרימת הדמיה תוך שמירה על איכות התמונה, א-סימטרית איתור זמן למתוח מיקרוסקופית אופטית (ATOM) הוכח לאפשר גבוהה ניגודיות, תא בודד תאעם רזולוציה תת סלולארית, בתפוקת הדמיה עד 100,000 תאים / s. בהתבסס על תפיסת הדמיה של הדמיה קונבנציונאלי זמן למתוח, אשר מסתמך על כל קידוד התמונה אופטי אחזור באמצעות פעימות לייזר מהירים בפס רחב, ATOM עוד התקדמות ביצועי הדמיה על ידי שיפור ניגודיות התמונה של תאים ללא תווית / unstained. מטרה זו מושגת על ידי גישה למידע שלב הדרגתי של התאים, אשר מקודדים spectrally לתוך פעימות יחיד פס רחב. לפיכך, ATOM הוא יתרון במיוחד במדידות תפוקה גבוהה של מורפולוגיה תא בודד ומרקם - מידע המעיד על סוגי תאים, מדינות, ואפילו פונקציות. בסופו של דבר, זה יכול להיות חזק פלטפורמה cytometry זרימת הדמיה עבור phenotyping biophysical של תאים, משלימים את המדינה הנוכחית של ה- Art ביוכימי-סמן מבוסס assay סלולרי. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול כדי לקבוע את המודולים העיקריים של מערכת ATOM (מ Frontend אופטי נתונים pRcessing ו להדמיה backend), כמו גם את זרימת העבודה של זרימת cytometry הדמיה המבוססת על ATOM, באמצעות תאים אנושיים מיקרו אצות כמו הדוגמאות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה אופטית מציג כלי רב עוצמה assay מבוסס תא כדי (כמעט) לא פולשני לדמיין את ההפצה המרחבית מפורט של רכיבים סלולריים רבים / תת, ובכך לחשוף שפע של מורפולוגי, biophysical, ו biomolecular חתימות של תאים. עם זאת, יכולת זו כדי לחלץ מידע תוכן גבוהה מתאים בודדים נפגע בדרך כלל כאשר האוכלוסייה העצומה והטרוגנית של תאים היה צריך להיחקר. זה מסמן משותף המסחר off-assay מבוסס מבחני בין התפוקה המדידה ותוכן. דוגמה בולטת היא כי הוספת יכולת הדמיה כדי cytometry הזרימה הביאה למטה קנה המידה של התפוקה על ידי לפחות 1-2 סדרי גודל לעומת זה של cytometers הזרימה הקלאסית הדמיה קלאסית. למרות שזה יכול להציע מורכבים ניתוח מורפולוגי יחיד תא זה אינו אפשרי עם cytometers זרימה רגילה 1 , cytometry זרימת הדמיה בדרך כלל חסר התפוקה מספיק מזההמטמיעים הטרוגניות סלולרית עם ביטחון סטטיסטי גבוה. זה הכרחי עבור תגליות חדשות בביולוגיה כדי להשיג הבנה של הפתוגנזה של מחלות. האתגר הטכנולוגי העיקרי טמון במגבלת המהירות הטבועה באסטרטגיות ההדמיה האופטית הנפוצות: סריקת קרן לייזר ( לדוגמה, על ידי מראות גלוונומטריות) ו / או חיישני תמונה ( למשל, מכשיר מצמד טעינה (CCD) תחמוצת תחמוצת (CMOS)). מהירות הסריקה בלייזר מוגבלת באופן מוחלט על ידי האינרציה המכנית של מראות הסריקה, בעוד ששיעור המסגרות של CCD או CMOS מוגבל על ידי הסחר היסודי בין מהירות ההדמיה לבין הרגישות ( כלומר, הגדלת קצב המסגרות גורמת לירידה ברגישות לזיהוי אותות , ולהיפך).

מבוסס על כל אופטי, Ultrafast התמונה קידוד מנגנון, אופטי הזמן למתוח הדמיה הוכח כפלטפורמה אטרקטיבית עבור תפוקה גבוהה זרימה דימות cytOmeters, ללא צורך של חיישנים תמונה קונבנציונאלי או לייזר מכני סריקה 2 , 3 . תיאורים מפורטים של עקרון העבודה של זמן למתוח הדמיה ניתן למצוא בהתייחסויות 4 , 5 , 6 , 7 . בקצרה, הוא מורכב משני שלבי מיפוי הניתנים להחלפה: (i) קידוד ספקטרלי (מיפוי שטח גל), שבו הקואורדינטות המרחביות של הדגימה המצויה ממופות לאורכי גל שונים על פני הספקטרום של קרן אור 8 , 9 , ו - (ii) טרנספורמציה פורייה מפוזר (מיפוי זמן גל) 9 , שבו רכיבים אורך גל של פולסים לייזר בודדים הופכים (מתוח) באמצעות פיזור מהירות הקבוצה (GVD) לתוך גל (שטף גל) גל (גל 1 ) גל ( איור 1 ). חשובתכונה של זמן למתוח הדמיה היא הגברה אופטית, אשר ממלא תפקיד קריטי במאבק אובדן רגישות עקב photodetection מהירים ואת אובדן GVD, ובכך לשפר את יחס אות לרעש תמונה (SNR) מבלי להיות מזוהם על ידי רעש photodetector 9 . מאז כל הדופק לייזר מקודד קו סריקה של הדגימה הדמיה, המהווה אורתוגונלית לזרימה חד כיווני של התאים, קו יעיל לסרוק קו נקבעת על ידי שיעור החזרה לייזר, אשר בדרך כלל מעבר 10 מגהרץ. זה מבצע מהיר מאפשר לטשטש חינם, תא בודד ללכוד תמונה בתפוקה של 10,000-100,000 תאים / s ( כלומר, 10-100 פעמים גבוה יותר מאשר cytometry זרימת הדמיה קונבנציונאלי). כתוצאה מכך, זמן הדמיה יכול למצוא יישומים ייחודיים בתפוקה גבוהה, בודד תא, מבוסס התמונה ההקרנה, במיוחד כאשר יש צורך לזהות הטרוגניות ידוע או תאים נדירים / חריגה בתוך אוכלוסייה ניכרת (אלפי עד מיליוני Cel Ls), כגון נדירים תאי סרטן הקרנה 10 או מיקרו אצה סיווג 11 .

זמן למתוח הדמיה מסתמך בעיקר על שדה בהיר (BF) לכידת תמונה, שממנו בניגוד התמונה נוצרת באמצעות פיזור האור וקליטה מן התאים 2 , 3 , 9 , 10 , 11 . יכולות הדמיה ללא תווית אחת, ללא תא, יכולות לעקוף את ההשפעות המזיקות הקשורות לתוויות הניאון, כגון ציטוטוקסיות ופוטובלאצ'ינג, ועדיין לספק מידע בעל ערך לניתוח תא בודד המבוסס על המרקם והמורפולוגיה התאית והתת-תאית. אלה ללא תווית פרמטרים הוכיחו להיות יעיל עבור סיווג תמונה עמוקה של תאים, במיוחד כאשר אוכלוסיית תאים עצומה זמין 11 ,"Xref"> 12. עם זאת, במקרים רבים, הדמיה BF נכשל לספק ניגוד מספיק כדי לחשוף את המורפולוגיה מפורט של התווית ללא תאים שקופים. תוויות שונות ללא תווית, שלב, בניגוד, זמן למתוח הדמיה פותחו עבור שיפור הניגוד הדמיה בקצב מהיר מסגרת 13 , 14 , 15 . בין הטכניקות הללו, פותח מיקרוסקופיית המיקרוסקופ האופטי-מתיחה האסימטרי-זמן (ATOM) כדי לחשוף את ההשתנות בשלב (הפרש-הפרעות-ניגודיות-ניגודיות) המבוססת על קונספט הדומה לצילום Schlieren, ללא תשלום, הדמיה ניגודיות גבוהה של תאים בודדים במהירות ultraigh microfluidic (עד 10 מ ש) 16 . אפקט זה יכול להיווצר בקלות באמצעות גילוי אלכסוני או תאורה על ידי חסימה חלקית של נתיב קרן מקודד תמונה או הטיה את הקורה לפני photodetection. יתרון נוסף של ATOM הוא שלהכדי לרכוש בו זמנית שני ניגודים פאזה- gradient יחד עם אוריינטציות הפוכה. חיסור אינטנסיביות וסיכום של שתי תמונות מנוגדות ניגודיות מניבות את ההפרש בין השלב ההדרגתי ואת נקודת הניגוד, בהתאמה, מאותו קו סריקה. עבודה זו מציגה פרוטוקול מפורט המתאר את יישום ATOM, כולל הקמת של תוכנית אופטית, הכנת המדגם, ואת רכישת נתונים להדמיה. באופן ספציפי, עבודה זו מדגימה את הפעולה ATOM עם הדמיה תא בודד של תאי דם אנושיים, תאים סרטניים, ו phytoplankton (microalgae). זה מדגיש את תחולתו של ATOM כדי cytometry זרימת הדמיה, לא רק בזירה ביו, אלא גם במחקר ימית דלק ביולוגי 17 , 18 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה לדוגמא

  1. הכנה לדוגמא (תאים חסיד, MCF-7 תאים)
    1. להוציא את צלחת תרבות התא מן החממה ולנקות את המדיום התרבות.
    2. שוטפים את התאים בצלחת עם 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להסיר בינוני תרבות מוגזמת.
    3. הוסף 3 מ"ל של תמיסה של 0.25% טריפסין לצלחת התרבות (קוטר של 100 מ"מ) והניח אותו 37 ° C, 5% CO 2 חממה במשך 4 דקות.
      הערה: טריפסין ממיס את החלבון הדביק של התאים, כך שהם ינותקו מהצלחת תרבות.
    4. בדוק אם כל התאים מנותקים מהצלחת תרבות באמצעות מיקרוסקופ אור (10X אובייקטיבי). אם לא, לנער בעדינות את צלחת תרבות התא.
    5. הוסף 4 מ"ל של המדיום תרבות רגילה (מנוסח עם 89% Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM), 10% בסרום שור עוברית (FBS), ו 1% פניצילין סטרפטומיצין (PS) כדי לעצור את הפעולה של טריפסין.
    6. T Ransfer את התערובת כולה (תאים פתרון טריפסין בינוני המדיום) כדי צינור צנטריפוגות צנטריפוגה 5 דקות ב 200 x גרם.
    7. הסר את כל הנוזל מחדש להשעות את התאים 1 מ"ל של 1x PBS (ערך pH: 7.4, מראש מחומם ל 37 ° C).
  2. הכנת דוגמאות (אצות מיקרו תרבותיות)
    1. מעבירים את האצות המיקרו-אולוגיות ואת המדיום התרבותי ( למשל, מי ים, אגר או מים מתוקים) לצינורות תרבות זכוכית חדשים (~ 15 מ"ל) בנפח נפח (אצות מיקרו לתרבות בינונית) של 1: 5 כדי להקים מדיום תת-תרבותי חדש.
    2. מניחים את צינורות התרבות זכוכית בתא אבק הוכחה תחת תאורה מתמדת על ידי תאורה מלאכותית מנורות פלורסנט על פי מחזור אור / כהה (LD) מחזור (בדרך כלל LD 16: 8) עבור 72-120 שעות לפני הניסוי.
    3. מעבירים את דגימות תת תרבותי לצינור צנטריפוגה ומערבבים היטב.

2. הגדרת מערכת ATOM

Gether.within-page = "1"> figure-protocol-1
איור 1: סכמטי של מערכת ATOM. לייזר פס רחב פס רחב מועסק על מנת לספק פולסים מהירים ( א ) מודול זמן למתוח ו ( ב ) מודול מגבר אופטי in-line. מודול הזמן למתוח מייצר רכבת של צורות גל טמפורליות, שכל אחת מהן היא העתק של ספקטרום אורך הגל של מקור הלייזר ( כלומר, מיפוי אורך גל). מודול מגבר משמש עבור פיצוי הפסד מתיחה (מפזר) הפסד. הדופק המתוח הוא אז ( ג ) מפוזרים מרחבית על ידי גרירת עקיפה, ויצרו תאורה ספקטרום רוחבי 1D שבו רכיבים אורך גל יחיד מועברים על ידי זוג עדשות ממסר וממוקד על ידי העדשה אובייקטיבי על עמדות שונות על התא זורם בתוך ( ד ) שבב microfluidic. זהו תהליך של קידוד ספקטרלי. האור מקודד באופן ספורטיבי יעבור שוב את התא דרך עדשה אובייקטיבית נוספת ומראה, וחוזר לשרטוט העקיפה ויורכב מחדש כאל קרן פעימה חסרת פשר. זו קרן מקודדת התמונה היא פעימה אז ( ה ) פיצול לשני נתיבים, כך ששני הקורות חסומות חלקית עם ( f ) קצה הסכין, אך מכיוונים מנוגדים, לפני שהוא מצורף לסיבים. שתי קורות אלה מייצגות את שני הניגודים המקודדים (שלב שני) מקודדים של התמונה הסופית. עבור זיהוי סימולטני של שני אותות האות, אחד האותות עוברת ( ז ) קו זמן עיכוב, כך שני האותים הם multiplexed (interleaved) בזמן. Photodetector במהירות גבוהה בזמן אמת אוסצילוסקופ משמשים לרכישת נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. רחוב זמן מודול
    1. להעסיק fmtosecond פס רחב (fs) או picosecond (PS) פעמו מקור לייזר עם אורך גל מרכז המומלץ בטווח אינפרא אדום הקרוב (NIR), 800-1,500 ננומטר.
      הערה: רוחב הדופק הדרוש טיפוסי יכול לנוע בין תת 100 fs ל ps כמה. דרישות מפורטות של מקורות לייזר פועם ניתן לראות הפניות 4 ו 5. מדדים חשובים מודגשים בטבלה 1 .
      1. ודא כי מקור הלייזר יש שיעור חזרות גבוה, אשר צריך להיות במשטר מגההרץ ( למשל, עשרות MHz) כדי להבטיח הדמיה מהירים ATOM. כמו כן, להגדיר את הפלט שיא כוח לייזר גם מתחת לסף כוח הנזק של חלל סיבים, כ 1 קילוואט.
      2. ודא טוב ירה לעבר זריקה יציבות טמפורלית ו ספקטרלית של מקור לייזר פעמו.
        הערה: סובלנות אופיינית בתנודות משרעת הספקטרום צריכה להישמר בתוך 1.2% 19 , 20 ,Ss = "xref"> 21, כפי שהושג על ידי מצב סיבים נעול לייזר ההתקנה הזו.
        הערה: רוחב הפס האופטי של מקור הלייזר צפוי להיות 10-100 ננומטר, אשר חיוני כדי להבטיח מספיק שדה הדמיה של נוף (FOV) ב-תא יחיד הדמיה 21 .
    2. באמצעות collimator סיבים, זוג קרן לייזר פעמו למצב יחיד סיבים אופטיים dispersive, שבו פעימות נמתחים באמצעות פיזור מהירות הקבוצה (GVD) ( איור 1 א ).
      הערה: זהו התהליך שאחריו הספקטרום של כל דופק ממופה על הזמן כגל בצורת גל שטופת גל ( כלומר, מיפוי אורך גל).
      הערה: סך ה- GVD הנדרש צריך להיות מספיק כדי להבטיח שהרזולוציה הכוללת של תמונת ה- ATOM לא תושפע מתהליך המיפוי של אורך גל (ראה דיון). בדרך כלל, בטווח ניר, GVD צריך להיות הרבה מעבר 0.1 ns / nm. לדוגמה, סיבים במצב יחיד מועסקים thiS הנוכחי מספק GVD הכולל של 0.38 ns / nm סביב אורך הגל של 1,060 ננומטר (אורך סיב הכולל של 10 ק"מ).
  2. מודול קידוד ספקטרלי
    1. לבנות מערכת מיקרוסקופ אופטי לבצע את הדמיה מקודדת spectrally של התאים הזורמים לאורך ערוץ microfluidic, כפי שמוצג באיור 1 .
      הערה: רכיבי המפתח של מיקרוסקופ אופטי זה כוללים: (1) גרירה עקיפה, טלסקופי ממסר עדשה מודול (RL1 ו RL2 באיור 1 ), ושתי עדשות אובייקטיביות (Obj1 ו Obj2 באיור 1 ).
      1. ראשית, להאיר את הזמן נמתח ו collimated קרן על גרירה עקיפה (סוג שידור grating מועסק ההתקנה הזו) כדי ליצור מקלחת רפאים ( איור 1 ג ).
        הערה: כוח של diffracted קרן ( כלומר, יעילות עקיפה) ניתן למקסם על ידי התאמת tהוא מגרגר אוריינטציה סגור לתצורה littrow.
      2. הגדר את שתי עדשות הממסר (RL1 ו- RL2) במערכת הדמיה של 4-f ( כלומר, הניח את העיבוד המשתנה במישור הפוקוס של RL1 ואת RL1 ו- RL2 נפרדים במרחק שווה לסכום אורכי המוקד שלהם. לאחר מכן יהיה צילמו על המטוס המוקד האחורי של העדשה אובייקטיבי Obj1).
      3. בזהירות ליישר את הספקטרום מקלחת למלא את הצמצם האחורי של Obj1, כך מקלחת ספקטרלית ניתן מוקרן וממוקדת על המטוס תמונה של המיקרוסקופ.
        הערה: כאן, NA של העדשה אובייקטיבית (Obj1 באיור 1 ) הוא 0.75.
      4. מקום אחר עדשה אובייקטיבית (Obj2 באיור 1 ) עם NA דומה ומראה מטוס בצמצם האחורי של העדשה אובייקטיבי זה (Obj2), כך קרן הקשת הספקטרום יכול להיות מיושר פעמיים כדי לעבור את המטוס התמונה ולחזור גרירת עקיפה.
      5. לְהַתְאִיםזוג עדשות אובייקטיביות (Obj1 ו Obj2) כך מטוסי הפוקוס שלהם חופפים זה עם זה. בדוק אם המקלחת הספקטראלית מעבירה פעמיים את מטוס התמונה באותו מיקום ומחזירה את הסורג בעקבות אותו נתיב. אם לא, בצע יישור נוסף כוונון של מערכת אופטית.
        הערה: האור המוחזר אמור לעבור דרך מפצל קרן נוסף, כך שהאור יכול להיות מועבר למודול זיהוי אסימטרי.
      6. כוונן את רווח המגבר האופטי ברמה המתאימה, כך שניתן יהיה לזהות את האות המתקבל על ידי photodetector עם SNR טוב, שהוא בדרך כלל> 10 dB.
      7. מקום ולהתאים את המיקום של שבב microfluidic על פלטפורמת המדגם ולוודא כי מקלחת ספקטרלית, ולכן אזור הדמיה, ממוקם על פני ערוץ microfluidic ( איור 1 ד ).
        הערה: המקלחת הספקטראלית מוארת באופן אורתוגונלי לכיוון הזרימה של נוזלים בתוך mשבב מיקרופלואידי, כך שהתנועה הזורמת מבצעת באופן אוטומטי סריקות דו מימדיות (2D).
  3. מודול זיהוי אסימטרי
    1. מניחים קרן נוספת ספליטר להפריד בין קרן קידוד צילמו לשניים ( איור 1e ).
      הערה: כל העתק קרן נחסם בחלקו על ידי קצה סכין.
    2. למדוד ולהקליט את הכוח האופטי של הקורה לפני בלוק קרן. לאחר מכן, מיקום ידני של הקצוות סכין (רכוב על הבמה תרגום ליניארי) כך שהם לחסום בערך חצי קרן (על ידי בדיקה חזותית). לאחר מכן, השתמש מד צריכת חשמל אופטי כדי לפקח על כוח הקורה תוך כוונון עדין של המיקום של הקצוות סכין על ידי תרגום אותם על פני הקורה.
      הערה: מוצע כי המיקום האופטימלי הוא שבו הכוח הוא ירד ב ~ 50% בערך המקורי ( כלומר, במקרה unblocked). זהו המצב המספק את השילוב הטוב ביותר של אות התמונהחוזק ושיפור ניגודיות התמונה.
    3. חזור על שלב 2.3.2 עבור העתק קרן אחרת. שים לב כי הכיוון של בלוק קרן חלקית עבור קרן אחת צריכה להיות הפוכה ביחס קרן אחרת ( איור 1F ).
    4. זוג שני קורות חסומות חלקית לשני זרועות סיבים בודדים במצב יחיד באמצעות שני סיבים collimators.
      הערה: אחת הזרועות יש אורך נוסף של סיבים, המשמש סיב מבוססי עיכוב קו, להציג זמן עיכוב ביחס העתק השני (ללא קו עיכוב) ( איור 1 ג ' ). שניהם מופנים סיב אחד על ידי מצמד סיבים לפני photodetection. זמן עיכוב צריך להיות ארוך מספיק כדי להפריד זמנית את שני העותקים ו קצר מספיק כדי למנוע חפיפה זמנית עם waveform הבא ( כלומר, שני עותקים משוכפלים הם תמיד interleaved זמן רב מרובב בסיב אחד לפני גילוי ( איור 2 א) )).
    5. כובעTure ו לספרת אותות אופטיים מזוהים עם אוסצילוסקופ בזמן אמת. שים לב כי רוחב הפס ולכן קצב הדגימה של האוסילוסקופ צריך להיות גבוה מספיק כדי להבטיח שהם לא משפיעים על רזולוציית התמונה הסופית (ראה דיון).
      הערה: כאן, עם GVD של 0.38 ns / nm, נדרשים רוחב פס לרכישה של backend וקצב דגימה של 20 GHz ו- 40 GSa / s בהתאמה.

3. פרוצדורות ניסוייות

  1. טעינת הדגימה
    1. בצע ספירת תאים תחת מיקרוסקופ בניגוד שלב קונבנציונאלי hemocytometer תקן.
    2. התאם את צפיפות התאים על ידי דילול עם 1x PBS (עם מים באביב עבור אצות מיקרו) ומערבבים היטב עם פיפטה.
      הערה: הריכוז המוצע הוא מ 10 5 עד 10 6 תאים / מ"ל.
    3. הר שבב microfluidic על פלטפורמת המדגם של מערכת הדמיה אופטית.
      הערה: microfluidicשבב הוא עשה בעיקר polydimethylsiloxane (PDMS) ו מפוברק בשיטת דפוס סטנדרטיים העתק. ערוץ microfluidic נועד עם ערוץ מעוקל אסימטרי כדי ליצור את זרימת אינרציה התמקדות אפקט, כך התאים יכולים לזרום בקובץ יחיד בסעיף הדמיה (עם מימד של 80 מיקרומטר x 80 מיקרומטר (גובה x רוחב)) במהירות גבוהה .
    4. מעבירים את הפתרון התא מותאם צפיפות מזרק 10 מ"ל.
    5. חבר את המזרק למפרק של שבב microfluidic צינור צנטריפוגלי לשקע של שבב microfluidic עבור אוסף סילוק.
    6. הר את המזרק על משאבת מזרק ולהגדיר קצב זרימה מתאים לתת התפוקה רצוי כדי למנוע הטלת כוח הגזירה מופרז בין התאים לבין הערוץ.
      הערה: מהירות ליניארית של דגימות צריך להיות בתוך 0.5 ו 10 m / s. שים לב כי לפני ההקלטה בפועל התמונה, זה לעתים קרובות יש צורך להמשיך לכוונן את המערכת, במונחים של למקסם אתעוצמת אות התמונה ואופטימיזציה של התמונה תוך התמקדות על ידי צעדים חוזרים 2.2.1.4-2.2.1.6.

4. רכישת נתונים

  1. הגדר מספר מתאים של נקודות נתונים שיש לשמור עבור כל ניסוי. מספר נקודות הנתונים להישמר תלוי בגודל ובזרימת קצב הדגימות.
    הערה: בדרך כלל, הוא מוגדר 8-16 מיליון נקודות מדגם תחת קצב דגימה של 80 GSa / s.
  2. לרכוש ולשמור את הנתונים במצב אצווה באמצעות אוסצילוסקופ.

5. עיבוד backend

figure-protocol-2
איור 2: שחזור תמונות ATOM מסרגל זמן סריקת זמן. כדי לשחזר את התמונות ATOM עם ניגודיות הקליטה ואת ההפרש (משופרת) שלב מעבר צבע, שני סטים של זמן מתוח פולסים (לראות את סגולים וירוקים פולסים) מופקים מ( א ) זמן רב multiplexed גל waveform עקבות ולאחר מכן הם מפולגים דיגיטלית ו מוערמים כדי ליצור ( ב ) שתי תמונות 2 ד מראה את שתי הפוכות הפוכה מעבר צבע. שים לב כי ניתוח גז נדרש כדי ליצור ( ג ) תמונות ללא עיוות על ידי פיצוי על תת המדד משמרת עקב השגיאה עגול באומדן שיעור החזרה לייזר. על ידי חיסור ( ד ) קו גולמי לסרוק מן המעטפה עוצמת ספקטרלי של מקור הלייזר, את הרקע של התמונות ניתן להסיר. ( G ) תמונה ניגודיות קליטה ניתן להשיג על ידי פיקסל על ידי פיקסל אינטנסיביות סיכום של תמונות ( ה ) ו ( ו ), ואילו ( ח ) דיפרנציאלי שלב שלב ניגודיות התמונה ניתן להשיג חיסור של תמונות ( ) ו- (f). לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותרשל נתון זה.

  1. להעביר את הנתונים מן אוסצילוסקופ למחשבים לשחזור תמונה לא מקוון.
    הערה: כאן, הנתונים מאוחסנים בדיסק קשיח נייד ומועברים ידנית בין האוסילוסקופ למחשבים המעובדים. קיבולת הדיסק הקשיח צריכה להיות מעל 500 GB לכל ניסוי.
    1. השתמש בשגרה לשחזור תמונה מרכזית כדי לערום בצורה דיגיטלית את סריקות הקו ליצירת תמונה דו-ממדית ( איור 2 ).
      הערה: התוכנית המותאמת אישית (ב MATLAB) יוצרת שתי תמונות זיהוי אסימטריות על ידי הפרדת שתי סדרות נתונים מרובות זמן (סגול וירוק בתרשים 2 ).
      1. השגת דיפרנציאלי שלב שלב ההפרש התמונה על ידי הפחתת עוצמות של שתי תמונות זיהוי אסימטרי; תמונה ניגודיות קליטה ניתן להשיג על ידי הוספת שתי תמונות זיהוי אסימטרי. ראה תמונות נבחרות של MCF-7 ו- micro-algae inאיור 3 . שים לב כי פרופילי הרקע של תמונות בודדות יש לסלק תחילה, ואת עוצמות שלהם צריך להיות מנורמל, לפני סיכום התמונה פעולות חיסור.
    2. ליצור ספריה של פרמטרים הנגזרים מן התמונות, כגון נפח התא, מעגל, צפיפות הקליטה, וכו ' לניתוח נוסף.
  2. קלט את ספריית הנתונים לתוך פלטפורמת הדמיה נתונים ( איור 4 ).
    1. טען את הספרייה של הפרמטרים והתמונות המשוחזמות המתאימות לפלטפורמת ממשק ההדמיה.
    2. הגדר את הצירים להיות הפרמטרים של עניין.
      הערה: הפרמטרים הם ספציפיים לבעיה ומוגדרים על ידי המשתמש. הם נגזרים תמונות ATOM על ידי תוכנית MATLAB. כאן, את צפיפות הקליטה האופטית של התא, אזור התא, נפח התא, ואת המעגל התא זמינים לבחירה.
      3. בחר את מערך הנתונים שיוצג, כך שכל תמונה תא יכול להיות דמיינו כנקודת נתונים שונה על העלילה פיזור.
  3. הזז את סמן העכבר לכל נקודה, כך שהתמונה המתאימה ופרמטרים אחרים מוצגים בחלון משנה צף.
    הערה: ניתן לשנות את הצירים בין קשקשים ליניארי לוגריתמי באופן אינטראקטיבי.
  4. בצע ניתוח נוסף של כל תת קבוצה של הנתונים על ידי gating ידני על העלילה פיזור.
    הערה: היסטוגרמה בכל פרמטר של המשנה מגודרת ניתן לתוות נגד אלה של הספרייה כולה. ההיסטוגרמות הנפרדות מוצגות בחלון משנה צף אחר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו ממחישה שתי הפגנות הדמיה חד-תאיות של ATOM: אחת עם תאי יונקים (תאי דם אנושיים פריפריאליים של תאי דם) ותאי סרטן השד (MCF-7)) ועוד אחד עם פיטופלנקטון (Scenedesmus ו- Chlamydomonas). הניסוי הראשון היה מונע על ידי העניין הגובר ביופסיה נוזלית לזיהוי, ספירה, אפיון של תאים סרטניים במחזור (CTCs) בדם 23 . היכולת למדוד CTCs המופצים מאתרי הגידול הראשוניים לזרם הדם מאפשר בדיקה של התקדמות סרטן גרורתי

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם מספר פרטים טכניים הדורשים תשומת לב מיוחדת במהלך ההתקנה של מערכת ATOM. ראשית, חשוב לציין כי תאורה אסימטרית / אלכסונית בעלת קידוד ספקטרלי עשויה להציג את רכיבי השיפוע השלבי ( כלומר, אפקט הצללה) בקונטקסט הקליטה ולהשפיע על הגדלת הניגוד של פאזה-מעבר ב- ATOM. לכן, אפקט זה של תאורה אלכסונית צריך להיות ממוזער. שנית, יש להדגיש כי זמן ריבוב או זמן interleaving סכימת שני עותקים משוכפלים התוצאות אין שום פשרה משמעותית על מהירות הדמיה ( כלומר, קצב סריקה קו של MHz עדיין יכו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לגלות.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למר פ. יונג על הכנת ה- MCF-7 עבורנו. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי המועצה למענקי מחקר של אזור ההנהלה המיוחדת של הונג קונג, סין (פרויקט מס '17259316, 17207715, 17207714, 17205215 ו- HKU 720112E), תוכנית החדשנות והטכנולוגיה (ITS / 090/14 ), ואת האוניברסיטה לפיתוח קרן של HKU.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Nikon Plan Fluorite Physiology Goals 40XNikonMRF07420עדשת אובייקט (Obj2)
Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 מ"מ WD, 40XOlympusRMS40X-PFעדשת אובייקט (Obj1)
N-BK7 עדשות פלנו-קמורותThorlabsLA1145-Cלממסר מקלחת ספקטרלית
FC/APC סיבים קולימציה חבילהThorlabsF220APC-1064לפלט ואיסוף פולסי לייזר
מפצל קרן פליקלThorlabsBP145B3להכנת העתק קרן
מראה כסף מוגנתThorlabsPF10-03-P01להחזרת אור
800-1650 ננומטר 12GHz מצב יחיד מצמד DC NIR פוטו-מקלטניופורט1544-Bלהמרת אור לאות חשמלי
אוסילוסקופאינפיניום בעל ביצועים גבוהיםAgilentDSOX91604Aכדי לשמור את האותות החשמליים שהומרו באור
HI1060 סיב אופטיCorningHI1060סיבים אופטיים למתיחת זמן
מגבר סיבים מסוממים YTTERBIUMKeopsysKPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FAמגבר אופטי בשורה
הולוגרפיWasatch Photonics020305-6סורג
להחדיר/למשוך מזרק משאבותHarvard ApparatusPHD 2000משאבת מזרק לטעינת דגימה בתעלות מיקרו-נוזליות
סורג

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
  2. Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena. Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).
  3. Goda, K., Jalali, B. Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements. Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).
  4. Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. Optofluidic time-stretch imaging - an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry. Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).
  5. Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging - From Single-Cell to Tissue-Wide Scales. IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).
  6. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Appl Phys Rev. 3 (1), 011102(2016).
  7. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).
  8. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  9. Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. Theory of amplified dispersive Fourier transformation. Physical Review A. 80 (4), 043821(2009).
  10. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  11. Lai, Q. T. K., et al. High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton. Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).
  12. Chen, C. L., et al. Deep Learning in Label-free Cell Classification. Sci Rep. 6, 21471(2016).
  13. Fard, A. M., et al. Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media. Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).
  14. Lau, A. K., et al. Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum. J Biomed Opt. 19 (7), 76001(2014).
  15. Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. Label-free high-throughput cell screening in flow. Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).
  16. Wong, T. T., et al. Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow. Sci Rep. 4, 3656(2014).
  17. Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).
  18. Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
  19. Wei, X., et al. Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).
  20. Wei, X., et al. Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging. Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).
  21. Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry. Sci Rep. 6, 27937(2016).
  22. Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. Performance of serial time-encoded amplified microscope. Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).
  23. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
  24. Kling, J. Beyond counting tumor cells. Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).
  25. Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).
  26. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Sci Transl Med. 5 (179), (2013).
  27. Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Scientific Reports. 3, 1259(2013).
  28. Karabacak, N. M., et al. marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).
  29. Krebs, M. G., et al. Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).
  30. Wu, J., et al. Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths. Light Sci Appl. , (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Asymmetric detection Time stretch Optical MicroscopyMicrofluidic Imaging Flow CytometryLabel free High contrast ImagingSingle cell ImagingUltra fast Image CaptureSubcellular Resolution AnalysisTime stretch ImagingOptical Frontend SetupData Processing VisualizationBiophysical Phenotyping Cells

מאמרים קשורים