הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בבדיקה היסטולוגית ו echocardiographic של מורפולוגיה לב העכבר

22.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55843

⸱

26 באוקטובר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Université Côte d’Azur, CNRS, INSERM, iBV, 2Department of Pathology, CHU Nice, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

במאמר זה

סיכום

בדיקה echocardiographic משמש לעתים קרובות בעכברים. מכשירי אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה יקר פותחו למטרה זו. פרוטוקול זה מתאר הליך echocardiographic סבירים בשילוב עם morphometric היסטולוגית ניתוחים כדי לקבוע מורפולוגיה לב.

תקציר

מספר גדל והולך של מודלים מהונדס גנטית העכבר הפך זמין בשנים האחרונות. יתר על כן, מספר מחקרים שבוצעו בעכברים הוא גבוה. אפיון פנוטיפי של מודלים אלה העכבר גם דורש הבחינה של תפקוד הלב ואת מורפולוגיה. אקוקרדיוגרפיה דימות תהודה מגנטית (MRI) גישות נפוצות כדי לאפיין מורפולוגיה בעכברים ותפקוד הלב בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. ציוד Echocardiographic ו- MRI המתמחה בשימוש מכרסמים קטנים הוא יקר ודורש שטח ייעודי. פרוטוקול זה מתאר מידות הלב בעכברים באמצעות מערכת echocardiographic קליניים גשש כלי דם אנושי 15 מגה-הרץ. המדידות מבוצעות על עכברים בוגרים מורדם. רצפי תמונות לפחות שלושה מוקלט, נותחו עבור כל בעל חיים במצב M בתצוגת ציר קצר מתחת. לאחר מכן מבוצעת בדיקה היסטולוגית הלב, קטרים cardiomyocyte נקבעים ב hematoxylin-agglutinin eosin - או נבט חיטה (WGA)-פרפין סעיפים מוכתמים. צפיפות כלי הוא נחוש morphometrically אחרי immunostaining Pecam-1. הפרוטוקול עבר בהצלחה שימושית ללימודים תרופתי ושונה גנטי מודלים בעלי חיים בתנאים בסיסית, כמו גם לאחר ניסיוני אוטם שריר הלב על ידי מצדו קבוע של השמאלי הקדמי היורד עורקים ( LAD). מניסיוננו, חקירה echocardiographic מוגבל לבעלי מרדימים, הוא ריאלי בעכברים בוגרים במשקל של פחות 25 גרם.

מבוא

מגוון רחב של מודלים מהונדס גנטית עכבר זמינים, מספר מחקרים בעכברים גבוהה1,2. אקוקרדיוגרפיה MRI הגישות הנפוצות עבור אפיון פנוטיפי מורפולוגיה של מודלים אלה עכבר3ותפקוד הלב בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. המטרה של פרוטוקול הציג היא לנתח את תפקוד הלב ואת מורפולוגיה בעכברים בוגרים. הוא משלב echocardiographic, היסטולוגית, מדידות immunohistochemical. בדיקה echocardiographic נעשה שימוש נרחב עכברים4,5,6,7,8,9,10,11, 12. . Pachon et al. 11 מזוהה 205 מחקרים שפורסמו בזרימת הדם, זרימת הדם מחקר, כתב העת האמריקאי לפיזיולוגיה - פיזיולוגיה הדם והלבומחקר לב וכלי דם בין 2012 ו 2015 זה שימוש בבדיקה echocardiographic בבעלי חיים.

אקוקרדיוגרפיה משמש לזיהוי פנוטיפים לב עכברים מהונדסים5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, כמו גם וניתוח תפקוד הלב אצל היפרטרופיה הנוצרות על-ידי עומס יתר כרונית, איסכמיה בשריר הלב, ומודלים של שריר הלב בעכברים (נבדקה12). ציוד אקוקרדיוגרפיה משופר מאפשר המדד הסטנדרטי של שמאל-חדרית (LV) בהתכווצות והתרחבות של מידות, הדמיה דופלר רקמות, ניגודיות שריר הלב echography את ההערכה של הפונקציה אזוריים LV ושמורת כלילית 12. באופן אידיאלי, יש לבצע בדיקה echocardiographic בעכברים בהכרה כדי למנוע את ההשפעות השליליות של הרדמה על הפונקציה כויץ, שליטה רפלקס אוטונומי, ולדרג את הלב11. עם זאת, גישה זו הוא מוגבל על ידי הדרישה לאמן את החיות; קשיים בשמירה על טמפרטורת הגוף יציב; תנועת חפצים; לחץ; תדרים לב גבוהה מאוד; את הדרישה לפחות שני חוקרים כדי לבצע את הניסוי, במיוחד אם מספר גדול של בעלי חיים נמצאים תחת חקירה. מעניין, מחקר שנערך לאחרונה דיווח אין הבדלים בפרמטרים echocardiographic מיומנים ובעלי לא מאומן19. אנו מבצעים מדידות echocardiographic בעכברים מורדם. פרוטוקולי הרדמה שונות יידונו להלן.

למרות אקוקרדיוגרפיה ברזולוציה תקנית (> 10 מגה-הרץ) היא מספקת מידה LV סיסטולי, דיאסטולי מידות, תפקוד הלב בעכברים מבוגרים, השיטה היא מוגבלת בתיאור שלה התופעות המבנית הבסיסית. לפיכך, אנו משלבים את המידות ויוו עם היסטולוגית וניתוחים immunohistological כדי למדוד, לדוגמה, צפיפות cardiomyocyte בקוטר של כלי השיט. חקירות היסטולוגית ו immunohistological אחרים, כגון הקביעה של התפשטות, בחינת אפופטוזיס, מדידות גודל לאוטם, קביעה של פיברוזיס, ועל חופש הביטוי סמן ספציפיים, ניתן גם לבצע את אותו סוג של עובד הרקמה אך אינם הנושא של פרוטוקול זה. השילוב של ויוו echocardiographic בדיקה היסטולוגית ניתוחים מספק תובנות נוספות המשמשות כבסיס שינויים מבניים. בצעד נוסף, אנחנו יכולים להשלים מדידות אלה עם חקירות מולקולרית ומבניים אולטרה. ניתוחים היסטולוגית לא רק להשלים את הבדיקה echocardiographic, אלא גם להפוך חיוניות כאשר הרזולוציה של אקוקרדיוגרפיה אינה מספיקה. זהו המצב, מודלים של עכברים מהונדסים כי הם מתחלקים קטלני23,24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הניסויים המתוארים כאן בוצעו בהתאם החוקים הרלוונטיים לרווחת בעלי החיים מוסדיים ו צרפתי, קווים מנחים ומדיניות. . הם אושרו על ידי ועדת האתיקה צרפתי (Comité Institutionnel d ' Ethique Pour l ' חיה de Laboratoire; מספר NCE/2012-106).

1. אקו

  1. לקבוע את משקל הגוף של העכבר באמצעות איזון מעבדה סטנדרטיים תוך החזקתה בקלילות בזנבו כדי להבטיח מיקום מתאים.
  2. עזים ומתנגד החיה על ידי הזרקה בקרום הבטן (i.p.) של 50 מ"ג/ק"ג פנטוברביטל 25 , 26-
    הערה: כל סוג אחר של הרדמה יכול לשמש אם באותו הפרוטוקול משמש לאורך כל המחקר. יתרונות וחסרונות יידונו להלן.
  3. תחזיר העכבר בתוך כלוב משלו ולחכות עד שזה לא מגיבה, זה מראה נשימה קבועה, הרגל האחורית רפלקסים נעדרים. כדי לבדוק את זה, לסחוט את הרגל מעט ולבחון אם הרגל עדיין המופרע.
  4. לגלח בצד השמאלי של בית החזה, בית השחי השמאלי באמצעות מכונת הגילוח מסחרי של מכרסם.
    הערה: השימוש מכונת הגילוח מכרסמים ייעודי מאפשר הסרה מלאה של השיער העכבר בסדר כדי למנוע הפרעה במדידה echocardiographic. בקרם להסרת שיער מסחרי או פתרונות יש להימנע, ככל שהם נמצאים בדרך כלל מבושם, אשר יפריע החיה לאחר הוא מתעורר. להימנע גילוח מוגזמת, שכן היא מגבירה את איבוד החום.
  5. לשים את החיה שינה על משטח חם מוגדר 40-42 ° C בתנוחת צד שמאל רדוד, עם הראש 12 o ' השעון ואת הזנב-6 o ' השעון. לתקן את הזרוע השמאלית וברגל שמאל, הזנב עם קלטת.
  6. החל להתחמם מראש אקוקרדיוגרפיה ג'ל עלו על החזה המגולח ראש המתמר.
  7. מקום המתמר השמאלית מתחת, מכוון אותו לצד ימין של הצוואר כדי לקבל מבט ארוך-ציר מימדי מתחת (2D) ברמה של השריר papillary. הפעל המתמר ב- 90° עם כיוון השעון כדי לקבל מבט קצר-ציר ברמת השריר papilary. השתמש בהגדרה עומק מינימלי זום כדי למקסם את איכות התמונה וקצב המסגרות. להגדיר את מהירות סריקה למקסימום.
    1. כדי להשיג אלה הגדרות, זום שונים ועומק הגדרת אפשרויות עשוי לשמש, בהתאם המחשב והתוכנה. הרשומה מונחה 2D M-mode תמונות בקצר-ציר להציג 27. עיין איור 1A ו- B 27.
      הערה: לטפל כדי למנוע הפעלת לחץ יתר בחזה, כמו זו עלולה לגרום איטי.
  8. שיא לפחות 3 סדרות של 3 לולאות cine היכו לב עבור כל חיה.
    הערה: עבור התוכנה echocardiograph השתמשו במחקר זה, לחץ " רכוש/שמירה " כפתור פעם אחת בלבד. מתודולוגיה זו היא ספציפית echocardiograph עם תוכנה מסוימת זו. חבילות תוכנה אחרות ניתן להשתמש עם מכונות שונות.
  9. אחרי הקלטות מוצלחות, לנגב אקוקרדיוגרפיה ג'ל מן העכבר החזה, כרית החימום, מתמר. הוצא את הקלטת איבריו ואת הזנב.
  10. להשאיר את העכבר תחת השגחה על משטח חימום, מכוסים רקמות כדי להימנע מיותר אור חשיפה חום וירידה, עד שהוא מתעורר למעלה
  11. תחזיר החיה לכלוב שלו.
  12. נתח הקליט M-mode תמונות מתצוגת קצר-ציר מתחת כדי לקבוע השמאלי-חדרית (LV) מידות ותפקוד. למדוד את עובי הקיר הקדמי LV סיסטולה, diastole (LVAWs ו- LVAWd), של LV פנימי סוף סיסטולי, דיאסטולי הקטרים (LVIDs ו- LVIDd), את עובי הקיר האחורי LV (LVPW) ב סיסטולה ושימוש diastole (LVPWs ו- LVPWd) זיהוי של הממשק רקמת דם על התמונות המאוחסנות.
  13. למדוד את ממדי הדיאסטולי בזמנו של לכאורה מקסימלי LV הדיאסטולי הממדים, LV מידות סוף סיסטולי בזמנו של הסיור סיסטולי הקדמי ביותר של הקיר האחורי LV. להקיש על מסך המגע על " ניתוח " סמל ולאחר מכן, ב " LVAWd " סמל. הצב את caliper אלקטרונית על הממשק בין את חלל נכון חדרית, בקיר הקדמי LV ב diastole.
  14. למקם את caliper אלקטרונית על הממשק בין הקיר הקדמי LV את חלל LV כדי להשיג את עובי הקיר הקדמי הדיאסטולי LV; התוכנה תעבור ישירות למדידה דיאסטולי פנימי LV.
  15. למקם את caliper על הממשק בין החלל LV הקיר האחורי LV להשגת הקוטר הפנימי LV דיאסטולי; התוכנה תתחלף מדידת עובי הקיר האחורי LV.
  16. למקם את caliper על הממשק בין הקיר האחורי LV הכפורת כדי להשיג את עובי הקיר האחורי הדיאסטולי LV. עבור LV מידות סיסטולי, הקש על מסך המגע " LVAWs " סמל והמיקום caliper אלקטרונית על הממשק בין את חלל נכון חדרית הקיר הקדמי LV סיסטולה.
  17. למקם את caliper אלקטרונית על הממשק בין הקיר הקדמי LV את חלל LV כדי להשיג את עובי הקיר הקדמי סיסטולי LV. חזור על התהליך כפי שמתואר לעיל עבור LV קוטר פנימי סוף סיסטולי ו את עובי הקיר האחורי סיסטולי LV. להשתמש אמנת מתקדמים שאומצה על ידי האגודה האמריקאית של אקוקרדיוגרפיה כדי לאתר את גבולות endocardial ו- epicardial 13 , 27-
    הערה: LV הפונקציה כויץ פרמטרים אוטומטי יחושב באמצעות המדידות הקודם. בעירוי החלקי קיצור (FS) מוגדר FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. השבר פליטה LV (EF) מחושב עם הנוסחה Teicholz שונה, שבו EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. עיין איור 1A ו- B.
  18. לאחסן את הנתונים על תקליטורים או מקלות זיכרון USB, ליצור עותקי גיבוי.
  19. ייבוא, לנתח, ולייצא את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה-
    הערה: לאחר מדידות אלה בסיסית, הניסוי ניתן להשהות. אם ביצוע השוואה ישירה בין ההסתרה חיות פראי-סוג הארנבונים מאותה, להמשיך עם ניתוח היסטולוגית 6. עבור Cre-ERT2; קווים העכבר לקס/סלומון, להמשיך למחרת עם טמוקסיפן אינדוקציה בזריקה i.p., כפי שמתואר 5 , 24. אם גרימת ניסיוני אוטם שריר הלב על ידי מצדו של העורק השמאלי 5 , 28, הניתוח יכול להתבצע ישירות אחרי המדידות echocardiographic, כאשר העכברים הם תחת הרדמה. אחרת, עיכוב המינימלי של שבוע בין שני סיבובים של הרדמה צריך להישמר להגביל את שיעור lethality שלאחר הניתוח.

2. הכנה של הלב דגימות הערכה היסטולוגית

  1. להקריב את החיות מאת נקע בצוואר הרחם. מודדים את משקל הגוף שלהם. לחטא את החזה והבטן בעזרת מקלון אלכוהול 70%-
  2. לבצע חתך רוחבי של העור 1 ס מ דיסטלי עצם החזה. בעזרת מלקחיים בוטה, מסירים את העור מבית החזה, מתקדם בכיוון של הראש. להחזיק את עצם החזה בקלילות עם מלקחיים בסדר ולפתוח את הסרעפת על-ידי הוספת הצד הקהה של מספריים בסדר.
  3. לחתוך את כלוב הצלעות משני הצדדים מקביל לעצם החזה. להזיז את עצם החזה לכיוון הראש. אתר הלב בבית החזה. להחזיק את תא המטען כלי הדם של הלב עם המלקחיים בסדר. ולחתוך שלהלן באמצעות מספריים בסדר.
  4. פתח את התיבה, נכנסים בלב שלם מתוך בית החזה, למדוד את המשקל הלב, ולהקים משקל הלב לגוף יחס 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /מה המצב >.
  5. תיקון הלב 2 מ של פתרון פורמלין במאגר נייטרלי 10% 15-mL צינורות ללון ב- 4 מעלות צלזיוס
    זהירות: סכנה! עבודה עם פורמלין פתרונות חייב להיעשות בשכונה fume כימיים; ללבוש כפפות בטיחות משקפיים.
    הערה: ככל הרכב המאגר לפתרונות פורמלין משתנה עם ספקים שונים, השתמש הספק זהה לאורך כל המחקר.
  6. למחרת, לחתוך את הלבבות ב מישור רוחבי, באמצע, ולהעביר אותם לתוך קלטות להטבעת פרפין, אשר מתבצע במעבדה לפתולוגיה בעזרת מכשיר ההטבעה אוטומטיות.
  7. לבצע חלוקתה.
    1. סעיף פרפין חוסם-עובי של 3 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום לצוף אותם במים 40 ° צלזיוס אמבט המכיל מים מזוקקים.
    2. להעביר את הסעיפים על שקופיות. לאפשר שהשקופיות לילה יבש בחממה 37 ° C ואחסן אותם ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.
      הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן עד שהמשתמש יהיה מוכן עבור צביעת (שלב 3).
  8. Deparaffinize, נוזלים הרקמה שקופיות.
    1. למקם את השקופיות מכתים צנצנות עם הוספת זכוכית בתנור 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להמיס את הפרפין.
    2. Deparaffinize השקופיות שני שינויים של 200 מ של קסילן או קסילן תחליף 5 דקות כל אחד.
      התראה: דליק מאוד, רעיל! לעבוד בשכונה fume כימיים; ללבוש כפפות בטיחות משקפיים.
    3. להעביר את השקופיות 200 מ ל 100% אלכוהול. שני שינויים במשך 3 דקות כל ולהעביר פעם דרך 200 מ ל אלכוהול 95% עבור מינימום 3
      התראה: דליק! להרחיק מקורות להצתה; אסור לעשן.
    4. לשטוף פעמיים ב 200 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) למשך 5 דקות כל אחד, המשך לשלב 3, 4 או 5.

3. Hematoxylin ואאוזין מכתים

  1. לשטוף את השקופיות עם מקטעים שלהם במים מזוקקים.
  2. כתם הגרעינים עם פתרון hematoxylin מינימלית 8
  3. שטיפה במים מהברז במשך 10 דקות
  4. כתם עם פתרון eosin 2 דק.
  5. Dehydrate שלוש פעמים למשך 2 דקות ב- 100% אתנול (EtOH). נקה שלוש פעמים למשך 2 דקות קסילן או תחליף קסילן. הר במדיום הרכבה מבוססי קסילן.
  6. לצלם את השקופיות ולמדוד את הקוטר cardiomyocyte ברמה של הגרעין של סעיפים האורך של מחצה interventricular. למדוד לפחות מאה תאים לכל סעיף בשלושה מקטעים לכל לב.

4. WGA מכתים

  1. דגירה השקופיות המתקבל שלב 2.7 עם tetramethylrhodamine (או צבעי פלורסנט אחרים)-מצומדת WGA (בטחונות ב- PBS) עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר בתוך תא לחה.
  2. לשטוף שלוש פעמים עם PBS למשך 5 דקות כל אחד.
  3. הר עם פלורסצנטיות טעינת המדיה המכילה דאפי. חנות ב 4 ° C בחושך לפני ניתוח.
    התראה: לענוד הגנה העין וכפפות עמידים כימית תואם.
  4. לצלם את השקופיות.
    1. שימוש במיקרוסקופ מצוידים פלורסצנטיות epi-תאורה, פילטר מגדיר של דאפי, tetramethylrhodamine (עיין טבלה של חומרים). הגדר את הצמצם המרבי ובהירות auto-חשיפה.
    2. רכוש נפרד תמונות בהגדלה x 400 הכחול, הערוצים אדום. לפתוח את התמונות ב- ImageJ. לכוונן את הבהירות וחדות במידת הצורך (תמונה > התאם > בהירות/ניגודיות).
    3. להגדיר את התמונה בכל 8 סיביות (תמונה > סוג > 8 סיביות). שכבת-על דאפי ותמונות WGA. השתמש ערוץ הצבע הכחול דאפי, ערוץ הצבע האדום עבור WGA; מוגדר אף אחד הערוצים אפור וירוק (תמונה > צבע > למזג ערוצי) 31-
  5. לקבוע על הקוטר cardiomyocyte ברמה של הגרעין בסעיפים רוחבי של מחצה interventricular.
    1. קבע קנה המידה של התמונות ב- ImageJ. למטרה זו, לצלם אובייקט של גודל ידוע (למשל, תא hemocytometer בהגדלה אותו כמו הסעיפים לב; שלב 4.4).
    2. השתמש בכלי קו ישר כדי לצייר קו מתחילתו ועד סופו של המבנה הידוע (נתח > לקבוע קנה מידה).
      הערה: המרחק בפיקסלים יוצגו באופן אוטומטי; מרחק ידוע של יחידת אורך יצטרך להזין. להמשיך עם מדידות cardiomyocyte ברמה של הגרעין.
    3. לצייר קו ישר של קרום WGA-חיובית דרך גרעין דאפי-חיוביות לאתר הנגדי של קרום התא WGA-חיוביות (נתח > מידה). בחלון ' תוצאות ', ודא שהערכים אורך יש מספר המקומות העשרוניים (נתח > לקבוע מידות > מימין לנקודה העשרונית).
      4. תאים
    4. למדוד לפחות 100 לכל סעיף בשלושת המקטעים בכל לב. לייצא את התוצאות ל- Excel (לחץ על תוצאות > קובץ > שמור בשם >. csv) 6 , 31-

5. Pecam-1 Immunostaining

  1. לבצע חשיפת פרצופו האמיתי אנטיגן.
    1. להוסיף 1,600 מ של סודיום ציטרט מאגר (ציטראט נתרן 10 מ מ, 0.05% Tween 20, pH 6.0) כדי סיר לחץ. מניחים סיר הלחץ על פלטת הבישול והפעל אותה במלוא העוצמה. לא לאבטח את המכסה של סיר הלחץ בנקודה זו; פשוט לנוח זה למעלה.
      התראה: חם!
    2. ברגע המאגר סודיום ציטרט רותח, להעביר את השקופיות מהשלב 2.5 סיר הלחץ. לאבטח את מכסה סיר לחץ. ברגע סיר הגיעה בקילוח, המתן עד 7 דקות. כאשר 7 דקות שחלפו, לבטל את פלטת הבישול ומניחים סיר הלחץ בכיור ריק. להפעיל את שסתום שחרור לחץ, לשפוך מים קרים על סיר. ברגע זה מבטל את מווסת, פותחים את המכסה וניתקל מים קרים התנור במשך 5 דק. המקום השקופיות ב 200 מ של PBS.
      הערה: לחלופין, מיקרוגל אנטיגן חשיפת פרצופו האמיתי יכול לשמש, למרות הסיכון של התחממות יתר הוא גדל.
  2. שימוש 0.3% חמצן ב מתנול כדי לחסום פעילות peroxidase אנדוגני עבור 5 דק. לשטוף את השקופיות עבור שלוש פעמים למשך 2 דקות כל 200 מ ל- PBS.
    התראה: דליק ולא רעילים!
  3. דגירה השקופיות למשך 15 דקות מדולל נורמלי חסימה סרום (נסיוב עז רגילה 5% ב- PBS) המכיל גם של בלוק אבידין (4 טיפות ב- 1 מ"ל).
  4. ברז הנוזל מן הסעיפים ובזהירות דגירה אותם עם נוגדנים Pecam-1 מארנב, 1:50 מדולל ב- PBS המכילה 2.5% עז נורמלית בסרום, 4 טיפות של ביוטין בלוק לכל mL. דגירה השקופיות ללון בחדר לחים ב-4 מעלות צלזיוס
  5. לרחוץ את השקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב- 200 מ ל- PBS. דגירה הסעיפים עם biotinylated עז ארנב אנטי איג 1:200 נוגדן מדולל ב- PBS המכילה 2.5% סרום עז הרגיל לשעה בטמפרטורת החדר. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב- 200 מ של PBS.
  6. דגירה tסעיפים הוא עם מערכת מבוססת אבידין/ביוטין peroxidase למשך 20 דקות (ריאגנט A ו ריאגנט B צריך להיות משולב 30 דקות מראש לשימוש). לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב- 200 מ של PBS.
  7. להמיס 1 3,3 '-diaminobenzidine (DAB) ו חמצן אוריאה 1 הלוח תוך 5 מ ל מים מזוקק פעמיים. דגירה הסעיפים DAB פתרון כ- 3 דקות, בזהירות ניטור צבע פיתוח. לעצור את תגובת צבע ע י שטיפת בעדינות את השקופיות ב- 200 מ של PBS.
    התראה: מסרטנים; יש ללבוש כפפות עמידות כימית!
  8. Counterstain הגרעינים במשך 6 דקות עם hematoxylin. יש לשטוף במים ברז עבור 2 דק Dehydrate שלוש פעמים למשך 2 דקות כל זורמים ב 200 מ ל 100% אלכוהול. נקה שלוש פעמים למשך 2 דקות בתוך כל 200 mL של קסילן או תחליף קסילן. הר במדיום הרכבה מבוססי קסילן.
  9. לצלם את השקופיות (לפחות 10 שדות בהגדלה 40 x מ מחצה interventricular של כל לב) ולמדוד את הצפיפות באזור Pecam-1 באמצעות תוכנת ImageJ זמינה בחופשיות 31. להשתמש תוסף צבע deconvolution 32 DAB ו hematoxylin ולהתאים את חדות התמונה לרמה זהה.
    הערה: במקרה חום וצבע סגול/כחול יש חפיפה ספקטרלי משמעותיים, אשר עשויים לגרום קשיים עם צבע deconvolution, אחד יכול לנסות סוגים שונים של פתרון hematoxylin להשיג ברור, כחולות-צביעת גרעינית. לחלופין, immunofluorescence או ספירה ידנית של הנימים יכול להתבצע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1, הקלטות echocardiographic נציג מדגימים את התועלת אקוקרדיוגרפיה כדי לזהות פנוטיפים הלב בעכברים מהונדסים. ניתן בקלות לזהות את ההבדל בין עכבר עם תפקוד הלב תקין (איור 1 א') חיה עם החדר השמאלי מורחבים, LV מופחתת פונקציה (איור 1B). איור 2 מציג ההשוואה של cardiomyocyte מידות קוטר בבעלי חיים בלי (איור 2 א) ועם היפרטרופיה (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטות שונות פותחו כדי להעריך את מבנה הלב ותפקודו בעכברים, כולל אקוקרדיוגרפיה חדות משופרת MRI, מיקרו CT, סריקת PET. בשל העלות האפקטיביות שלה פשטות, אקו הוא הטכניקה הנפוצה ביותר לניתוח פונקציונלי עכברים11. באופן כללי, בגלל גודלו הקטן של הלב ואת תדירות גבוהה של קצב הלב בעכברים, מתמרים עם תדירות > 10 מגה-הרץ אמור לשמש, למרות מידות מוצלחת דווחו עם 8 או 9 מגה-הרץ מתמרים4,7 . כמו תפקוד הלב קשורה קשר הדוק טמפרטורת הגוף ותדירות לב, חשוב לשלוט פ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

העבודה נתמך על ידי הממשלה הצרפתית (סוכנות המחקר הלאומית, ANR) דרך התוכנית "השקעות עבור העתיד" LABEX SIGNALIFE (הפניה ANR-11-LABX-0028-01) ויוצקים על ידי מענקים ק' וו ד מ האגודה la Recherche sur le סרטן, Fondation דה פראנס, לתכנן Inserm סרטן. ד B. נ א קיבלו מלגות את Fondation pour la Médicale רשרש ומן העיר ניס, בהתאמה. Echocardiograph את המתמר היו מתבקשים המסופקים על ידי פיליפס. אנו מודים Borderie א, ס Destree, מ Cutajar-Bossert, א Landouar, א Martres, Biancardini א ו ס מ וגנר לסיוע טכני מיומן שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נבט חיטה אגלוטינין (WGA) מצומד טטרמתילרודמיןטכנולוגיות חיים, בדיקות מולקולריותW849
עז ביוטינילציה אנטי-ארנב נוגדן IgGVectorlabsBA-1000
אבידין / ביוטין ערכת חסימתVectorlabsSP-2001
ערכת VECTASTAIN Elite ABC HRP (פרוקסידאז, סטנדרטי)VectorlabsPK-6100
VECTASHIELD Antifade מדיום הרכבה עם DAPIVectorlabsH-1200
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine טבליותSigmaD4168
תמיסת מי חמצןSigmaH1009
Anti-Pecam-1 (CD31) נוגדןAbcamab28364
ג'ל העברת אולטרסאונד, ג'ל Aquasonic 100Parker
בדיקת אולטרסאונד ליניארית, אקו לב L15-7ioPhilips Healthcare
, IE33 xMATRIXפיליפס
ערכת מסנני פלואורסצנציה Leica
TxRLeica11525310
תוכנת הדמיית הדמיה
, SPOT 5.2 תוכנה מתקדמת ובסיסיתהדמיה
מספריים עדינים
מספריים גדוליםFine Science Tools14501-14
להבי אזמלFine ScienceTools 10023-00
Graefe ForcepsFine Science Tools11650-10
מכונת גילוח מכרסמיםמכשיר הרווארד34-0243
קלטות להטמעת פרפיןסאקורה4155F
ניטרלי מאגר פורמליןסאקורה8727
קסילןסאקורה8733
Paraffine TEK IIIסאקורה4511
מכשיר הטבעה אוטומטי, תחנת הטמעת פרפין Tissue-Tek VIPSakura6032
Tissue-Tek TEC 5Sakura5229
Accu-Edge S35Sakura4685
Tissue-TekSakura9533
Tissue-TekSakura9582
הרכבה בינונית Tissue-TekSakura1408
קופסאות שקופיותSakura3958
תמיסת אאוזיןSakura8703
תמיסת המטוקסיליןSakura8711
מיקרוטום, אמבטRM2125RT Leica720-1880 (VWR),
Leica HI1210Leica720-0113 (VWR)
אתנולVWRACRO444220050
צינורות 15 מ"לVWR734-0451
צנצנות ויטראז'VWRMARI4220004
צנצנות מכתיםVWRMARI4200005
אינקובטורקלסר9010-0012
טבליות מי חמצן DAB ואוריאה, SIGMAFAST 3,3′-טבליות דיאמינובנזידיןסיגמאD4293
PBS (10X)תרמו פישר 70011044
מיקרוסקופ בריאות של , DMi8 Leica ערכת מסננים DAPI Leica 11525304 מצלמה דיגיטלית , SPOT RT3 צבע מחוון ספוט מחשב נקודתית של Dell Fine Science Tools 14028-10 להבי מיקרוטום , שקופיות מיקרוסקופיה , תלושי כיסוי , מים מדעי

מקורות

  1. Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
  2. Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research. Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).
  3. Phoon, C. K., Turnbull, D. H. Cardiovascular Imaging in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 6 (1), 15-38 (2016).
  4. Wagner, N., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).
  5. Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016, 7631085(2016).
  6. Ghanbarian, H., et al. Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth. PLoS One. 11 (6), e0156953(2016).
  7. Meguro, T., et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).
  8. de Araújo, C. C., et al. Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling. Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).
  9. Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7 (7), e41691(2012).
  10. Colazzo, F., et al. Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation. PLoS One. 10 (4), e0125541(2015).
  11. Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).
  12. Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Echocardiography in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 71-83 (2011).
  13. Mor-Avi, V., et al. Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).
  14. Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice. Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).
  15. Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice. Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).
  16. Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).
  17. Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models. Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).
  18. Fayssoil, A., Tournoux, F. Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography. Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).
  19. Schoensiegel, F., et al. High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens. Ultraschall Med. 32, Suppl 1. S124-S129 (2011).
  20. Yariswamy, M., et al. Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction. J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).
  21. Jara, A., et al. Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice. Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).
  22. Kerr, B. A., et al. Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium. Nat Commun. 7, 10960(2016).
  23. Wagner, N., et al. Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms' tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).
  24. Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression. Nat Commun. 5, 5852(2014).
  25. Yang, X. P., et al. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice. Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).
  26. Rottman, J. N., et al. Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice. J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).
  27. Quiñones, M. A., et al. Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).
  28. van Laake, L. W., et al. Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction. Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).
  29. Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).
  30. Wagner, K. D., et al. RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse. Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).
  33. Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure. Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).
  34. Ismail, J. A., et al. Immunohistologic labeling of murine endothelium. Cardiovasc Pathol. 12 (2), 82-90 (2003).
  35. Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).
  36. Ayoub, A. E., Salm, A. K. Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus. J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).
  37. Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).
  38. dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

M modePecam 1
בבדיקה היסטולוגית ו echocardiographic של מורפולוגיה לב העכבר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.