תלת מימדי רקמות מהונדסים מיושר אסטרוציט רשתות כדי לסכם מנגנונים התפתחותית וכדי להקל על מערכת העצבים התחדשות

סיכום

אנחנו ראווה הפיתוח של חבילות שהורכב עצמית, תלת מימדי של somata astrocytic longitudinally מיושר ותהליכים בתוך למטרתו biomaterial הרומן. אלה מהונדסים "חי פיגומים", מפגין בקנה מידה מיקרון קוטר עדיין הארכת ס מ אורך, עשוי לשמש מבחן-מיטות לימוד מנגנוני התפתחותיות או להקל על neuroregeneration על-ידי הגירה העצבית המשגה ו/או עצב pathfinding.

תקציר

מחלת Neurotrauma, ניווניות לעיתים קרובות לגרום שנמשך גרעונות בשל הקיבולת המוגבלת של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כדי להחליף את הנוירונים לאיבוד והפק מסלולים עצב. עם זאת, במהלך פיתוח מערכת העצבים, הגירה העצבית והסיומת עצב לעיתים קרובות להתרחש לאורך מסלולים נוצר על ידי תאים אחרים, המכונה "חיים פיגומים". המבקשים לחקות מנגנונים אלה לתכנן אסטרטגיה העוקפות את הסביבה המעכבת של מערכת העצבים, כתב יד זה מציג את פרוטוקול כדי לבדות רקמות מהונדסים מבוססי אסטרוציט "חי פיגומים". כדי ליצור את המבנים האלה, אנחנו מועסקים ערכה למטרתו biomaterial הרומן לזירוז האסטרוציטים להרכיב עצמית צפופה תלת מימדי בחבילות של הפרעה דו קוטבית somata מיושר לימין longitudinally ותהליכים. ראשית, חלול הידרוג מיקרו-עמודות כונסו ולאחר לומן הפנימי היה מצופה מטריצה חוץ-תאית של קולגן. חלופה מועדפת את מוחי האסטרוציטים בקליפת המוח ואז נשלחו לתוך לומן של המיקרו-העמודה גלילי, קריטי בקוטר הפנימי של < מיקרומטר 350, באופן ספונטני עצמית ויישור מתכווץ כדי לייצר זמן כמו סיבים כבלים המורכב חבילות עבות תהליכים אסטרוציט ו קולגן הסיבים מדידה < מיקרומטר 150 קוטר עדיין הרחבת מספר ס מ אורך. אלה מהונדסים חיים פיגומים הציג > 97% תא הכדאיות והיו כמעט באופן בלעדי מורכבת האסטרוציטים לבטא שילוב של פילמנט ביניים חלבונים גליה-fibrillary חומצי החלבון (GFAP), vimentin, ו nestin. אלה המיושר אסטרוציט רשתות נמצאו לספק מצע מתירניות עבור הקובץ המצורף עצביים וכל neurite הרחבה. יתר על כן, מבנים אלה לשמור על שלמות ויישור כאשר מופק למטרתו הידרוג, שהופך אותם למתאימים להשתלה CNS. אלה בונה preformed מבנית לחקות את יסודות cytoarchitectural מפתח באופן טבעי מבוסס על גליה "חיים פיגומים" בתוך vivo. ככזה, פיגומים מהונדסים חיים אלה עשוי לשמש מבחן-מיטות לימוד התפתחותיות מנגנונים במבחנה או להקל על neuroregeneration על ידי הפניית הגירה העצבית ו/או עצב pathfinding בעקבות התנוונות מערכת העצבים המרכזית ויוו .

מבוא

מערכת העצבים המרכזית (CNS) בעל קיבולת מוגבלת כדי לנטרל את אובדן ו/או תפקוד לקוי של נוירונים מסלולים עצב שמלווים מצבים כגון פגיעה מוחית טראומטית (TBI), שבץ, מחלת פציעה (מדע), ניווניות חוט השדרה^{1 ,2,3,4,5}. נוירוג'נסיס ב מערכת העצבים היא מוגבלת למספר מוגבל של אזורים במוח, פוגעות השיקום של נוירונים אבודים^6,7. בנוסף, התחדשות של מסלולים עצב לאיבוד בתוך מערכת העצבים אינה מספיקה בשל העדר הדרכה מכוונת, הנוכחות של מעכבי תוצר, ו astrogliosis תגובתי בעקבות נזק רקמה עצבית^{2,8, 9,10}. האסטרוציטים בדרך כלל יש פונקציות מגוונות בקליטת נוירונים עם יון הומאוסטזיס, סיווג נוירוטרנסמיטר, היווצרות סינפסה נוירו-וסקולריים צימוד¹¹. יחד עם זאת, בעקבות פגיעה קלה אפילו רקמה עצבית, האסטרוציטים עלול לעבור שינויים מולקולרית מבנית, פונקציונלי במעבר המדינה היפרטרופית¹¹. בתגובה neurotrauma חמורה, שינויים אלה לגרום היווצרות צלקת עם הילה המכילה האסטרוציטים תגובתי נודדים, ליבה של הנגע הכולל לויקוציטים דלף מן קרע מחסום הדם - מוח (BBB), מיקרוגלייה, oligodendrocytes להפוך ולאחר fibroblasts^11,12,13. האסטרוציטים הממוגן אלה להשיג את המורפולוגיה של תהליכים filamentous, לא מאורגן ולהציג ביטוי מוגבר של חלבונים פילמנט ביניים, כונדרויטין סולפט proteoglycans (CSPGs), אשר להפריע התחדשות עצבית¹². אף-על-פי הצלקת גליה בתחילה עוזר לשחזר BBB שלמות ולהימנע שידור של תגובת דלקתית לרקמות בריאות, משמשת מחסום פיזי וביוכימי נגד האקסון התחדשות^{12,14 15, ,16}. למשל, אקסונים המפגש הצלקת גליה להציג צמיחה dystrophic בולבוסי קונוסים, ננסיים צמיחה¹². יתר על כן, חוסר הארגון של תהליכים astrocytic לאחר פציעה פוגעת ההרחבה של רגנרציה אקסונים¹⁷. התוצאה של תכונות מעכבות אלה באה לידי ביטוי את קבוע לעיתים קרובות נוירולוגיות פיזיקליות ליקויי חולים סובלים לאחר neurotrauma חמורות, לרבות TBI לביוטכנולוגיה

ללא קשר חיצוני האתגרים התחדשות תפקודית של מערכת העצבים, אקסונים הוכחו בעלי יכולת מהותי להתחדש. למשל, באופי הדינמי של הקונוסים צמיחה dystrophic בקשר עם הצלקת גליה מציע סופים אלה שומרים על היכולת שלהם להרחיב את¹². כתוצאה מכך, הוא האמין כי ליצור הפרעה עצב מחדש את הצמיחה העיקרי הוא הסביבה המעכבת של מערכת העצבים לאחר פציעה, וכי מתן סביבה מתירנית יותר באמצעות הפחתת גליה הצטלקות ו/או במתן משובי גשרים על פני הצלקת יהיה יתרון. ואכן, מחקרים קודמים הדגימו כי CNS הנוירונים מסוגלים הארכת אקסונים באמצעות פגיעה באמצעות שתלי במערכת העצבים ההיקפית כמו גשרים, מציג סביבה אוהדת יותר האקסון התחדשות^{12,18, 19}. כנראה תפס מספר אסטרטגיות אחרות כדי לנצל את יכולת ההתחדשות מנוונת. לדוגמה, מניפולציה של התא צמיחה איתות המסלולים במודלים שונים של פגיעה הביא התחדשות עצב וגליה הצלקת הפחתת^10,20,21. בנוסף, מחקרים הראו כי טיפול עם chondroitinase ABC, אשר cleaves את רוב הרשתות סוכר ב- CSPGs, מפחיתה את ההשפעה המעכבת של CSPGs מופרש על ידי האסטרוציטים תגובתי²². למרות מעודד תוצאות, גישות אלה אינם מספקים מכוונת ההדרכה של גביעי צמיחה, אשר יכול לגרום פוטנציאל התחדשות aberrant¹², גם חשבון על האובדן של נוירונים. כבר מנוצל גישות תא ניסיונות כדי להתגבר על ההשפעות של הצלקת גליה וכדי לחדש תאים אבודים, במיוחד נוירונים. כמה קבוצות יש dedifferentiated האסטרוציטים תגובתי לתוך הנוירונים, בעוד אחרים יש מושתלים ובתאים העצבי לתוך נגעים CNS לאכלס אזור הפציעה ולקדם האקסון התחדשות^{23,24, 25}. עם זאת, השתלת תא גזע לבד הוא מוגבל על ידי שיעורי הישרדות נמוכים, אינטגרציה המסכן ושמירה צנוע רקמות שנפגעו⁵. יתר על כן, אסטרטגיות אלו מבוססת תא להיכשל לשחזר ספינלי עצב למרחקים ארוכים, במיוחד בצורה מבוקרת. לכן, להיות נידונות biomaterials בשילוב עם גישות אחרות כמו רכבי ההעברה שונות עצבית, ובתאים וצמיחה גורמים²⁶. גישות biomaterial כוללים רמה גבוהה של עיצוב פקד כדי לייצר מבנים המחקים את haptotaxic הפיזי, ספציפי, וכן רמזים chemotaxic להציג microenvironment תלת מימדי (3D) המטרה המארח רקמות^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. רבייה של אותות סביבתיים אלה הוא בעל חשיבות עליונה עבור התאים המושתלים להציג מורפולוגיה מקורי כמו התפשטות, הגירה, איתות, בין שאר המאפיינים הנוירוביולוגי²⁹. למרות מאפיינים אלה יתרון, קידום מעבר תא מסורתי נזרע biomaterial פיגומים נדרש בעת ובעונה אחת לקדם התחדשות שיחות לחו ל עצב מכוונת ולהחליף נוירונים אבוד.

התחלה מבטיחה גישה חלופית מבוססת על רקמה עצבית מהונדסים "חי פיגומים", אשר נבדלים גישות אחרות בשל נוכחותם של לחיות תאים עצביים עם cytoarchitecture preformed שמדמה נוירואנטומיה מקורית מבוססת-תא או מנגנונים התפתחותית כדי להקל על החלפת יישוב, שיקום והתחדשות של המעגלים העצביים^4,35. שיקולים על העיצוב של פיגומים המגורים כוללים את פנוטיפים ואת מקורות של תאים עצביים, כמו גם את תכונות מכאניות/פיזי, אותות ביוכימיים שמכתיבה ההרכב של כל biomaterials הנלווה³⁵. לאחר ייצור במבחנה, פיגומים החיים האלה יכולים להיות מושתל ויוו מולקולות אדהזיה התא הנוכחי, chemotactic ואותות neurotrophic להסדיר באופן פעיל את נדידת תאים עצביים, האקסון תוצר בהתאם למצב, התפתחות לתהליכי הרגנרציה³⁵... גלייה יכול לשמש כבסיס cytoarchitecture שעברו הנדסה לאחור של פיגומים החיים מאז תאים אלה לתווך שונים מנגנוני התפתחותית ויוו. במהלך התפתחות המוח, נוירונים חדשים להסתמך על תהליכים הבזליים המורחבת על ידי עכשיו, דונלד רדיאלי מאזור חדרית לעבר הצלחת בקליפת המוח המתפתח כמו חיים פיגומים עבור ההעברה מכוונת^36,37. יתר על כן, הרחבת צמיחה קונוסים הינם שמוצג כדי להציב את עצמם על ידי חש אותות דוחה ומושכת שהפיק תאי גליה guidepost, מה שנקרא "חלוצי" אקסונים מוצעים כדי להגיע אל המטרות הנכונות על-ידי הרחבת לאורך מראש בדוגמת גליה פיגומים^35,38,39. לפיכך, גלייה נחוצים עבור ההדרכה של חלוצי אקסונים, אשר מאוחר יותר משרתים גם מבוסס על האקסון "חי פיגומים" לכוון את הקרנת אקסונים "חסיד". יתר על כן, מנגנוני גדילה בתיווך עכשיו, דונלד הוכחו להתמיד נוצרו אחרי הלידה, כפי neuroblasts לכו בעקבות הזרם נודדות rostral (RMS) כדי לנווט מאזור subventricular (SVZ), אחד האזורים הנותרים האחרונים של נוירוג'נסיס במוח למבוגרים, הריח הנורה (אבוב)⁴⁰. Neuroblasts אלה ב- RMS להעביר בתוך הצינור גליה (איור 1 א'-1), אשר כולל מיושר לימין longitudinally תהליכים astrocytic, באמצעות תאים תאים ישירה הדבקויות, לשפות אחרות גורמים מסיסים-^{37, 41}. סוף סוף, בעוד נזק CNS יונקים גורם שיבשו סידור תהליך astrocytic ויוצרים צלקת גליה פיזית פוגעת התחדשות עצב¹⁷, מערכות מידע שאינם יונקים רבים חוסר היווצרות צלקת גליה מזיקה. במקום זאת, תאי גליה של מינים שאינם מידע יונקים לשמור על יותר מאורגן, מיושר תבניות המשמשות כקווי עזר דרך^42,17,האזור הפגוע⁴³. למשל, מידע שאינם יונקים SCI דגמים, אקסונים מוצגים לגדול בשיתוף הדוק עם גליה הגשרים שחוצים את הנגע, רומז תפקיד חשוב עבור פיגומים גליה מאורגן בשם דיאלקטריים הקלת עצב רגנרציה ומחזור (שחזור פונקציונלי איור 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. החוק הביוגנטי של התכונות neuroanatomical ואת המנגנונים התפתחותית/משובי שתוארו לעיל, תניב סוג חדש של פיגומים מהונדסים מבוסס על גליה חי במקביל שיכולים להביא הגירה העצבית ילדותי, עצב pathfinding דרך סביבות אחרת שאינה מתירני, שעשוי להיות ובכך מקלים את ההשפעות של עצביים האקסון בדרכי ניוון המשויך CNS פציעות ומחלות.

קבוצת המחקר שלנו תוכנן בעבר מספר סוגים של פיגומים חי עבור שחזור ומתוכננים התחדשות של עצב ספינלי מערכת העצבים, מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית) באמצעות מיקרו-רקמת רשתות עצביות (מיקרו-TENNs) ורקמות מתוכנן החוצפה-שתלים (TENGs), בהתאמה^27,46,47,48. שתי אסטרטגיות מבוססים מטבעם על ביומימטיקה. מיקרו-TENNs הם מבנים בהשראת אנטומית המיועד מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית להחליף שטחים עצב המחבר ברורים אוכלוסיות עצביים במוח. TENGs לנצל את מנגנון התפתחותית של התחדשות עצב הקלו האקסון, ומעוררות "חסיד" צמיחה האקסון לאורך אקסונים "חלוץ", כדי להשיג את מארח היעד התחדשות עצב^35,46,48. אנחנו לאחרונה מהוונות על צדדיות של לגרדום חיים טכניקה באמצעות ערכה דומה למטרתו כמו מיקרו-TENNs ומחפשים השראה מן המנגנונים מבוסס עכשיו, דונלד להציג במהלך הפיתוח. . הנה, פיתחנו בונה המורכב מיושר חבילות astrocytic פורש לומן סילוק של מיקרו-טור הידרוג⁴⁹. פיגומים אלו החיים astrocytic מפותחים באמצעות מילוי אסיפה המחט צינור קפילר-דיקור עם agarose נוזלי כדי ליצור של הידרוג גליל חלול עם הקוטר החיצוני (OD), הקוטר הפנימי (ID) המתאים הקוטר של שפופרת ואת המחט, בהתאמה. בעקבות agarose gelation החילוץ של המיקרו-העמודה הידרוג מהצינור נימי, הפנים חלול הוא מצופה סוג אני קולגן לספק סביבה מתירניות עבור אדהזיה אסטרוציט ו מיושר צרור היווצרות (איור 1B -1). לאחר מכן, לומן הוא נזרע עם מוחי האסטרוציטים קורטיקלית מבודד מן החולדה לאחר הלידה הגורים (איור 1B-2). בניגוד דו-ממדית (2D) שיטות ליישור המסתמכים על היישום של שדות חשמליים, חריצים micropatterned מטריצה חוץ-תאית חלבון (ECM) תכנים, היישור אסטרוציט לגרדום חיים טכניקה מסתמך על הרכבה עצמית לפי משתני לשליטה כגון עקמומיות המצע (העמודה ID), צפיפות תא קולגן ריכוז^50,51,52. האסטרוציטים חוזה לשפץ הקולגן ו לרכוש מורפולוגיה דו-קוטבי, מיושר לימין longitudinally מקביל פיגומים טבעי ויוו (איור 1B-3). אכן, אנחנו הם שואפים השימוש של המבנים האלה, כמו כבלים בשם דיאלקטריים פיזי עבור הדרכה ממוקד של העברת נוירונים לא בוגר, כמו גם בקידום התחדשות עצב באמצעות הסביבה שלילי של מערכת העצבים פגום, במיוחד בתרבית של גליה הצלקת (איור 1C). במאמר זה תוכלו להציג את שיטת ייצור מפורט עבור העמודות-המיקרו astrocytic, שלב תמונות חדות עם immunofluorescence את cytoarchitecture הצפוי, דיון מקיף על המגבלות הנוכחי וכיוונים עתידיים של טכניקה.

איור 1: השראה, ייצור פרוטוקול ויישומים המוצע עבור הרשתות Astrocytic מיושר. ההשראה הנוירוביולוגי (A): Neuroblasts (1) שמקורן באזור ' neurogenic subventricular ' (SVZ) לנצל את הצינור גליה longitudinally מיושר בזרם נודדות rostral (RMS) עבור העברה מכוונת לעבר הנורה הריח (אבוב); (2) אי-יונקים כגון דו-חיים, דגים יכול להימשך התחדשות לאחר רקמה עצבית נזק בחלקו בשל היווצרות של גליה גשר המחבר את הקצוות של פגיעה (למשל חוט השדרה transected) ומשמש עשו איתו בהדרכת רגנרציה אקסונים. (B) סקירה פבריקציה נוספת: (1) הקמת הידרוג בגודל מיקרון, חלול מיקרו-עמודה בעלת לומן מצופה ECM, (2) זריעה של ראשי האסטרוציטים קורטיקלית מבודד מן הגורים עכברוש כמחנכת, (3) הרכבה עצמית של longitudinally מונחה חבילות תרבות, ו (4) הפקת הצרור מ למטרתו biomaterial ללימודי השתלה עתידית. (ג) יישומים In vivo : (1) פיגומים חיים אלה עשוי לשמש מהונדסים גליה צינורות להעברת נוירון מכוונת ממרכזי neurogenic לשקם אזורים נוירון לקויה; (2) החוק הביוגנטי של מנגנון התפתחותית של חלוצי האקסון הדרכה, מנגנון הרגנרציה של גשרים גליה שאינם יונקים שיעניק אלה פיגומים astrocytic את היכולת לכוון רגנרציה האקסון על פני הלא-מתירני סביבה של הצלקת גליה יונקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פרוטוקול

כל ההליכים היו אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדות שימוש ב אוניברסיטת פנסילבניה ו מייקל ג'יי Crescenz ותיקי לענייני המרכז הרפואי, דבקה בהתאם להנחיות המפורטות במדיניות שירות בריאות הציבור NIH על להומניות טיפול ושימוש חיות מעבדה (2015).

1. פיתוח של הידרוג מיקרו-העמודות Agarose

1. הפוך פתרון משקל/נפח (w/v) 3% agarose על ידי שקילה דור 3 של agarose ולא העברת אותו גביע סטרילי המכיל 100 מ ל תמיסת פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). להוסיף פס מגנטי סטרילי כדי כשהספל, ומניחים אותו על פני השטח של בחישה/פלטה. שמור את הספל כוסה על מנת למנוע אידוי של התוכן שלה בשלב הבא.
2. מחממים את agarose ואת DPBS בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס ומערבבים במהירות של 60-120 סל ד. לכוונן הגדרות אלה בהתאם לצורך, כל הזמן עוקב אחרי ההתקדמות של תהליך ההמסה כמו הפתרון משתנה בתחילה מאטום מראה נקי זה מסמל agarose כבר התפרקה לחלוטין.
   התראה: כשהספל חם והפתרון שוות!
3. הפתרון agarose מחוממת ונסערת, לאחזר ארבע צלחות פטרי ריק 10 ס מ, להוסיף שניים מהם 20 מ של DPBS. מקום דיקור מחטים (קוטר: 300 מיקרומטר, אורך: 40 מ מ), זכוכית צינורות קפילר microliter (קוטר: 701.04 מיקרומטר, אורך: 65 מ מ, קיבולת: 25.0 µL), ומתקן הנורה בתוך ארון אבטחה. כאשר הפתרון agarose נוזלי מתרוקנת, לשמור על חימום כ 50 ° C קבוע, זע להימנע gelation של agarose.
4. להציג מחט אקופונקטורה לתוך הפתח התחתון של מתקן הנורה. הכנס צינור קפילרי מעל המחט נחשף מבחוץ. אבטח את צינור קפילרי על-ידי הזנת חלק אותו לתוך המקטע גומי של הגליל מנפק הנורה.
5. להעביר 1 מ"ל של agarose נוזלי עם micropipette פני השטח של צלחת פטרי ריק, מקם קצה אחד של הצינור נימי אנכית (עם מחט מוכנס) במגע עם agarose, בעוד הכיפה גומי של מנפק הנורה הוא צבט פנימה. לאט לאט לשחרר את הלחץ על המכסה מנפק הנורה כדי לצייר agarose לתוך הצינור נימי.
   הערה: ההעברה של agarose נוזלי לתוך צינורות קפילר חייב להתבצע במהירות. אם agarose נוזלי נותר כדי להתקרר על פני צלחת פטרי למשך מספיק זמן (כ 60 s), זה מתחיל להתחבר, מניעת suctioning מתאים של agarose לאורך הצינור נימי.
6. המקום כל הרכבה הנורה-צינור-המחט פטרי חינם, ולתת agarose ג'ל בתוך הצינורות נימי לחזק עבור 5 דק משוך בזהירות את צינור קפילרי עם הידיים החוצה פקק הגומי בתוף מנפק הנורה, להשאיר את המחט ו agarose ג'ל במקומו בתוך הצינור.
7. לחלץ באופן ידני של דיקור סיני על ידי לאט מוציאים זה צינור קפילרי; הצילינדר agarose הקרושה לאחרונה גם שקופיות יצאה מהשפופרת בהליך זה, עדיין המקיפים את המחט. בעדינות הסטת המיקרו-העמודה לאורך דיקור עם קצה מלקחיים סטרילי כדי להזיז את הסוף. מיקום המחט מעל צלחת פטרי פתוח, המכיל DPBS, דחפו המיקרו-העמודה DPBS עם מלקחיים.
   הערה: אם agarose המיקרו-העמודה נותר בתוך הצינור נימי זכוכית על סילוק דיקור סיני, לאט לדחוף את agarose המיקרו-מהטור צינור קפילרי עם מחט בקוטר 25 מ מ עם ולתוך המנה עם DPBS.
8. לחטא microscalpels או מלקחיים באמצעות מעקר חרוז חם. הפוך agarose w/v 4% על ידי שקילה 4 גר' agarose והעברתו 100 מ של DPBS. מחממים ומערבבים כמוסבר בשלב 1.2 להשגת פתרון ברור של agarose נוזלי 4%. לשמור על חימום, ערבוב של הפתרון לאורך כל השלבים הבאים.
9. להעביר את פטרי המכילות את המיקרו-העמודות לנתיחה מכסה המנוע, ולהעביר מיקרו-עמודה עם מלקחיים בסדר אל צלחת פטרי ריק. לנצל את סטריאוסקופ עבור הנחיה חזותית, microscalpel לחתוך המיקרו-העמודות עד לאורך הרצוי. חתוך בשני הקצוות לקצוות טופס משופע בזווית 45^o מאופקי כדי להקל על הטיפול של המיקרו-העמודות במהלך הוספת ECM ותא.
10. חזור על שלב 3 מיקרו-עמודות נוספות בצלוחית הפטרי אותה הקודם ו בשורה של בונה ארבע במקביל פרידה של < 3 מ מ בין כל הגלילים. לטעון µL 50 של 4% פתרון agarose עם micropipette ושופכים קו/רצף של נוזל מעל המערך מיקרו-עמודה כדי להתחבר ולכרוך את המבנים לקבוצות של ארבעה (מכאן והלאה נקרא "מיקרו-עמודה סירות"). למנוע תנועה של 4% agarose בקצוות של המיקרו-העמודות, אשר עלול לסתום את הפנים, על-ידי צמצום המרחק בין המבנה והוספת את agarose במהירות בקו דק.
    הערה: סידור קבוצות של ארבעה מיקרו-עמודים לתוך "סירות" לא נדרש להמציא פיגומים astrocytic. למרות זאת, הסירות מגישות לזרז את תהליך ייצור להציע דרך בטוחה יותר להעביר ולטפל מיקרו-עמודות בשלבים מאוחר יותר.
11. ומצננים את הסירה מיקרו-עמודה 1-2 דקות לאפשר gelation של agarose נוסף 4%. לאסוף את הסירה מיקרו-עמודה עם מלקחיים בסדר על-ידי agarose חיבור 4%, ומעבר המיקרו-העמודות אחרות המכילות DPBS הפטרי מוכן בשלב 1.1.3. להמציא עוד קערות עם המיקרו-העמודים הנותרים כרצונכם.
12. להזיז את פטרי המכילות את מיקרו-עמודות ו/או סירות אבטחה ארון ולחטא עם חשיפה לאור אולטרה סגול (UV) למשך 30 דקות.
    התראה: לענוד הגנה הולמת כדי למנוע חשיפה UV.
13. לאחסן את הכלים עם הסירות מיקרו-טור ב- DPBS ב 4 ° C, אם תוספת ECM ו יופיצ תא לא יתבצעו מיד לאחר מכן, עד שבוע. חזור על השלבים ייצור מיקרו-עמודה אם בונה לא משמשים במהלך פרק זמן זה.

2. התא הראשי תרבות ובידוד

1. אסטרוציט קורטיקלית בידוד מן הגורים עכברוש
   1. לקראת השלבים הבאים, להוסיף 20 מיליליטר של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) כדי ארבע צלחות פטרי 10 ס מ אשר ישמש מאגרי רקמות גזור. שמור את כל הצלחות על קרח. לחטא מספריים כירורגיים נקי, מלקחיים, מיקרו-מרית, מיקרו נלווה ב מעקר חרוז חם.
   2. Prewarm 0.25% טריפסין עם 1 מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ו- 0.15 מ"ג/מ"ל deoxyribonuclease (DNase) אני ב HBSS ב 37 º C. בנוסף, prewarm של המדיום תרבות אסטרוציט ב 37 מעלות צלזיוס, אשר מורכב של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) עם תערובת התזונתי של חזיר F-12 ו 10% סרום שור עוברית (FBS).
   3. עזים ומתנגד כמחנכת יום 0 או יום 1 ספראג-Dawley חולדה הגורים מאת לחשוף אותם תנאים בהיפותרמיה, המתת חסד ע י עריפת ראשו. סיכת הראש לבמה באמצעות של 19 מ מ. קוטר המחט להציב את החוטם והשתרשה עמוק בלבה העיניים
   4. לעשות חתך עם איזמל באמצע כדי הקדמי, האחורי מבסיס הצוואר ועד ממש מאחורי העיניים. לבצע את חיתוך נוסף הולך רוחבית מ ישירות מאחורי עיניה כלפי מטה, ויוצרים צורת T. להשתמש מלקחיים בסדר כדי לשלוף את הגולגולת של העור/הגולגולת אל הצד.
   5. . תחזיק את הראש על ידי החוטם (כלפי מעלה) על-ידי הצבת אחד לתקעים של המלקחיים בתוך הפה של החיה והשני על המשטח החיצוני. מסירים את המוח עם מיקרו-מרית סטרילי ולמקם אותו באחת צלחות פטרי מלא HBSS צוננות. המקום הזה פטרי על הקרח מיד לאחר מכן, כל עת מלבד כאשר בשימוש.
   6. מקם גוש גרניט שאוחסנו בעבר ב-20 ° C מתחת סטריאוסקופ בתוך ברדס לנתיחה. מניחים על צלחת פטרי עם רקמת המוח על פני השטח של גוש גרניט כדי לשמר את הטמפרטורה נמוכה שלו במהלך ההליך לנתיחה. להשתמש את סטריאוסקופ הנחיה חזותית לאורך כל השלבים הבאים.
   7. אם הנורות הריח נותרו ללא פגע, לחלץ אותם על ידי חיתוך עם מלקחיים או microscalpels. בנוסף, להשתמש microscalpel כדי להסיר את המוח הקטן עושים חתך קו האמצע המפריד בין שתי ההמיספרות. העבר את ההמיספרות עם מלקחיים צלחת פטרי המכילות HBSS טריים, צונן.
   8. לנתח את מבנה המוח האמצעי מהחלק הפנימי של ההמיספרות עם microscalpel כדי לקבל רק את cortices מופרדים. להשתמש מלקחיים בסדר לקלף את קרומי המוח, מבנה דמוי גיליון, מתוך הרקמה קורטיקלית להעביר את cortices מבודדים צלחת פטרי חדש עם HBSS קר. השתמש את microscalpel לרכך את הרקמה כדי להגדיל את שטח הפנים לפעולה טריפסין בשלב הבא.
   9. השתמש פיפטה של פסטר להעביר cortices את שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל המכיל 4 מ של טריפסין prewarmed-EDTA (8 cortices כל צינור). לחשוף את רקמות קורטיקלית טריפסין-EDTA למשך 5-7 דקות ב 37 º C.
   10. עם פיפטה פסטר, בזהירות להסיר את טריפסין-EDTA ולהוסיף 400 µl של 0.15 מ"ג/מ"ל DNAse אני לפתרון הצינורית צנטריפוגה. להתסיס את צינור או מערבולת עד כל הרקמה הוא חלופה מועדפת ויש אין חתיכות רקמה שנותרו בתוך הנוזל. אם זה לא אפשרי נמסים לחלוטין את הרקמה, להסיר מן הקטעים עם קצה פיפטה פסטר.
   11. צנטריפוגה הצינור המכיל הפתרון תא חלופה מועדפת-200 g x עבור 3 מינימלית להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה פסטר מבלי להפריע את התאים. להוסיף 1 מ"ל אסטרוציט תרבות בינוני (שהוגדרו בשלב 2.1.2) ברכבת התחתית עם micropipette, להתסיס resuspend וליצור פתרון הומוגני.
   12. להעביר 10 מ"ל אסטרוציט בינוני תרבות עם פיפטה סרולוגית בקבוקון T-75. להוסיף 250 µl של 1 מ"ל תא הפתרון (להכין בשלב 2.1.11) עם micropipette שתייה צידניות כדי צלחת מח גור אחד שווה של תאים לכל את הבקבוק. פזר את הפתרון תא משוחררים באופן שווה על פני המדיום תרבות, בעדינות להתסיס את הבקבוק כדי לקדם ריפודי כתופיים.
   13. תרבות המבחנות מצופה ב חממה humidified-CO 37 ° C ו-5%₂. כשמגיעים 24 ו 72 h בתרבות, מכנית להתסיס את הבקבוקון. לנתק סוגי תאים שאינם מחסידי, כגון נוירונים ו אוליגודנדרוציטים.
   14. לאחר מכן, בכל אחד timepoints האלה, לבצע שינוי מדיה. להחזיק את הבקבוק אנכית כדי שהתקשורת תרבות שוכנת על החלק התחתון של הבקבוק, לא מסתיר את התאים מודבקת. האחות המדיום תרבות עם פיפטה פסטר, הקשה על קצה פיפטה נגד בפינה התחתונה של הבקבוק כדי להימנע מחלץ את התאים. למקם את הבקבוק. את המיקום האופקי המקורי ולהוסיף בעדינות 10 מ"ל אסטרוציט בינוני מעל התאים עם פיפטה סרולוגית.
   15. להחזיר את המבחנות החממה לאחר כל שינוי מדיה. אחרי 90% confluency מושגת, מכנית להתסיס את הבקבוקון פעם נוספת כדי להסיר תאים ללא הקפדה הנותרים.
   16. המעבר האסטרוציטים את לוקח את המדיום תרבות עם ואקום, פיפטה של פסטר. הוסף 5 מ של 0.25% טריפסין-EDTA עם פיפטה סרולוגית על פני התאים מודבקת. בעדינות להתסיס את הבקבוק כדי להבטיח שטריפסין מכסה את כל התאים, דגירה. הבקבוק למשך 5-7 דקות ב 37 ° C ו- 5% CO₂.
   17. להרוות טריפסין על-ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום אסטרוציט לתאים עם פיפטה סרולוגית. לחלץ את הפתרון הסלולרי הבקבוק עם פיפטה סרולוגית ולהעביר אותו שפופרת צנטרפוגה סטרילי 15 מ"ל. Centrifuge את הצינור ב g x 200 למשך 3 דקות.
   18. הסר את תגובת שיקוע עם פיפטה סרולוגית ולאחר resuspend זה ב 1 מ"ל אסטרוציט תרבות בינוני. להתסיס את הצינור כדי להבטיח שהפתרון הסלולרי הוא הומוגני. לספור את מספר התאים הפתרון עם hemocytometer או מונה אוטומטי תא הניתן.
       הערה: בקבוקון זה 90% confluent בדרך כלל מניבה כ 3 מיליון האסטרוציטים.
   19. להוסיף 10 מ של מדיום תרבות אסטרוציט בקבוקון T-75. לבצע לדילול 1:4 על ידי העברת µl 250 של הפתרון הסלולרי (שלב 2.1.18) עם micropipette הבקבוק T-75 כבר המכיל תרבות בינוני. להתסיס בעדינות כדי להבטיח התפלגות התא הומוגנית ברחבי השטח + בקבוקי שתייה צידניות.
   20. חזור על צעדים 2.1.16-2.1.19 בכל פעם confluency 90% מושגת על המעבר את התאים.
2. תא עצב בקליפת המוח בידוד מעוברים עכבר
   1. בצע את ההכנות דומה צעדים 2.1.1 ו 2.1.2, למעט זה התקשורת prewarmed תרבות שיתוף מדיה, המורכב Neurobasal בינוני + 2% תוספת B-27 (עבור נוירונים) + 1% G-5 סרום ללא תוספת (עבור האסטרוציטים) + 0.25%-גלוטמין.
   2. המתת חסד יום עובריים בהריון-מתוזמן 18 חולדות ספראג-Dawley עם פחמן דו-חמצני חנק ואשר למוות ע י עריפת ראשו.
   3. תמצית העוברים עכברוש ומנתחים את cortices משאר הרקמה המוחית בפטרי המכילות HBSS על פני השטח של גוש גרניט צוננת, באמצעות סטריאוסקופ הנחיה חזותית, מספריים מעוקר, microscalpel של מלקחיים⁵³ . לאחר הקרע רצופים של ראשי, המוח האונות, cortices, להעביר כל רקמה חדשה מלא HBSS פטרי.
   4. מינצ הרקמה בקליפת המוח לחלקים קטנים יותר כדי להגדיל את שטח הפנים של טריפסין. העברה 4-6 cortices עם פסטר פיפטה לרכבת התחתית עם 5 מ של טריפסין prewarmed-EDTA ולתחזק ב 37 מעלות צלזיוס מביצועם הרקמה. ב- 5-7 דקות ידנית להתסיס את הצינור כדי לערבב ולמנוע הצליעה של הרקמה.
   5. הסר את הצינורית של 37 ° C לאחר 10 דקות. כפי שהוסבר קודם לכן בשלב 2.1, לחלץ את טריפסין-EDTA, תחליף עם 1.8 מ של 0.15 מ"ג/מ"ל DNAse פתרון. לאחר מכן, מערבולת הרקמה עד הפתרון מופיע הומוגני, עם אין שברי רקמת צף בנוזל.
   6. Centrifuge הפתרון רקמות הפומבית ב g x 200 למשך 3 דקות. לאחר הסרת את תגובת שיקוע, resuspend ב 2 מ של תרבות משותפת בינוני. לספור את מספר התאים בפתרון זה עם hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
      הערה: התשואה הרגילים היא 3.0-5.0 x 10⁶ תאים/קורטיקלית האונה.
   7. להכין פתרון סלולרי חדש עם צפיפות של 2.0-4.0 x 10⁵ תאים למ"ל בתקשורת תרבות משותפת שהוגדרו לעיל.

3. פיתוח של הכבלים Astrocytic בתוך המיקרו-העמודות

1. ECM הליבה פבריקציה נוספת
   הערה: ה-ECM יש להוסיף הפנים של הידרוג המיקרו-העמודות באותו יום שבו תא זריעה, יבוצעו.
   1. בתוך ארון אבטחה, להכין 1 מ"ג/מ"ל של תמיסת זנב החולדה מסוג קולגן במדיום תרבות משותפת צינור microcentrifuge סטרילי. לשמור על הצינור microcentrifuge עם פתרון ה-ECM על קרח כל הזמן. חוץ בשימוש.
   2. העברת µL 1-2 של פתרון ה-ECM עם micropipette על רצועת נייר לקמוס כדי להעריך את החומציות. להוסיף 1 µL 1 N הידרוקסיד הנתרן (NaOH) או חומצת מלח (HCl) עם micropipette כדי להגדיל או להקטין את ה-pH של התמיסה ECM, בהתאמה, פיפטה למעלה ולמטה כדי homogenize. בדוק את ה-pH חדש עם רצועת נייר לקמוס ולהוסיף יותר חומצה או בסיס, לפי הצורך, עד ה-pH תהיה יציבה בטווח 7.2-7.4.
   3. להעביר את צלחות פטרי שלב 1.2 ברדס לנתיחה, להעביר 4-5 מיקרו-עמודות או סירה עם מלקחיים בסדר סטרילי ריקה, סטרילי 35 או 60 מ מ פטרי. באמצעות את סטריאוסקופ להדרכה, מקם קצה 10 µL micropipette בקצה אחד של כל עמודה מיקרו, שאיבה לרוקן לומן של בועות DPBS ואוויר. אשר העדרו של בועות אוויר עם סטריאוסקופ כדי להבטיח ה-ECM הוסיף בשלב הבא יכול לזרום בחופשיות ברחבי לומן.
   4. לטעון micropipette P10 של פתרון ה-ECM, במקום µL 10 עצה כנגד קצה אחד של הידרוג המיקרו-העמודות, ולספק פתרון מספיק כדי למלא לומן (כ 3-5 µL), התבוננות על כניסת ECM עם סטריאוסקופ. Pipette (µL 2-4) מאגר קטן של פתרון ה-ECM בכל אחד מהקצוות של המיקרו-העמודה.
      הערה: תמיד לנהל מיקרו-עמודות של 4-5 או בסירה אחת בכל פעם כדי למנוע ממושך ייבוש של המבנה, כמו התוצאה עשויה הקורסת של מבנה מיקרו-טור. מיקרו יבשים לחלוטין-עמודות לצרף בחוזקה אל פני השטח של הכלים פטרי, אשר מונע ניצול שלהם עבור תא זריעה. אין אפשרות להוסיף עודפות של תרבות שיתוף מדיה (כאמצעי הידרציה) המיקרו-בעמודות כי הדבר עלול לגרום את ה-ECM לזרום החוצה במהלך תקופת הדגירה המתוארים להלן.
   5. פיפטה תרבות שיתוף מדיה טבעת סביב הפטרי לספק כיור לחות כדי למנוע את העמודות מתייבשת בתקופת הדגירה. דגירה הפטרי המכיל המכיל ECM המיקרו-העמודות ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ ב 1 h כדי לקדם פלמור של קולגן לפני הוספת את הנוירונים ו/או האסטרוציטים.
      הערה: ה-ECM צריך ליצור שכבת ציפוי המשטח הפנימי של לומן חלול, במקום גרעין ECM מוצק המקיף את הפנים, אשר שניהם יכול להיות שנצפו באמצעות סטריאוסקופ. אם ה-ECM טפסים גרעין, המשך תקופת הדגירה עד שנשאר רק את השכבה. עם שכבה זו נוצר, הפתרון תא אסטרוציט ניתן למלא את הפנים של המיקרו-העמודה השלבים ציפוי.
   6. במהלך תקופת דגירה, להכין את הפתרון תא אסטרוציט (כמפורט להלן).
2. אסטרוציט ו נוירון זריעה בעמודות-מיקרו
   1. המעבר של האסטרוציטים מצופה (בין המעבר הרביעי ו-12) כמוסבר שלבים 2.1.16-2.1.19. לאחר ספירת מספר התאים הבקבוק, להכין פתרון תא צפיפות של 9.0-12.0 x 10⁵ תאים למ"ל פתרון מושעה בתקשורת תרבית תאים.
   2. שימוש סטריאוסקופ, המקום קצה micropipette P10 בקצה אחד של המיקרו-העמודות, להעביר תא מספקת פתרון (µL ~ 5) לתוך לומן למלא אותה לחלוטין. כפי שנעשה לעיל עם ECM, להוסיף מאגרים קטנים של פתרון תא בשני הקצוות של כל מיקרו-עמודה.
   3. דגירה המיקרו-העמודות מצופה על בצלחות פטרי-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ לשעה לקדם את הקובץ המצורף של האסטרוציטים ECM. אם נוירונים לא יתווספו מיקרו-עמודות, להמשיך לצעוד 3.2.5.
   4. בעקבות תקופת הדגירה הראשונית, להוסיף 1-2 µL של הפתרון נוירון קורטיקלית שהושג בשלב 2.2.7 בשני הקצוות של המיקרו-העמודות עם micropipette, תוך התבוננות על תחת סטריאוסקופ. ודא כי מדיה מספיקה נוכח הכלים כדי למנוע ייבוש ולאחר תקופת דגירה שוב של 40 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ כדי לאפשר הידבקות של נוירונים.
      הערה: פתרון תא עצב בקליפת המוח גם ניתן להוסיף 1-2 ימים לאחר היווצרות צרור, ביצוע שלב 3.2.4 לאחר בקפידה הסרת התקשורת התרבות צלחת פטרי עם micropipette.
   5. לאחר דגירה תקופה, בזהירות למלא את פטרי המכילות את העמודות-המיקרו מצופה עם 3 או 6 מ"ל של תרבות שיתוף מדיה עבור 35 או 60 מ מ צלחות פטרי, בהתאמה. לשמור על המיקרו-העמודים מצופים בתרבות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ כדי לקדם הרכבה עצמית של חבילות astrocytic מיושר, אשר יוצרות מבנה ארוזות, כמו כבלים לאחר 6-10 h.
3. ייצוב לאדריכלות כבל אסטרוציט
   הערה: לאחר היווצרות חבילות, כ- 6-12 h של culturing המבנה, בצע את השלבים הבאים כדי למנוע את התמוטטות המבנה המיושרת של פיגומים astrocytic.
   1. צינור microcentrifuge סטרילי, להכין קולגן זנב החולדה 3 מ"ג/מ"ל אני הפתרון ב תרבות שיתוף מדיה. התאם את רמת החומציות של הפתרון 7.2-7.4 ביצוע שלבי ההליך המפורטים בשלב 3.1.2. לשמור על קולגן מניות ותרבות משותפת בתקשורת על הקרח כאשר אינו בשימוש, ולמקם את הפתרון קולגן מוכן על קרח בכל עת.
   2. הסר את המדיה פטרי המכילות פיגומים astrocytic עם micropipette, להשאיר כמה כלי תקשורת בצדדים של המנה ליצירת כיור בלחות המבטיח את הידרציה של המיקרו-העמודות. המקום המנה תחת סטריאוסקופ כדי לסייע פריט חזותי.
   3. עם micropipette, לקחת 2-3 µL של פתרון קולגן, הפרשות בכל קצה של המיקרו-העמודות, באמצעות את סטריאוסקופ עבור הנחיה חזותית. ודא שהמנה יש מדיה מספיקה בצדדים לפעול כמו כיור לחות בקצוות של המנה. דגירה של צלחות פטרי עם המיקרו-העמודות למשך 30 דקות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ ב חממה humidified כדי לקדם את gelation של הקולגן שנוספו לאחרונה.
   4. לאט לאט להוסיף 3 או 6 מ"ל של תרבות שיתוף מדיה (35 או 60 מ"מ פטרי מנות, בהתאמה) כדי פטרי מנות פיפטה, תרבות את הכלים חממה humidified ב 37 ^oC ו- 5% CO₂.

4. החילוץ של חבילות Astrocytic מן הפנים הידרוג

1. לחטא coverslips זכוכית דקה ב החיטוי. להכין פתרון µg/mL 20 של פולי-L-ליזין (PLL) במים כיתה תרבות תא סטרילי.
2. בתוך ארון אבטחה, באופן ידני להעביר את coverslips זכוכית מעוקר דקה ס מ 10 עקר פטרי, וכן להוסיף פתרון PLL מספיק כדי לכסות על coverslips.
3. דגירה על coverslips, מכוסה הפתרון PLL, למשך 30 דקות ב 37 ° C כדי להרגיע את השטח. הסר את הפתרון PLL עם פיפטה פסטר לאחר 30 דקות יש לשטוף שלוש פעמים על-ידי הוספת תא תרבות כיתה מים coverslip הסרתו עם פיפטה פסטר.
4. לאחר היווצרות הצרור גליה מיושר, להעביר המיקרו-העמודה בעדינות אל צלחת פטרי סטריליות עם מלקחיים בסדר סטרילי, וכן להוסיף בריכה קטנה של 10 µL של תרבות שיתוף מדיה עם micropipette כדי למנוע התייבשות ולהבטיח צרור בריאות. לחלץ את הצרור astrocytic הידרוג המיקרו-עמודה על-ידי משיכה עדינה מקצה אחד עם מלקחיים כירורגיים סטרילי, שימוש סטריאוסקופ עבור הנחיה חזותית.
5. מחזיק את הצרור astrocytic עם מלקחיים, לעלות אותו על coverslip PLL מצופים. לתקן, כתם עם פרוטוקול להלן.

5. Immunocytochemistry ללימודי במבחנה

הערה: במחקר זה, הנוגדנים העיקרי היו ארנב אנטי-גליה חומצי fibrillary חלבון (GFAP) (שבערך), העכבר השלישי נגד-β-טובולין (שבערך), ראביט אנטי-קולגן אני (שבערך) העכבר אנטי-nestin (1:200), ארנב אנטי-vimentin (1: 100). הנוגדנים משני היו חמור אנטי-העכבר 568, החמור נגד הארנב 568, החמור נגד הארנב 488, והעכבר חמור נגד 568 (שבערך כל). בכל המקרים, להוסיף נפח מספיק של כל פתרון לכסות לגמרי את העמודות המיקרו.

1. להכין פתרון פורמלדהיד נפח/אמצעי האחסון (v/v) 4% ב- x DPBS 1 בתוך ברדס fume כימי.
   התראה: פורמלדהיד הוא תרכובת רעילה ידוע כמסרטן, חייב להיות מסולק במיכל נפרד. תמיד לתפעל את המתחם בתוך ברדס fume כימיים ולהשתמש ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי) כגון מעיל מעבדה, בטיחות משקפיים וכפפות.
2. במקרה של המיקרו-העמודות, למחוק את מדיה תרבות פטרי המכילות את בונה עם פיפטה פסטר בלי בטעות suctioning הגלילים הידרוג. הוספת פתרון פורמלדהיד מספיק כדי לכסות המיקרו-העמודות או את coverslips הנטען (שניהם נשארים על בצלחות פטרי) ואת תקופת דגירה של 35 דקות ב 18-24 ° C.
3. לחלץ את הפתרון פורמלדהיד 4.0% מ קבוע המיקרו-העמודות או את coverslips עם פיפטה סרולוגית. יש לשטוף את העמודות-המיקרו קבוע 3 פעמים עם PBS על-ידי הוספת במהירות, הסרת PBS פעמיים ואת ולתת להם להשרות במשך 10 דקות בפעם השלישית.
4. להמיס סרום סוס רגיל (NHS) ב- PBS עבור ריכוז של 4% v / v. הכן פתרון עם סבון ללא יונית-ריכוז של 0.3% v/v באמצעות הפתרון NHS כמו הממס.
5. הסר את PBS פטרי המכילות המיקרו-העמודות או את coverslips עם פיפטה. הוסף מספקת פתרון דטרגנט 0.3% כדי לכסות על המיקרו-העמודות/coverslips עבור 60 דקות ב 18-24 ° C כדי permeabilize את התאים.
6. להוציא את הפתרון דטרגנט, ולאחר מכן לשטוף במהירות פעמיים עם PBS, שלוש פעמים למסמס עבור 5 דק חישוב הנפח הנדרש של 4% NHS וכל אחד של הנוגדנים העיקרי להכין פתרון עם ריכוז נוגדן הרצוי.
7. להסיר את PBS צלחות פטרי ומוסיפים מספיק נוגדנים הראשי (מדולל ב 4% NHS-DPBS) פתרון כדי לכסות המיקרו-העמודות או חבילות astrocytic שחולצו. דגירה לילה (12-16 ג) ב 4 º C.
8. להוציא את הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף במהירות פעמיים עם PBS, שלוש פעמים למסמס למשך 5 דקות. הכינו את הפתרון נוגדנים משניים, בחושך, עם כל נוגדן נוכח לדילול שבערך ב- 4.0% NHS פתרון.
9. דגירה תאים עם הפתרון נוגדנים משניים עבור 2 h ב- 18-24 מעלות צלזיוס. לאורך כל זמן של דגירה, לכסות את פטרי המכילות המיקרו-העמודות ברדיד אלומיניום, כדי למנוע חשיפה לאור.
10. להסיר את הפתרון נוגדנים משניים ולהוסיף Hoechst פתרון (1:10, 000) למשך 10 דקות ב 18-24 מעלות צלזיוס כתם הגרעינים.
    זהירות: Hoechst היא מוטגן ידוע כי יש להתייחס כאל חומר מסרטן. לכן, זה חייב להיות מסולק במיכל נפרד, עיקרון השוויון הפוליטי אמור לשמש בכל עת כאשר מניפולציה סוכן זה.
11. לשטוף עם PBS חמש פעמים, בכל פעם במשך 5-10 דקות לאחר מכן, לאחסן המיקרו-העמודות ויטראז'ים ב 4 ° C ב- PBS ומכסים ברדיד אלומיניום. במקרה של חבילות astrocytic הנטען, להוסיף טיפה של הרכבה מימית בינוני על הצרור במקום אחר coverslip זכוכית מעל הצרור קבוע, חותם בשני coverslips עם לק עבור אחסון לטווח ארוך והדמיה עוקבות.

6. הכדאיות Assay עם חי-מת (Calcein-AM/אתידיום Homodimer) Staining

1. להכין את הפתרון מגיב על-ידי הוספת 10 מ"ל של 1 x DPBS μl 5 calcein AM (4 מ מ בנטול מים דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) וμl 20 אתידיום homodimer-1 (EthD-1) (2 מ מ ב- H דימתיל סולפוקסיד₂O 1:4 וי/v...). לכסות את הפתרון עם רדיד אלומיניום או לאחסן בחושך כדי להגן עליה מפני האור.
2. האחות מדיה הפטרי המכיל המיקרו-העמודות מצופה עם פיפטה פסטר, וכן להוסיף פתרון מספיק (להכין לעיל) כדי לכסות את המבנים. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂, שמירה על צלחת פטרי מכוסה כדי להגן על הפתרון מן האור.
3. הסר את הפתרון עם micropipette או פיפטה פסטר. לשטוף 2 - 3 פעמים עם DPBS כמוסבר בשלב 5.3. להציף את צלחות פטרי עם DPBS בהתאם לגודל המנה. התמונה תאים מיד לאחר מכן שימוש epifluorescence או הדמיה קונפוקלי.
   הערה: המרה של calcein קרום חדיר AM כדי calcein על ידי תאים פעילים סמויה התשואות של זריחה הירוק של calcein. תאים מתים מסומנים ממברנה-לסיכון תאים, אשר להתיר את כניסתם של EthD-1 לתוך התא שלה מחייב חומצות גרעין, גורם פלואורסצנטי אדום.

תוצאות

בתחילה, שלב-ניגודיות מיקרוסקופ שימש כדי לעקוב אחר ההתקדמות של אדהזיה אסטרוציט היווצרות צרור ואת יציבותו הכללית cytoarchitecture כפונקציה של הזמן. ב- h 1 לאחר ציפוי, האסטרוציטים נמצאו ברחבי לומן של המיקרו-העמודות עם מורפולוגיה כדורית (איור 2 א). -5 שעות, האסטרוציטים התחיל להרחיב תהליכים, קבלנות, בעוד מאת 8 h תאים הציג מורפולוגיה מלאה של תהליך מניבי ויצרו מבנים דמויי-כבל מונחה לאורך ציר האורך של העמודה המיקרו (איור 2 א). ראוי לציין...

דיון

כאשר לעומת הסביבה יותר תומכת של מערכת העצבים ההיקפית, מערכת העצבים מוגבל במיוחד בטיפול ההשלכות מזיקה של neurotrauma, הקשורים ניוון מוחיים. לאחר עלבון רציני מערכת העצבים יונקים, נוצרת צלקת גליה המורכב גרעין של תאים דלקתיים שהותירה מוקף meshwork צפופה של האסטרוציטים תגובתי לא מאורגן להפריש proteoglycans עיכוב תוצר של האקסון¹⁴. הצלקת הזו פועלת כמו חסימה ביוכימיות ופיזיות נגד לרגנרציה של האקסון סופים¹². יתר על כן, מערכת העצבים יונקים בוגרים הנו מוגבל מקורות של נוירונים חדשים לש...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מחט דיקור סיני (300 ומיקרו; קוטר מ')	Lhasa Medical	HS.30x40	הקוטר עשוי להשתנות בהתאם לגודל הרצוי עבור לומן המיקרו-עמודה.
צלחת פטרי	פישר	08772B
תמיסת מלח פוספט חוצץ פוספט (DPBS)	Invitrogen	14200075
פוליסטירן פיפלט סרולוגי חד פעמי	פישר	13-678-11D
אגרוז	סיגמא	A9539-50G
צינור נימי זכוכית מיקרוליטר (701 ומיקרו; מ)	פישר	21-170J	הקוטר עשוי להשתנות בהתאם לגודל הרצוי למעטפת המיקרו-עמודה.
מתקן נורות Microcap	Fisher	21-170J	Bulb מגיע עם צינורות המיקרו-קאפ.
פלטה חמה	פישר	SP88857200
בר מגנטי	פישר	1451352
מיקרופיפטה	סיגמא	Z683884-1EA
25 מ"מ מחט מד	פישר	14-826-49
מיקרואזמל	Roboz כירורגי	RS-6270
מספריים	כלי מדע עדינים	14081-09
מכשירי	דיוק עולמיים	של
מעקר חרוזים חם	סיגמא	Z378550-1EA
סטריאוסקופ	ניקון	SMZ800N
מיקרו-מרית	פישר	S50821
זנב חולדה מסוג I	קולגן קורנינג	354236	לשמור על 4 º C ולהסיר רק בעת הצורך. השתמש בקרח כדי לשמור על הטמפרטורה שלו בעת השימוש.
צינור מיקרוצנטריפוגה	פישר	02-681-256
נתרן הידרוקסיד (NaOH)	פישר	SS2661
חומצה הידרוכלורית (HCl)	פישר	SA48-1
נייר לקמוס	פישר	09-876-18
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)	Invitrogen	14170112	חנות ב 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	חנות 25200056	ב-20 & C וחם ב 37 º C לפני השימוש.
דאוקסיריבונוקלאז לבלב בקר (Dnase) I	Sigma 10104159001		חנות ב -20 º C וחם ב 37 º C לפני השימוש.
מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) עם תערובת התזונה F-12 של Ham	Gibco	11330-032	חנות ב 4 & ordm;C.
סרום בקר עוברי (FBS)	חנות Atlanta Biologicals	S11195	בכתובת -20ºC.
לאחר הלידה יום 0 או יום 1 גורי חולדות Sprague Dawley	נהר צ'ארלס	001
נוירון עוברי נוירו-בסיסי מדיום בסיסי	Invitrogen	21103049	חנות ב 4º C וחם ב 37 º C לפני השימוש.
תוסף תזונה ללא סרום B-27	Invitrogen	12587010	Store ב-20 & C וחם ב 37 º C לפני השימוש.
L-גלוטמין	Invitrogen	חנות 35050061	ב-20 & C וחם ב 37 º C לפני השימוש.
תוסף אסטרוציטי G5	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley יום עוברי 18 חולדות	צ'ארלס ריבר	זן 001
פיפטה פסטר	פישר	22-042816
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל	EMESCO	1194-352099
וורטקס	פישר	02-215-414
צנטריפוגה	פישר	05-413-115
המוציטומטר	פישר	02-671-6
אינקובטור	פישר	13 998 076
פורמלדהיד 40%	פישר	F77P-4	פורמלדהיד הוא תרכובת רעילה הידועה כמסרטנת, ויש להשליך אותה למיכל נפרד.
תלוש כיסוי זכוכית	פישר	12-548-5M
לק	מדעי מיקרוסקופיה (EMS)	72180
פלואורומונט הרכבה	בינונית Southern Biotech	0100-01
פולי-L-ליזין	סיגמא	P4707
פוספט חוצץ מלח	פישר	BP3994
טריטון X-100	סיגמא	T8787
סרום סוס רגיל	Gibco	16050-122
ארנב נגד גליה חלבון חומצי חומצי (GFAP) נוגדן ראשוני	Millipore	AB5804	חנות ב -20ºC.
עכבר אנטי-בטא-טובולין III נוגדן ראשוני	Sigma	T8578	חנות ב-20&C.
ארנב אנטי-קולגן I נוגדן ראשוני	Abcam	ab34710	חנות ב -20ºC.
ארנב אנטי-וימנטין	Millipore	AB3400	חנות ב -20ºC.
עכבר נגד nestin	Millipore	AB5326	חנות ב -20ºC.
חמור נגד עכבר 568 נוגדן משני	Invitrogen	A10037	חנות ב 4ºC.
חמור נגד ארנב 568 נוגדן משני	Invitrogen	A10042	חנות ב 4ºC.
חמור נגד ארנב 488 נוגדן משני	Invitrogen	A21206	חנות ב 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store בכתובת 4ºC. Hoechst הוא מוטגן ידוע שיש להתייחס אליו כמסרטן. לכן, יש להשליך אותו למיכל נפרד.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM ב-DMSO נטול מים
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 מ"מ ב-DMSO/H2O 1:4 (v/v)
דימתיל סולפוקסן (DMSO)	Sigma
סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי	Nikon		משמש ללקיחת שחזורים קונפוקליים של מבנים בעלי תווית חיסונית.
מיקרוסקופ Eclipse Ti-S	Nikon		משמש לצילום תמונות ניגודיות פאזה. עם רכישת תמונה דיגיטלית באמצעות מצלמת QiClick המתממשקת לתוכנת Nikon Elements Basic Research (4.10.01).