אינדוקציה של דיפרנציאציה נייד תא הדמיה אחת של Vibrio parahaemolyticus שחיין ותאי נחיל

Summary

פרוטוקול זה מאפשר מיקרוסקופית תא בודד של מובחן Vibrio parahaemolyticus שחיין ותאי swarmer . השיטה מייצרת אוכלוסייה של תאים swarmer זמין בקלות עבור ניתוח תא בודד ומכסה הכנה של תרבויות תאים, אינדוקציה של בידול swarmer, הכנת המדגם, ניתוח תמונה.

Abstract

היכולת ללמוד את לוקליזציה תאיים של חלבונים חיונית להבנה של תהליכים סלולריים רבים. בתורו, זה דורש את היכולת להשיג תאים בודדים עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר יכול להיות מאתגר במיוחד כאשר תאים הדמיה הקיימות בקהילות חיידקים. לדוגמה, האדם הפתוגן Vibrio parahaemolyticus קיים כמו קצר בצורת מוט שחין בצורת בתנאים נוזליים כי על פני השטח קשר להבדיל subpopulation של תאים swarmer מוארך מאוד התמחה לצמיחה על משטחים מוצקים. מאמר זה מציג שיטה לבצע יחיד תא פלואורסצנטי ניתוח מיקרוסקופ של V. parahaemolyticus בשני מצבי ההפרש שלה. פרוטוקול זה reproducibly מאוד גורם הפרדה של V. parahaemolyticus לתוך מחזור חיי תא מחזורי ומקל על התפשטות שלהם על פני משטחים מוצקים. השיטה מייצרת התפרצויות של תאים swarmer מובחנת המשתרעת מ tהוא קצה של מושבה נחיל. יש לציין, בקצה מאוד של התנפחות- swarm, תאים swarmer קיים בשכבה אחת של תאים, אשר מאפשר העברת קל שלהם שקופיות מיקרוסקופ ולאחר מכן מיקרוסקופ פלואורסצנטי הדמיה של תאים בודדים. בנוסף, זרימת העבודה של ניתוח תמונות עבור ייצוג דמוגרפי של חברות חיידקים מוצג. כהוכחה לעיקרון, ניתוח של לוקליזציה תאיים של chemotaxis איתות מערכים בשחיינים ותאי swarmer של V. parahaemolyticus מתואר.

Introduction

חיידקים כל הזמן חווים שינויים בסביבה החיצונית שלהם פיתחו מספר טכניקות לשנות ולהתאים את התנהגותם בהתאם. מנגנון אחד כזה כולל את ההבחנה לסוגים שונים של תאים המשלימים טוב יותר את הסביבה המשתנה. בידול לעיתים קרובות כרוך שינויים גדולים הרגולציה של מחזור התא, מורפולוגיה התא, ואת הארגון spatiotemporal של התאים. אורגניזם אחד שיכול לעבור בידול הוא Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus שייך Vibrionaceae , אשר משפחה של proteobacteria כי בדרך כלל מים טריים או מלוחים. Vibrionaceae מופצים באופן נרחב בסביבה וכוללים מספר מינים הגורמים זיהומים בדרכי העיכול בבני אדם, כולל גם cholerae.V Vibrio. Parahaemolyticus הוא אורגניזם dimorphic והוא מסוגל להבדיל לשני סוגי תאים נפרדים כתגובה כדי להתאים את השינויים שלהסביבה חיצונית. בסביבות מימיות, הוא קיים כמו תא שוחה קצר בצורת מוט עם דגלום קוטב יחיד ממוקם על עמוד התא הישן. על פני השטח מגע, בידול לתא swarmer מופעלת. הבדל תאים swarmer כוללת שני שינויים עיקריים: morphogenesis תא swarmer באמצעות עיכוב חלוקת התא, ואת אינדוקציה של מערכת השני flagella. התוצאה היא היווצרותו של תא נחיל, בעל צורה מוטורית ואורך מוארך, אשר יכול להמשיך את סגנון החיים של נחיל, שבו אירועים של חלוקה מביאים לתאי נחילים, או לחילופין להבדיל חזרה לתאי שחיינים.

מספר גורמים דווחו כדי להשפיע או להשפיע על בידול swarmer. הגירוי העיקרי נראה מונע על ידי mechanosensing שבו V. parahaemolyticus משתמש flagell הקוטב כחיישן מישוש המזהה עיכוב של סיבוב על פני השטח קשר, אבל גורמים נוספים מעורבים כמוטוב ¹ . במעבדה, סיבוב של דגלום הקוטב יכול להיות מעוכבת באופן מלאכותי על ידי תוספת של phenamil, אשר חוסם את ערוץ הנתרן מונע סיבוב flagellar, ובכך לגרום swarmer differiation ² . יתר על כן, במחקר מוקדם יותר, Vibrio alginolyticus היה המושרה נחיל על מדיה מוצקה כאשר תאים היו מופצות על המדיום צמיחה בצלחת פטרי חתום עם קלטת פלסטיק ברורה. נייר סינון רווי אלקלי מונע התנפחות תחת תנאים אלה, ומכאן טוען כי אחד או יותר חומצות נדיפות עשוי להיות מעורב אינדוקציה של נחיל. לפיכך, איטום צלחת פטרי עם קלטת פלסטיק מותר ככל הנראה על הצטברות של חומצות נדיפות, נוצר כמו תוצרי לוואי של חילוף החומרים הסלולרי, בתוך שטח הראש של הצלחת. אותו אפקט הושג כאשר H ₂ O ₂ נוספה בינוני הצמיחה במנות אטום אטום על מנת לייצר באופן מלאכותי חומצות נדיפות ידי hydrolysing רכיבי מדיה 3 ^{, 4 , 5} . עם זאת, הזהות של חומצות נדיפות כאלה עדיין לא ידוע. יתר על כן, הוכח כי זמינות עודפת של סידן ⁶ ו-הגבלה ברזל ⁷ הן לשפר את הבדל swarmer והתפשטות על פני משטחים מוצקים. תאים ניתן לרעב ברזל על ידי הוספת המתחם 2,2'-Bipyridyl למדיום הצמיחה, אשר הוכח להשפיע על בידול swarmer ⁸ . הגורמים ידועים לוויסות בידול מיושמים עכשיו בעיצוב של פרוטוקול זה reproducibly גורם V. parahaemolyticus בידול לתוך תאים swarmer ואת התפשטות שלהם על משטחים אגר מוצק.

V. parahaemolyticus בידול כוללת שינויים משמעותיים ויסות חלוקת התא, מורפולוגיה הסלולר, ואת המיקום של מכונות macromolecular כגון flagellA ו chemotaxis מנגנוני - תהליכים שדורשים כל לוקליזציה ספציפית של חלבונים בהתאם מחזור התא. לכן, היכולת ללמוד את לוקליזציה תאיים של חלבונים כאלה חיונית להבנת התהליכים הסלולר הנ"ל. על מנת לבצע מחקרים כאלה מיקרוסקופ פלואורסצנטי על תאים בודדים נדרשת. זה יכול להיות מאתגר במיוחד כאשר תאים הדמיה הקיימות בתוך אוכלוסיות חיידקים צפופים, כמו במקרה של תאים swarmer. היו ניסיונות לגרום להבדל swarmer בתקשורת נוזלית, אשר יכול ליצור תאים בודדים למחקרים מיקרוסקופיים. ואף על ברמת תעתיק תאים אלה גרמו חלקית את התוכנית swarmer-differentiation, הם לא עוברים את אותם שינויים מורפולוגיים ברורים כמו תאים נבדל מובחן לחלוטין גדל על בינוני מוצק ⁸ . מאמר זה מציע פרוטוקול חזק לשחזור של שיטה כדי לגרום swarmer CELl הבחנה על פני אגר. הפרוטוקול מייצר אוכלוסייה של תאים swarmer נגיש בקלות זמין עבור מיקרוסקופ תא בודד וניתוח לאחר מכן. יתר על כן, הפרוטוקול מאפשר מחקרים לוקליזציה של חלבונים שכותרתו fluorescently בשחיין סוגי התאים swarmer (סעיפים 1, 2, 3, 4). בנוסף, פרוטוקול מתאר את זרימת העבודה הבאים על איך לעבד ולנתח את הנתונים שנוצר ניסויים מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המאפשר ניתוח דמוגרפי של חברות חיידקים (סעיף 5).

Protocol

1. הכנה של המוסמכת V. תאים parahaemolyticus ו electroporation של פלסמיד DNA לתוך תאי שחיינים

הערה: בסעיף הבא של הפרוטוקול מאפשר הכנה של תאים המוסמכות אלקטרו ואת electroporation שלאחר מכן של DNA פלסמיד לתאי שחיינים. צעד זה חשוב אם חלבונים ניאון הם להיות ectopically לידי ביטוי פלסמיד.

1. להפר את V. תאים parahaemolyticus מ -80 ° C מניות גליצרול על צלחת אגר LB טרי המכיל 100 מיקרוגרם / אמפצילין מ"ל ו דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
2. למחרת, לחסן 200 מ"ל של LB בינוני עם מושבה אחת של V. parahaemolyticus ו לדגור אותו על 37 מעלות צלזיוס תחת רעידות התנאים עד ₆₀₀ OD של 1.0 הוא הגיע. זה בדרך כלל לוקח 5-6 שעות של הדגירה לתרבות התא להגיע הצפיפות האופטית הרצוי.
3. מיד להעביר את התאים על קרח ו perfOrm כל השלבים הבאים על הקרח ב 4 מעלות צלזיוס מראש צנטריפוגות מקורר.
4. קציר התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 2000 x גרם.
5. מחק supernatant ידי decantation מחדש להשעות את גלולה התא 25 מ"ל של קר כקרח 273 פתרון סוכרוז מ"מ (pH 7.4, שנאגרו עם KOH).
6. קציר התאים שוב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 2000 x גרם. חזור על שתי פעמים נוספות.
7. Re- להשעות את גלולה תא שטף μL 400 של קר כקרח פתרון 273 מ"מ סוכרוז. לאחר מכן, להוסיף גליצרול לריכוז סופי של נפח 15% / כרך. התאים מוכנים כעת electroporation, אבל יכול גם להיות קפוא aliquots של 70 μL ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
8. עבור electroporation, לערבב 70 aliquot μL של תאים המוסמכות אלקטרו עם 100-1,000 ng של DNA פלסמיד ולהעביר את התערובת לתוך קובט electroporation קר כקרח (0.2 ס"מ אלקטרודה פער). בצע electroporation עם ההגדרות הבאות: 25 μF, 2400 V ו 200 Ω.
9. להשעות אתתאים בקובט electroporation ב μL 600 של מרק LB, להעביר צינור 2 מ"ל ו דגירה תוך רעד ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
10. ספין את התאים ב XG 2,000 במשך 5 דקות מחדש להשעות את גלולה μL 100 של מרק LB. מורחים את ההשעיה התא על לוחות אגר LB סלקטיבי המכיל את אנטיביוטיקה הדרושים דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
11. למחרת, לבדוק את צלחות להיווצרות המושבה. מושבות שגדלות לשאת את הגן הנכון אנטיביוטיקה מקודד על פלסמיד והוא יכול לשמש כעת ניסויים נוספים.

2. השראה של התאחדות התאים

הערה: השלבים הבאים מתארים כיצד לגרום להבחנה של V. parahaemolyticus לתוך מחזור החיים של מחזור החיים, וכיצד לעורר התפשטות על משטחים מוצקים.

1. להשעות 4 גרם של אפר הלב (HI) אגר ב 100 מ"ל dDH ₂ O כדי להכין את לוחות נחיל.
2. בזהירות להרתיח את הפתרון אגר HI במיקרוגל לנער את הבקבוק מעת לעת עד אבקת הוא מומס. החיטוי על 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
3. לאחר החיטוי, להתקרר אגר HI ל 60-65 מעלות צלזיוס. הוסף 2,2'-Bipyridyl לריכוז סופי של 50 מיקרומטר (פתרון המניות של 50 מ"מ באתנול 100%). הוסף CaCl ₂ לריכוז סופי של 4 מ"מ (פתרון המניות של 4 M ב DDH ₂ O). במידת הצורך, להוסיף אנטיביוטיקה לתוך הפתרון כדי לשמור על פלסמידים.
   הערה: אם מתכננים להשתמש פלסמיד inducible, להוסיף סוכן גורם לריכוז הסופי שלה.
   זהירות: 2,2'-Bipyridyl: רעילות חריפה (אוראלי, דרמטי, שאיפה). השתמש כפפות ומשקפי בטיחות בעת טיפול זה כימי.
4. יוצקים 30 - 35 מ"ל של הפתרון הסופי אגר HI לתוך צלחת פטרי עגול 150 מ"מ ולתת אגר לחזק.
5. ממש לפני איתור תרבות התא, יבש את צלחת אגר על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות (או עד שאריות נוזלים יש disaPpeared, אבל לא עוד) למעלה מימין עם מכסה פתוח.
   הערה: פעמים ייבוש תלויים מאוד באינקובטור המשמש לוחות מיובשים בכבדות לא יאפשר swarming של V. parahaemolyticus . (שלב זה חשוב מאוד!) צלחות יש להשתמש טרי לא צריך להיות מעל 2 - 3 שעות. לוחות ישנים יהיה יבש מדי כדי לעורר swarming.
6. לחסן כמות קטנה של תאים מקצה מושבה אחת לתוך 5 מ"ל של מרק LB. דגירה התרבות רועדת על 37 מעלות צלזיוס עד OD ₆₀₀ = 0.8 הוא הגיע, זה בדרך כלל לוקח בערך 2-3 שעות. לאחר מכן, התאים מוכנים להיות הבחין על צלחות אגר HI מהמם.
7. ספוט 1 μL של תרבות התא במרכז צלחת אגר HI נחיל ( איור 1 א ).
8. בואו נקודה יבשה ( איור 1 ב ).
9. אטום את הצלחת עם סרט פלסטיק ברור ולוודא כי הוא מחובר היטב, אחרת זה עלול לנתק במהלך הדגירה לילה ( איור 1 ג ).
   הערה: זהחשוב מאוד כי החותם הוא מושלם. הימנע היווצרות של בועות אוויר וקפלים לקלטת כאשר הוא מוחל.
10. דגירה את הצלחת על 24 מעלות צלזיוס למשך הלילה. זה יוביל להיווצרות של מושבה נחיל V. parahaemolyticus עם נחילי- flares משתרע מן הפריפריה של המושבה נחיל ( איור 2 ).

הכנת V. parahaemolyticus תאים Swarmer עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להכין שקופיות agarose מיקרוסקופ ואת ההטבעה הבאים של התלקחויות מתלהטות על משטח agarose להשיג תאים swarmer יחיד למיקרוסקופ.

1. כדי להכין שקופיות agarose עבור מיקרוסקופ, להוסיף 1 גרם של agarose ל 100 מ"ל של 20% כרך / כרך PBS ו 10% כרך / כרך פתרון LB מרק. בזהירות לרתיחה הפתרון במיקרוגל לפזר את agarose ולתת לו להתקרר ל 65-70 מעלות צלזיוס תוך ערבוב עם סטירר מגנטי.
2. מקום acשקופית מיקרוסקופ רזה על החלק ברמה מושלמת של ספסל עבודה. מכסים את שני הקצוות של השקופית עם שתי שכבות של קלטת תיוג כללי תיוג, לתקן את השקופית לספסל העבודה. המרחק בין שתי חתיכות של סרט צריך להיות סביב 3 ס"מ.
   הערה: שתי שכבות של קלטת ליצור גובה קטן מאוד, אשר יקבע את גובה כרית agarose. חשוב כי שטח העבודה הוא ברמה כדי לוודא תאים יהיו באותו מטוס לניתוח מיקרוסקופי.
3. Pipet ~ 250 μL של פתרון agarose מוכן בעבר על משטח זכוכית לא מכוסה.
4. עכשיו במקום שקופית מיקרוסקופ השני באותו כיוון כמו התחתונה אחת על העליונה מעט ללחוץ אותו למטה, כך agarose שיורית יכול לזרום החוצה לצדדים.
5. בואו agarose לחזק 1-2 דקות ואז לאט למשוך את השקופית זכוכית העליון את אחד התחתון בתנועה אופקי.
6. באמצעות אזמל, לחתוך כל agarose שיורית המצורפתהצדדים של השקופית מיקרוסקופ לאט להסיר את הקלטת מקצוות השקופית מיקרוסקופ.
   הערה: שקופית agarose מוכן עכשיו יש להשתמש בהקדם האפשרי כפי שהוא יתחיל לאט להתייבש.
7. כדי לבצע מיקרוסקופיה על תאים swarmer, לחתוך ~ 3 מ"מ x 10 מ"מ חתיכת אגר נחיל מן הקצה החיצוני ביותר של מושבה נחיל ( איור 1D ). חשוב מאוד לא לשבור את החותם של צלחת נחיל עד מיד לפני העברת תאים swarmer לשקופית מיקרוסקופ. לאחר שהסיר מוסר, תאי V. parahaemolyticus המתרחצים מתחילים ליזום את ההבחנה לתאי שחיינים.
   הערה: הקפד לכוון את הקיצוצים מבחוץ של קצה המושבה נחיל אל פנים המושבה ( איור 1D ). בדרך זו ניתן למנוע "זיהום שחיינים" לקצה המושבה נחיל.
8. מעבירים את פיסת אגר נחיל על שקופית agarose מיקרוסקופ עם התאים מול אגרוז הרשותד ( איור 1E ). זה מדמה את התאים swarming על כרית agarose.
9. לאחר המתנה ~ 30 s, להסיר את חתיכת אגר בזהירות מתוך כרית agarose ( איור 1F ).
10. מניחים coverslip זכוכית על כרית agarose שבו התאים היו imprinted. התאים מוכנים כעת למיקרוסקופ.
    הערה: חשוב לתאי swarmer התמונה מיד, מאז תאים swarmer לאט לאט ליזום את ההבחנה למצב שחיין.

הכנת V. parahaemolyticus שחיין תא תרבויות עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי

הערה: סעיף זה של הפרוטוקול מתאר כיצד להכין תרבות של V. parahaemolyticus לבצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי על סוג שחין תא.

1. לחסן כמות קטנה של תאים מקצה מושבה אחת לתוך 5 מ"ל של מרק LB. דגירה התרבות רועדת על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות או עד גידול תאים קל הופך גלוי.
2. בְּבשלב זה, אם יש צורך, להוסיף גורם המניע ביטוי של חלבונים המעניינים. בדוגמה זו, L-arabinose נוספה לריכוז סופי של 0.2% (w / vol) כדי לעורר ביטוי של YFP-CheW ⁹ .
3. דגירה תרבות רועד עבור 2 שעות נוספות ב 37 ° C.
4. בצע את השלבים 3.1-3.7 כדי להכין שקופיות agarose מיקרוסקופית.
5. נקודה 1 μL של תרבות תאים במרכז כרית agarose ולתת את הדגירה נקודה עד שהוא יבש.
6. מניחים coverslip זכוכית על משטח agarose שבו התאים היו מנוקדים. התאים מוכנים כעת להיות צילמו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

5. ניתוח תמונה

חלק זה של הפרוטוקול מתאר זרימת עבודה לניתוח התמונה, במיוחד כיצד לחלץ נתונים הקרינה של תאים בודדים לניתוח הדמוגרפי.

1. לפני תחילת ניתוח התמונה לוודא שכל התמונות מיקרוסקופ נשמרים בפורמט TIF 16bit.
2. טען את DIC (או בניגוד שלב) ואת התמונות המתאימות ערוץ פלואורסצנטי לתוך התוכנה.
3. צור תמונת שכבת על שני הערוצים על ידי בחירה באפשרות "תמונות תצוגה / שכבת על". הגדר את מספר התמונות ("# תמונות:") לשתיים, ובחר את התמונה DIC בערוץ הראשון ואת התמונה פלורסנט בערוץ השני.
4. בחר את "Multi-Line" כלי מסרגל הכלים ואת סימון תאים מקוטב אחד לשני באמצעות באמצע התא. על מנת לקבל רשימה של כל השורות שנוצרו (אובייקטים קו) פתוח "למדוד / מדידות אזור". הגדר את מדידות האזור כדי להציג רק את תווית האזור, המרחק והעוצמה הממוצעת.
5. כייל את גודל פיקסל תחת "למדוד / כיול מרחקים" לגודל פיקסל כי הוא ספציפי עבור הגדרת המיקרוסקופ שלך ולחץ על "החל על כל התמונות הפתוחות".
6. העברת כל האזורים (אובייקטים קו) לתמונת הערוץ פלורסנט. תחת "אזורים / Transfבחר את תמונת המקור (תמונת השכבה) ואת תמונת היעד (תמונת הערוץ הניאון) בחר "כל האזורים" ולחץ על "אישור".
   הערה: כדי להיות מסוגל מאוחר יותר לייצר מחדש את השורות המדויקות (אובייקטים קו, אזורים, ROI), לפתוח "אזורים / שמור אזורים" ולשמור את האזורים.
7. ייצא את כל המדידות באזור לגיליון אלקטרוני על ידי פתיחת "מדידות מדידה / אזור" ולחיצה על "פתח יומן". אשר כדי לפתוח ולייצא את הנתונים. לאחר הגיליון האלקטרוני נפתח ברקע, סוף סוף לייצא את הנתונים על ידי הקשה על "F9: יומן נתונים".
8. כדי לקבוע את המיקום של מוקדי ניאון לאורך התא, פתח "מדוד / Linescan". הגדר "רוחב Linescan" לערך כך שכל רוחב התא יכוסה על ידי האזור שיצרת קודם לכן. לחץ לחיצה ימנית על גרף שורת הסריקה ובחר "הצג נתוני גרף". על ידי לחיצה שמאלית וגרירת העכבר- courser לאורך קו לסרוק אתנקודה של עניין, את "גרף נתונים" חלון יציג את המקביל פיקסל / המרחק בין שתי נקודות. בחר את השורה המסומנת כחול ולאחר מכן להעתיק את התוכן.
   הערה: כל פרופיל עוצמת הסריקה יכול להיות מחובר לגיליון אלקטרוני על ידי לחיצה על "התחבר לנתונים" בחלון "Linescan". הנתונים החילוץ יכול כעת לשמש להדמיה גרפים או ניתוח סטטיסטי נוסף. דפוסי לוקליזציה על מחזור התא יכול להיות דמיינו בקלות ייצוג דמוגרפי של אורך התא ואת עוצמות פלורסנט לאורך הגוף התא. ייצוגים אלה ניתנים להשגה באמצעות אותו החזר ROI שנבחר קודם לכן. השלבים הבאים ייתן דוגמה כיצד ליצור דמוגרפיה דומה לאלה שמוצג באיורים 3C ו 4C .
   1. ב פיג 'י / ImageJ לטעון אזור סימונים (.Rgn) שנוצר בעבר בתוכנה (שלב 5.6) באמצעות "Metamorph nd & ROI יבואנית קבצים"; לחלופין, אזורים של עניין (ROIs) של התאים להיות מנותח ניתן ליצור ישירות פיג 'י / ImageJ באמצעות לבנות ב- "Segmented Line" הכלי.
   2. פתח "ניתוח / כלים / החזר ROI" ולסמן את כל ערכי הרשימה הפעילה ".
   3. לאחר מכן, לחץ על "עוד / רב מגרש" ולאחר מכן בחר "רשימה" בחלון החדש "רב מגרש". לחץ על ערך טבלה, ולאחר מכן בחר "להעתיק הכל". לאחר מכן, הדבק לגיליון אלקטרוני חדש.
      הערה: ודא שהנתונים של התא הארוך ביותר (שני עמודות X ו- Y תואמות עם מספר השורות הרב ביותר) הוא האחרון מימין לגיליון האלקטרוני.
   4. שמור את הגיליון האלקטרוני כ- CSV (מופרד באמצעות פסיק) (* .csv).
   5. הורד את סקריפטים R מכאן "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" ^10. התסריטים מיון תאים לפי אורך לנרמל את הפרופילים עוצמת פלורסנט של כל התאים כממוצע של fluorescenc של כל תאה.
   6. הפעל את התסריט כולו "פרופילים תאים function.R" ב R [גרסה 3.0.1; ¹¹ ].
   7. ערוך את התסריט "לדוגמה plots.R" בקו 30 כך שבנתיב הקובץ מתייחס לתיקייה שבה נשמר קובץ ה- CSV שנוצר. בנוסף, שנה את שם הקובץ "profile.csv" בשורה 31 לשם הקובץ שנבחר עבור קובץ .csv שנוצר בשלב 5.9.4. לאחר מכן, להפעיל "plots.R לדוגמה" ופעל בתיעוד מ "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles", כמו גם את ההערות של קובץ סקריפט כדי ליצור ניתוח דמוגרפי.

Results

אינדוקציה של בידול ודור של מושבות נחפזות

איור 1 מספק סכימה של השלבים החשובים מעורב בהפקת מושבות נחיל של V. parahaemolyticus ( איור 1A-C ). תרבות שחיינים זוהה על נחיל אגר ו מודגרות על 24 ^מעלות צלזיוס, גרימת הבדל swarmer והתפשטות על פני השטח אגר מוצק. בתמונה מס '2 מוצג תמונה סטריאו-מ...

Discussion

מאמר זה מדווח על שיטת הדמיה מיקרוסקופית של תאים V. parahaemolyticus swarmer , ואחריו מנתח במורד המיועד לפתור לכמת את לוקליזציה subcellular ותכונות אחרות של חלבונים שנחקרו fluorescently שכותרתו. למרות מספר כלים קיימים לעיבוד תמונה מיקרוסקופית וניתוח ^{14 , 15 , 16 , 17 , 18} , ניתוח של תאים בתאי V. parahaemolyt...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>רכיבי מדיה
LB בינוני	Roth	X968.3
Difco Agar, מגורען	BD	214510	להכנת אגר LB עם LB
בינוני Difco Heart Infusion Agar	BD	244400	להכנת צלחות נחיל HI אגר
Agarose NEEO, רוט איכותי במיוחד		2267.3	להכנת מיקרוסקופיה רפידות אגרוז
שם	חברה	מספר קטלוגי	Comments
>תוספים
L-arabinose	Roth	5118.3	משמש להשראת נגזרות pBAD
2,2'-Bipyridyl	סיגמא אולדריץ'	D216305-25G	להכנת צלחות נחיל HI אגר
סידן כלוריד דיהידראט	רוט	5239.1	להכנת צלחות נחיל HI אגר
מלח נתרן אמפיצילין	רוט	K029.3
כלורמפניקול	רוט	3886.3
PBS מאגר	-		מתכון סטנדרטי למי מלח
D(+) סוכרוז	רוט	4621.1	להכנת תאים בעלי יכולת חשמלית
גליצרול	רוט	3783.5	להכנת תאים בעלי יכולת חשמלית
<חזק>שם	<חזק>חברה	<חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
<חזק>חומרה
צלחת פטרי 150 מ"מ על 20 מ"מ עם מצלמות	Sarstedt	82.1184.500	להכנת צלחות נחיל HI אגר
kelvitron t (B 6420)	Heraeus-משמש		לייבוש צלחות נחיל HI agar
Gene Pulser Xcell Microbial System	BioRad	1652662	משמש לאלקטרופורה של DNA פלסמיד
שם<	strong>חברה	Catalog Number	Comments
Software
MetaMorph Offline (גרסה 7.7.5.0)	התקנים מולקולריים-בשימוש		לניתוח תמונות מיקרוסקופיה
Excel		Microsoft-משמש	לאנלזה של נתוני מיקרוסקופיה