מאמר שיטה

הרומן כיתה קלינית שיטת בידוד תאי סטרומה Perivascular כליה אנושית

8.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55841

⸱

7 באוגוסט 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Leiden University Medical Centre

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים כיתה קליניים הרומן בידוד ותרבות שיטה כליות Perivascular סטרומה תאים (kPSCs) המבוסס על כל האיבר זלוף עם אנזימי עיכול והעשרה תא NG2. בשיטה זו, אפשרי לרכוש מספרי הטלפון הנייד מספיק לתרפיה תאית.

תקציר

תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) הם homeostatic ואת המערכת החיסונית modulatory בתאי רקמת הראו השפעות מועילות על מחלות כליה והשתלות. Perivascular תאי סטרומה (מגירסה) חולקות מאפיינים עם מח עצם MSCs (bmMSCs). עם זאת, גם ברשותם, קרוב לוודאי עקב החתמה מקומיים, רקמות ספציפיות מאפיינים ולשחק תפקיד רקמות מקומיות הומאוסטזיס. סגוליות רקמות זה עלול לגרום רקמות תיקון ספציפי, גם בתוך הכליה אנושי. בעבר הראינו כי כליה אנושית מגירסה (kPSCs) לשיפור משמעותי ריפוי ואילו bmMSCs לא היה פוטנציאל זה הפצע אפיתל של הכליה. יתר על כן, kPSCs ניתן להפחיתם פגיעה בכליות בתוך vivo. לכן, kPSCs מהוות מקור מעניין עבור טיפול בתאי, במיוחד עבור השתלת כליות ומחלות כליה. הנה אנחנו מראים שיטת בידוד ותרבות מפורט עבור kPSCs מכיתה-השתלת כליות אנושי המבוסס על איברים שלמים זלוף של אנזימי עיכול דרך עורק הכליות העשרה עבור דה מרקר perivascular NG2. בדרך זו, תאים גדולים כמויות ניתן להשיג המתאימים לטיפול הסלולר.

מבוא

תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) הם תאים חיסוניים modulatory, שהיו במקור מבודד ממח העצם. הם מאופיינים שלהם פלך בצורת מורפולוגיה, היכולת להתמיין שומן, עצמות, סחוס הדבקות מפלסטיק. MSCs מבטאים את הסמנים סטרומה CD73, CD90, CD105 בעת היותו שלילי כדי להפוך את סמנים CD31 CD451,2,3. MSCs הם מועמד מבטיח טיפול בתאי בשל רקמת homeostatic ויכולות immunomodulatory שלהם. bmMSCs הם נחקר כעת בניסויים קליניים עבור מספר מחלות, כולל מחלות כליה השתלת כליה כפי שנבדקו במקום אחר4.

בעבר זה היה הראו כי perivascular תאים של מספר איברים מוצקים שונים, כולל רקמת שומן, השליה ואת שרירי השלד מאפיינים משותפים עם MSCs9. עם זאת, תאים אלה גם ייתקלו פונקציות רקמות ספציפיות אשר עלולה לגרום לתיקון organotypic10. התאים perivascular שריר הלב האנושי, לדוגמה, מגורה האנגיוגנזה תגובות לאחר היפוקסיה, הבדיל לתוך cardiomyocytes, בעוד perivascular תאים מבודד לרקמות אחרות לא הראה פוטנציאל אלה11.

תאי סטרומה Perivascular ניתן גם מבודד מן העכבר12,13,14 ו15,כליה אנושית16. אנו בהרחבה המאופיינת kPSCs, לעומת אלה bmMSCs. מצאנו כי kPSCs, הדומה bmMSCs, יש קיבולות לדיכוי המערכת החיסונית, יכול לתמוך היווצרות כלי דם פלקסוס. עם זאת, ישנם רקמות הבדלים מסוימים בין סוגי תאים, כמו kPSCs הראה חתימה ביטוי גנים ברמת השעתוק organotypic, לרבות גורמי שעתוק nephrogenic HoxD10 ו- HoxD11. kPSCs, בניגוד bmMSCs, לא עברה טרנספורמציה myofibroblast לאחר גירוי עם TGF-β, לא היו מסוגלים להתמיין adipocytes. יתר על כן, kPSCs מואצת יושרה האפיתל בכליה הפצע אפיתל צינורי assay מאפס, תופעה שבה לא נצפתה עם bmMSCs. את הפצע משופרת תיקון הייתה מתווכת באמצעות שחרור פקטורי גדילה hepatocyte. יתר על כן, kPSCs יושבחו אי-ספיקת כליות במודל של עכברים של כליות חריפה פגיעה15. לכן, kPSCs נראה שיש לך יכולות תיקון כליות מעולה, הם מקור חדש מעניין עבור תא טיפול במחלות כליה.

כדי להיות מסוגל להשתמש kPSCs למטרות טיפול תא, kPSCs צריך להיות מבודד בצורה קלינית כיתה עם אנזימים כיתה קליניים ופרוטוקולים. יתר על כן, כדי שתוכל לטפל כמה חולים עם kPSCs של התורם 1, מספרי הטלפון הנייד מספיקים צריכה להתקבל. הנה אנחנו מראים בפירוט, ההליך בידוד כיתה קליני של kPSCs מן הכליות להשתלה כל כיתה, מניב מספר מספיק של תאים כדי לשמש לטיפול קליני הסלולר.

פרוטוקול

הוועדה האתית הרפואית המקומית והמועצה המייעצת האתית של הקונסורציום האירופי (STELLAR) אישרו מחקר ואיסוף של כליות בדרגת השתלה אנושית שהושלכו בעיקר מסיבות כירורגיות. הסכמת המחקר ניתנה לכל הכליות.

1. הכנות לתרבית תאים

  1. הכינו בריכה של ליזטים טסיות דם.
    1. אחסן את הטסיות שפג תוקפן פחות מ-2 יום ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (למשך שנה אחת לכל היותר).
      הערה: הטסיות הגיעו במקור מספק מסחרי. הושגו עודפי חומר מבית החולים שחולק על ידי בנק הדם המקומי.
    2. הפשירו את הטסיות של לפחות 5 תורמים (רצוי 10) O/N ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. אחסנו את הטסיות בבקבוק סטרילי גדול, העבירו לצינורות צנטריפוגות חרוטיות וסובבו במשך 10 דקות בטמפרטורה של 1,960 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס><. הערה: נפח הטסיות תלוי במספר התורמים ובכמות החומר העודף של בית החולים לכל תורם.
    4. פיפטה את הסופרנטנט לשקיות דם (50 מ"ל/שקית) דרך הקנה של מזרק 50 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת מדיום תרבית תאים.
    1. יש להפשיר שקית אחת של טסיות דם באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. יש להוסיף לשקית 1 ליטר (כלומר 2 בקבוקים) של Minimum Essential Medium - שינוי אלפא (alphaMEM), 5 מ"ל 200 מ"ל גלוטמין ו-20 מ"ל פניצילין (5,000 יחידות למטר)/סטרפטומיצין (5,000 מיקרוגרם/מ"ל) (עט/סטרפטוקוק).
    3. יש לדגור למשך 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    4. נער את השקית להתפרקות על ידי הקשה עדינה על השקית כאשר התיק מונח על משטח ישר.
    5. מסננים את מדיום הליזאטים של 5% טסיות הדם על ידי משיכת הליזטים דרך המסנן של מערכת העירוי בעזרת מזרק סטרילי של 50 מ"ל.
    6. מניחים את המדיום בצינורות של 50 מ"ל ושומרים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: כל אצווה חדשה של ליזטים טסיות נבדקת בתרבית תאים ומושווה לאצווה הקודמת על ידי גידול תאים מעניינים (bmMSCs או kPSCs) למפגש בשתי האצווה. במספר התאים ובכדאיות, ה-kPSCs או ה-bmMCs הגדלים באצווה החדשה לא צריכים להיות שונים ביותר מ-10%, וביטוי הסמנים של CD73, CD90, CD105 ו-CD31, CD34 ו-CD45 כפי שנותח על ידי ציטומטריית זרימה לא אמור להיות שונה. שיטות תרבית התאים מתוארות בסעיף 6 לפרוטוקול (תרבית kPSC).

2. הכנות לקצירת תאים

  1. הכנת פתרונות.
    1. הכן את המדיום הרגיל על ידי הוספת 10 מ"ל עט/סטרפטוקוקוס ל-500 מ"ל (בקבוק אחד) של המדיום החיוני המינימלי (DMEM)-F12 של Dulbecco.
    2. הכן את אמצעי הכביסה על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום אנושי רגיל (NHS) ו-10 מ"ל של עט/סטרפטוקוקוס לבקבוק אחד של DMEM-F12.
    3. הכן את מאגר מלאי האנזים על ידי הוספת 2.9 מ"ל 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), 1.2 מ"ל NaHCO3 2.5% [w/v] ו-160 מיקרוליטר CaCl2 (1 M) עד 160 מ"ל תמיסה של אוניברסיטת ויסקונסין.
    4. הכן את תמיסת הקולגנאז על ידי הוספה איטית של 20 מ"ל של חוצץ מלאי אנזימים לבקבוק קולגנאז בדרגת GMP המכיל קולגנאז של >2,000 יח' לבקבוק. ממיסים ב-4 מעלות צלזיוס למשך כ-40 דקות. יש לנער בעדינות מספר פעמים במהלך תקופת המסה.
    5. הכן את מדיום ההקפאה על ידי הוספת 5 מ"ל דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ל-45 מ"ל NHS.
  2. הכנת מגש זלוף (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1A).
    1. נקה את תא הזרימה וכסה בווילונות כירורגיים. מחממים אמבט מים לכ-40 - 45 מעלות צלזיוס כדי לחמם את מגש הזלוף ל-37 מעלות צלזיוס.
    2. חבר מגש זלוף מעוקר לאמבט המים כדי לחמם מראש את מגש הזלוף במים חמים. ודא שאין אוויר במגש הזילוף על ידי התחלה עם מגש הזילוף במצב אנכי. במידת הצורך הוסף עוד מים לאמבט המים כדי למנוע עירוי אוויר למגש הזלוף.
    3. הנח את צינור LS25 במשאבה. השאר את שני הקצוות הסטריליים של הצינור בארון הזרימה. מניחים מלקחיים של קוצ'ר בקצה אחד של הצינור ומניחים לנוח על תחתית מגש הזילוף. הניחו גזה סטרילית על גבי הצינור כדי למנוע חסימה. חבר מחבר Luer בקצה הצינור השני.
    4. הוסף כ-100 מ"ל של מדיום רגיל לתוך מגש הזילוף והתחל לשטוף את הצינור במהירות משאבה של 100 מ"ל לדקה.

3. בידוד תאי כליה

  1. הכנת הכליה.
    1. הוציאו את הכליה מהשקיות הסטריליות הכפולות והניחו על מגש הזלוף הסטרילי (איור 1B). הסר את רקמת השומן הפרי-כלייתית ואת קפסולת הכליה בעזרת מספריים וקריעה עדינה (איור 1C) וזהה את עורק הכליה על מדבקת אבי העורקים כפי שמוצג ב-איור 1D.
    2. קנול את עורק הכליה עם ספייק האביזר, תקן עם קרע קשירה מעוקר והצמד לקצה צינור המשאבה עם מחבר Luer בזמן שהמשאבה פועלת. אם הצינורות אינם מלאים לחלוטין, תחילה הוסף עוד מדיום למגש ושטוף את הצינורות על ידי הפעלת המשאבה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1E - F). שטפו את הכליה במדיום רגיל דרך המשאבה בזרימה של 100 מ"ל לדקה.
  2. טיפול בקולגנאז ובידוד תאי כליה.
    1. הוסף קולגנאז (20 מ"ל, >2,000 U) ו-DNase (2.5 מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל) למגש הזלוף (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1גרם). סובב את הכליה מדי פעם בעדינות ביד. המתן עד שהכליה תהיה רכה ונוזל הזלוף יהפוך פחות שקוף (כ- 30 - 40 דקות).
    2. עסו בעדינות את הכליה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1H) עד לקבלת תרחיף תאים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1I). הסר חומר שאינו מעוכל ואת הספייק בעורק הכליה.
  3. שטיפה ואיסוף תאי כליה.
    1. הוסף 50 מ"ל של ה-NHS לתרחיף התאים. רוקנו את תרחיף התאים ממגש הזלוף על ידי הנחת המשאבה בזרימה נמוכה והנחת הצינור המחובר תחילה לכליה מעל צינורות 50 מ"ל (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1J).
    2. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 7 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והסר את הסופרנטנט. שטפו את הכדורים עם מדיום כביסה המכיל 10% NHS ושוב צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 7 דקות. חזור על הכביסה פעם נוספת. מדוד את נפח כדורי התא והוסף נפח שווה של מדיום תרבית תאים.
    3. או לשמר את התאים בהקפאה מכאן על ידי הוספת מדיום הקפאה 1:1 לתרחיף התא ולאחסן בבקבוקונים קריוגניים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, או להמשיך בתרבית התאים (סעיף 4).
      הערה: תרחיף התאים מכיל גושי תאים ודורש שלבים נוספים להשגת תאים בודדים, מה שמביא לעלייה במוות התאים. לכן, התאים נשמרים בתרחיף ואינם נספרים בשלב זה.

4. תרבית תאים של תאי כליה גולמיים

  1. הוסף כ-1 מ"ל של תרחיף התאים ל-24 מ"ל של אלפא MEM 5% טסיות דם (מדיום תרבית תאים) בבקבוק תרבית תאים T175 (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1K) ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. הסר את המדיום ואת פסולת התאים לאחר 2 ימים מהתאים הדבקים ורענן את המדיום עם 25 מ"ל של מדיום תרבית תאים.
  2. רענן את מדיום התרבות פעמיים בשבוע על ידי הסרת מחצית מהמדיום (12.5 מ"ל) והוספת מדיום טרי (12.5 מ"ל) בטכניקות אספטיות.
  3. תרבית עד להתכנסות (בדרך כלל 5 - 7 ד') (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1L). הסר את המדיום, שטוף פעמיים עם PBS ונסה את התאים על ידי הוספת 5 מ"ל טריפסין לכל בקבוק T175 למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. שטפו בתרבית בינונית וצנטריפוגה ב-490 x גרם למשך 5 דקות והוציאו את הסופרנטנט.

5. העשרת תאים עבור NG2 על ידי הפרדת תאים מגנטיים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1M)

  1. הכן את מאגר הפרדת התאים בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  2. השעו מחדש את ה-kPSCs הטריפסינים במאגר הפרדת תאים של 10 מ"ל. צנטריפוגה ב-490 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במאגר הפרדת תאים של 300 מיקרוליטר.
  3. הוסף 100 μL FcR חוסם ריגן/5 x 107 תאים, הוסף 100 μL חרוזי אנטי-מלנומה (NG2) לכל 5 x 107 תאים, ודגירה למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הפרד את השבר החיובי ל-NG2 בהתאם לפרוטוקול היצרן. הוסף 10 מ"ל של תאים בינוניים וצנטריפוגות למשך 5 דקות ב -490 x גרם.
  4. ספור את התאים באמצעות תא ספירה של Bürker לפי פרוטוקול היצרן. זרעו את התאים בבקבוק תרבית (כ-4 x 103 תאים/ס"מ2) ודגרו.
    הערה: זרעו את התאים בריכוזים הבאים: <250,000 בבקבוק T25, 250,000 - 500,000 בבקבוק T75 ו- 700,000 - 800,000 בבקבוק T175. לאחר העשרת תאים מגנטיים, מבודד חלק חיובי של כ -1 - 2%. אולם מאחר ששלב זה הוא העשרת תאים ולא מיון תאים, סוגי תאים אחרים יהיו נוכחים בתרבית (איור1 N). אחרי כמה מעברים (בדרך כלל בסביבות 4-5), רק אוכלוסיית kPSC הומוגנית נוכחת (<מחלקה חזקה="xfig">איור 1P).

6. תרבית של kPSCs

  1. רענן את המדיום פעמיים בשבוע על ידי הסרת מחצית מהמדיום והחליפו אותו במדיום תרבית שזה עתה הופשר (איור 1N).
    הערה: ה-kPSCs נוטים להיות ברי קיימא ומתרבים יותר כאשר רק מחצית מהמדיום עובר רענון.
  2. מעבר של kPSCs.
    הערה: העבירו את ה-kPSCs במפגש של 90-100%, או כאשר מבנים תלת-ממדיים מופיעים (ראו איור 1O), או כאשר לא הייתה גדילת תאים במשך יותר משבוע. שני האחרונים עשויים להופיע במיוחד במעברים מוקדמים לאחר העשרת התאים. במקרה הזה, אחרי המעבר, התאים בדרך כלל יתחילו לגדול שוב בתרבית חד-שכבתית (איור 1P).
    1. הסר את המדיום מהתאים המתכנסים 90 - 100% (שמור את המדיום לשימוש מאוחר יותר). שטפו את הבקבוק פעמיים עם PBS (1 מ"ל ב-T25, 5 מ"ל ב-T75, 10 מ"ל ב-T175). מוסיפים טריפסין (0.5 מ"ל ב- T25, 2 מ"ל ב- T75, 5 מ"ל ב- T175) ודוגרים למשך 5 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים את המדיום הישן לבקבוק ומשרים בעדינות.
    2. העבירו לצינור של 15 או 50 מ"ל (תלוי בנפח) וצנטריפוגה ב-490 x גרם למשך 5 דקות. ספרו את התאים והצלחת הקיימא <250,000 ב-T25, 250,000 - 500,000 ב-T75, או 700,000 - 800,000 ב-T175 (בערך 4 x 103 תאים/ס"מ2).
  3. בדוק את ה-kPSCs במעבר 5 או 6 (למשל, בדיקת שריטות, סעיף 7).
    הערה: אפיין את התאים המופצים על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. ביטוי סמן של NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC צריך להיות חיובי ו-CD31, CD34, CD45 ו-HLA-DR צריכים להיות שליליים. בדיקת מיקופלזמה, חיידקים ופטריות במדיום התרבית על פי פרוטוקולים סטנדרטיים של המעבדה למיקרוביולוגיה קלינית. בדוק את ה-kPSCs מבחינה תפקודית בבדיקת שריטות פצע אפיתל בכליות. ניסויים מבוצעים בדרך כלל עם אוכלוסיות kPSC הומוגניות סטריליות שאושרו על ידי זרימה ציטומטרית עם יכולת ריפוי פצעים בין מעבר 6-8.
  4. שימור בהקפאה של ה-kPSCs על ידי הוספת מדיום שימור בהקפאה של 0.5 מ"ל לתרחיף תאים של 0.5 מ"ל (2 מיליון תאים למ"ל של מדיום תרבית) באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.
    הערה: לאחר ההפשרה, זרעו את ה-kPSCs בצפיפות גבוהה יותר (10-6 תאים ב-T175).

7. בדיקה פונקציונלית של kPSCs: בדיקת שריטות פצע אפיתל בכליות

  1. תרבית את ה-kPSCs בצלחת של 6 בארות בצפיפות של 200,000 תאים/באר במדיום תרבית של 2 מ"ל. לאחר 48 שעות של תרבית ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אספו את הסופרנטנט. זהו המדיום המותנה.
  2. זרע את HK-2 (תאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים)17 ב-2 מ"ל של מדיום תאי אפיתל צינורי פרוקסימלי (PTEC) המורכב מיחס של 1:1 של DMEM-F12 בתוספת אינסולין (5 מ"ג/מ"ל), טרנספרין (5 מ"ג/מ"ל), סלניום (5 ננוגרם/מ"ל), הידרוקורטיזון (36 ננוגרם/מ"ל), טריודוטירינין (40 פ"ג/מ"ל), גורם גדילה אפידרמיס (10 ננוגרם/מ"ל) ועט/סטרפטוקוקוק, בצפיפות של 500,000 תאים לבאר בצלחת תרבית תאים בת 6 בארות.
  3. תרבית במשך 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. הסר את מדיום תרבית התאים של ה- HK-2s וצור פצע שריטות בשכבה החד-שכבתית של HK-2s על ידי ביצוע שריטה עם קצה נקודת פיפטה צהובה מלמעלה לתחתית הבאר. שטפו את ה-HK-2s עם PBS והוסיפו את המדיום המותנה של ה-kPSCs או מדיום הבקרה. סמן בתחתית הצלחת את האזור שיש לצלם.
    הערה: מטוסי ה-HK-2 צריכים להיות מתלכדים. דמיין שני אזורים לבאר.
  4. דמיין את השריטה ב-4, 8, 12 ו-24 שעות באותו מיקום מסומן עם מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך.
  5. מדדו את אזור האחסון הזמני בתמונה J בעזרת הכלי בחירת מצולעים לקביעת אחוזי הסגירה.

תוצאות

שיטת בידוד kPSCs כיתה קליניים מסוכם באיור1. תאי הכליה גולמי מבודדים מן הכליות להשתלה אנושי כיתה מאת collagenase זלוף. התליה תא וכתוצאה מכך הוא תרבותי עד confluent ב 5% טסיות lysates. אז השבר תאי סטרומה perivascular הוא מבודד המבוסס על הביטוי NG2.

kPSCs פלסטיק דמוי פלך תאים חסיד (איור 2א) והם חיובי עבור הסמנים סמני סטרומה CD73, CD90, CD105, perivascular NG2, PDGFR-B ו- CD146, בעוד שלילי CD31, CD34, CD45, ד ר הלע (איור 2B). בדרך כלל, ניתן להגיע אוכלוסיה הומוגנית של kPSCs-מעבר 4, kPSCs להגיע הזדקנות ביולוגית סביב המעבר 9-10 (איור 2C). אנו ממליצים לבצע ניסויים בין המעבר 5-8.

כדי להעריך את יכולת תפקודית של kPSCs מבודדים, אנחנו מבצע של במבחנה כליות אפיתל פצע שריטה assay אצוה החדש של kPSCs, כפי שהראנו בעבר המדיום ממוזגים של kPSCs יכולים להאיץ את ריפוי הפצע אפיתל זו שריטה assay15. המדיום ממוזגים kPSC נעשית על ידי culturing kPSCs במשך 48 שעות, alphaMEM 5% lysates טסיות דם ואיסוף את תגובת שיקוע. בשלב הבא, מונצחים כליה אנושית המקורבת בתאי אפיתל (HK-2)17 מתורבתים עד confluent, ואז נוצר פצע שריטה. לאחר מכן או המדיום ממוזגים של מדיום kPSCs או בקרה נוספת הבארות, למדוד את המהירות של ריפוי הפצע. כשנוספת המדיום ממוזגים של kPSCs, הפצע נסגר מהר יותר באופן משמעותי (איור 2D).

figure-results-1
איור 1 : קליני כיתה בידוד בשיטה של זכויות kPSCs. השתלת כליות כיתה לצינוריות, perfused עם collagenase דרך עורק הכליה (A - G), התליה תא וכתוצאה מכך נשטף, גם cryopreserved או להכניס תרבות (H - K). לאחר התאים להגיע confluency (L), NG2 תא העשרה הוא ביצע (M). התאים הם trypsinized כאשר גם הם confluent, פסקו מתרבים או כאשר מבנים תלת-ממד מופיעים (N - P). הקריטריונים לשחרור kPSCs הן עקרות, סמן ביטוי את היכולת לשפר ריפוי הפצע אפיתל צינורי (Q). חץ: עורק הכליה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2
איור 2: kPSCs אפיון של האדם. ) KPSCs הם תאים חסיד בצורת כישור, פלסטיק. KPSCs B) הן חיוביות לסמני mesenchymal CD73, CD90, CD105, סמנים perivascular NG2, PDGFR-β, CD146, בעוד שלילי עבור CD31, CD34 ו- CD45. kPSCs אקספרס מחלקה MHC אני (הלע-ABC) אבל לא class II (הלע ד ר). C) צמיחה מאפייני שלושה תורמים kPSC שונים של cytometry זרימה אישר הומוגנית NG2 אוכלוסיות חיובי (ב פסקה 4). kPSCs להגיע הזדקנות ביולוגית סביב המעבר 9-10. KPSCs D) מסוגלים לשפר תיקון האפיתל בכליה assay טיוטה הפצע. להחליפן בתמונות של שליטה בינוני, בינוני kPSC ממוזגים-t = 0, 4, 8 ו- 12 שעות מוצגים. בר בקנה מידה א') = מיקרומטר 200, ברה) = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

דיון

תאים Perivascular היה מבודד רבים האנושי מוצק איברים שונים, לרבות הלבלב, שומן, סחוס, ה9,15,של הכליה16. עם זאת, רוב השיטות, מבוססים על דוגמאות קטנות של רקמות, אשר גזור ו שטופלו לאחר מכן אנזימי עיכול. יתר על כן, זה בדרך כלל לא מבוצע עם מוצרים קליניים בכיתה. זה הופך אסטרטגיות אלו פחות מתאים ישירה תרגום קליני שבו כמויות גדולות של תאים קליני-כיתה נחוצים.

הנה אנחנו מראים שיטת בידוד הרומן kPSCs אנושי עבור כל האיברים בהתבסס על זלוף עם אנזימים כיתה קליניים וחומרים. הפרוטוקול הוא ממאמרו של פרוטוקול בידוד לנגרהנס קליניים נמצא כעת בשימוש עבור היישום הקליני שלנו מרכז18.

זוהי שיטת כיתה הקליני הראשון היכן ניתן להשיג כמויות גדולות של kPSCs. ההשתנות תא כממוצע הוא במידה רבה התורם התלויים. עם זאת, כאשר התשואה תא שאנחנו כרגע להשיג של שבריר של התליה תא גולמי של שלושה תורמים שונים הוא אומדן, בתיאוריה, התשואה הממוצעת של 2.7 x 1012 kPSCs לכל תורם יכול להיות מושגת. כפי MSC טיפול מורכב בדרך כלל 2 חליטות תא עם 1-2 x 106 תאים/ק"ג משקל גוף4, המספרים תא מספיקים לטיפול allogenic של מספר חולים.

שלב קריטי אחד בהליך בידוד הוא משך העיכול collagenase. כאשר תקופת העיכול קצרה מדי, יישארו גושים גדולים של רקמות, אשר יהיה קשה יותר לתרבות. כאשר תקופת זלוף הוא ארוך מדי, עלולים להיות שנצפו מות תאים מוגברת. לכן, ברגע הכליה מתחילה להיות רכה ונוזלים פחות שקוף, הכליה מומלץ לעסות בעדינות, יש להפסיק את הטיפול collagenase.

עוד צעד קריטי הוא התרבות של התאים לאחר NG2 תא העשרה. לפעמים אחרי העשרת תא NG2, התאים perivascular אינן מתחילות להתרבות או להתחיל לגדול ב- 3D מבנים. במקרה זה, כאשר התאים הם trypsinized, reseeded, התאים בדרך כלל יתחיל לצמוח בתרבות חד שכבתי.

כמתחילה חומר, שימשו אנושי להשתלה כיתה הכליות שנמחקו בעיקר מסיבות כירורגי. אלה הם איברים פונקציונליים ללא פיברוזיס הגדולות. אנו להכיר שזו עלולה להיות מגבלה כמו זה יחסית נדיר וקשה להשיג מקור איברים. הכליות explanted יכול להיות מקור נוסף; עם זאת, בהתאם לסיבת explantation הכליה, הכליות אלה עשוי להכיל פיברוזיס יותר ובכך myofibroblasts, ולכן צריך לקחת כיוון myofibroblasts עלול להיות מבודדת ותרבותית במקום perivascular תאים.

KPSCs מבודדים עם הפרוטוקול הזה מאפיינים אורגניות-typic עם כליה אפיתל פצע ריפוי קיבולות15, טיפול בתאי עם kPSCs במחלות כליה, השתלת יהיה יישום מעניין בעתיד. למטרה זו, ישנן מספר אסטרטגיות של משלוח המוצר תא התא. האסטרטגיה הראשונה היא העירוי הרביעי של kPSCs, משמש כיום בכל המחקרים הקליניים bmMSC. יישום מעניין נוסף הוא שימוש kPSCs או גורמים מופרש kPSC מכונת זלוף לפני השתלת. בדרך זו, האיכות של הכליה explanted עשוי לשפר את אשר יכול להוביל בתפקוד הכליות משופר לאחר ההשתלה. עבור שתי אסטרטגיות, kPSCs הם מקור תא חדש מעניין לחקור לעומק למטרות קליניות.

גילויים

D.G.L., M.A.E., ו T.J.R. המשויכים בקשה לרישום פטנט לגבי המחקר הזה. המחברים האחרים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה קיבל מימון מתוך תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (האיחוד FP7/2007-2013) תחת גרנט מספר הסכם 305436 סטלר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שקיות בקסטרFenwalR4R-7004
טסיות דם אנושיותחומר עודף בית חולים Sanquin פג תוקף פחות מ -2 d משמש
לונזהבינונית BE12-169F
גלוטמקסתרמו פישר35050038
עט/סטרפטוק;15070063Invitrogen
Codan455609
DMEM-F12טכנולוגיות חיים11320-074
סרום אנושי רגיל (NHS)Sanquin
Hepes 1 MLonzaBE-17-737E
NaHCO3 7.5%LonzaBE17-613E
CaCl< sub>2 1 MSigma-Aldrich10043-52-4
UWBridge to Life32911
HeparinLeo Pharma
קולגנאז NB1 GMP דרגהSERVA17455.03
DMSOSigma AldrichD2650-100ml
וילונות כירורגיים3M NederlandDH999969404
משאבת זלוףMETROHMX007528300
ראש משאבהMETROHMX077202600
מגשבהתאמה אישית
LS25 Masterflex צינורות MasterflexHV-96410-25
אביזר ספייקGambro DASCO6038020
Pulmozyme
25 ס"מ2greiner
75 ס"מ2greiner658170
בקבוק תרבית 175 ס"מ2greiner661160
טריפסיןסיגמהt4174
אלבומין סרום בקר (BSA)SigmaA2153
EDTASigma-AldrichE5134-500g
FcR מגיב חוסםMiltenyi130-059-901
חרוזים נגד מלנומה (NG2)Miltenyi130-090-452
מסננת תאים 70 ומיקרו; mקורנינג352350
עמודות LSMiltenyi130-042-401
מגנט MACSmiltenyi130-090-976
CD34 FITCBD 
CD45 APCBD 
CD146 PEBD 
NG2 APCR& DFAB2585A
CD90 PEBD 
HLA ABC APCBD 
CD105 FITCAncell326-040
HLA DR APCBD 
CD56 PEBD 
CD73 PEBD 
CD31 FITCBD 
CD133 PEmiltenyi130-090-853
PDGF-r מו"פ Dmab 1263
עכבר IgG1 FITCBD עכבר 345815
IgG1 PEBD 
עכבר 345816 IgG1 APCBD 
IgG2b PEBD 
עז אנטי עכבר PEDakoR0480
נתרן אזידMerck822335
DMEM Ham' s F12Gibco31331-028
ITS (אינסולין, טרנספרין, סלניום)SigmaI1884
הידרוקורטיזוןסיגמאH0135
טריודותיריניןסיגמאT5516
גורם גדילה אפידרמיס (EGF)סיגמהE9644
PTEC כליות אנושי מונצח (HK2)באדיבות מ. ראיין, יוניברסיטי קולג' דבלין
טסיות דם ליזאט בהתאמה אישית בקבוקים סטריליים חד פעמיים קורנינג 09-761-11 500 מ"ל צינורות צנטריפוגה PP קורנינג 431123 a-MEM מערכת עירוי זלוף צלוחיות תרבות רוש בקבוק תרבית 690175 555821555485550315555596555555559866555516550257555445345818555743

מקורות

  1. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
  2. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  3. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  4. Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
  5. Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
  6. Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
  7. Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
  8. Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
  9. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  10. Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
  11. Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
  12. Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
  13. Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
  14. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
  15. Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
  16. Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
  17. Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
  18. Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NG2Wound Scratch Assay

מאמרים קשורים