הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

19.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55856

⸱

11 ביולי 2017

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Cardiothoracic Surgery, University of Colorado Anschutz Medical Campus

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג טכניקה לבידוד של נוירונים מ WT עכברים neonatal. זה דורש דיסקציה זהיר של חוט השדרה מן העכבר הילוד, ואחריו הפרדת הנוירונים של רקמת חוט השדרה דרך מחשוף מכני אנזימטי.

תקציר

אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות של נוירונים של חוט השדרה. הנוירונים מתקבלים C57BL הילוד / 6 עכברים מבודדים על הלידה 1-3 יום. עכבר המלטה, בדרך כלל 4-10 גורים שנולדו מתוך זוג הרבייה אחד, נאסף לניסוי אחד, מיתרי השדרה נאספים בנפרד מכל עכבר לאחר המתת חסד עם isoflurane. עמוד השדרה הוא גזור החוצה ואז חוט השדרה הוא שוחרר מן הטור. חוט השדרה הם לאחר מכן טחון כדי להגדיל את פני השטח של המשלוח עבור פרוטאז אנזימטי המאפשר נוירונים ותאים אחרים להשתחרר מן הרקמה. Trituration משמש לאחר מכן כדי לשחרר את התאים לתוך פתרון. פתרון זה מחולק לאחר מכן ב שיפוע צפיפות להפריד בין תאים שונים בתמיסה, המאפשר נוירונים להיות מבודדים. בערך 1-2.5 x 10 6 נוירונים יכול להיות מבודדים מקבוצה אחת המלטה. הנוירונים הם seeded אז על בארות מצופה דבק FactoRs המאפשרים צמיחה נכונה והתבגרות. הנוירונים לוקחים בערך 7 ימים כדי להגיע לבגרות במדיום הצמיחה והתרבות וניתן להשתמש בהם לאחר מכן לטיפול וניתוח.

מבוא

הבנת הפתולוגיה של חוט השדרה מחייבת שימוש במודלים שונים, הן ברמה המקרוסקופית והן ברמת המיקרוסקופיה. דגמי בעלי חיים גדולים וקטנים 1 , 2 , 3 משמשים בחקירות vivo של מחלת חוט השדרה ופציעה. בעוד שלומדים נושאים אלה in vivo יש את היתרונות שלה, ניתוח של חוט השדרה מוגבל homogenate חוט השדרה כולו או לסעיפים רקמות 4 . זה יוצר כמה עמימות כאשר מנסים לבודד תגובות ספציפיות ומטרות בעמוד השדרה בין נוירונים תושביה גליה הסובבים אותה. הזמינות הגוברת של עכברים מניפולציות גנטית מאפשרת חקירות מפורטות יותר של הביולוגיה ברמות תאית ומולקולרית. לכן, מודל העכבר הילוד משמש כאן, המאפשר ללמוד את המאפיינים הייחודיים והביולוגיה של נוירונים חוט השדרה במבחנה .

"הבידוד והשימור של נוירונים במבחנה אינו פשוט במיוחד.יש שפע של טכניקות לבידוד נוירון מן רקמת קליפת המוח של מכרסמים בוגרים, כי נראה לגרום למספר ניכר של נוירונים מבודדים ( כלומר מיליונים) 5 , 6 , 7. לעומת זאת, התשואה של נוירונים מרקמת חוט השדרה הוא נמוך 8 , 9 , 10 , בין השאר בשל המסה הקטנה של רקמות.יתר על כן, בעכברים, יש מיעוט יחסית של טכניקות לבידוד של הילודים נוירונים של חוט השדרה, ושיטות קיימות מוגבלים על ידי תשואות נוירונים נמוכות יותר ( כלומר מאות) 9 או מטורפות ומשאבים כבדים טכניקות הדורשות בידוד של עכברים עובריים 10 .

בפרוטוקול זה, אנחנולהשתמש בטכניקה המאפשרת בידוד עלות משאבים יעיל של מספר ניכר של נוירונים מן החוט השדרה של עכברים בילודים. כפי נפוץ בטכניקות שפורסמו בעבר, אנו משתמשים papain כמו פרוטאז אנזימטי, המאפשר לשחרור של נוירונים מרקמת חוט השדרה 5 , 6 . בנוסף, אנו משתמשים שיפוע צפיפות הפרדת תאים מעודן, אשר בעבר הוכח להיות יעיל 6 , 10 . בעוד המדיום שבו תאים מודגרת יכול להשתנות, מניסיוננו כפי שפורסם בעבר 11 , תוספת עם תוסף בינוני B27 בינוני הוכיחה להיות קריטי עבור אריכות ימים נוירון. נוירונים הם בדרך כלל קיימא עבור עד 10 ימים, המאפשר טיפול להתבצע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הטיפול והטיפול בבעלי חיים בהליך זה בוצעו על פי הנחיות הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש באוניברסיטת קולורדו.

1. הכנת פתרונות

  1. הכן ואחסן את כל הפתרונות בטמפרטורות המתאימות, כפי שמוצג בטבלה 1 .

2. ציפוי בארות ושקופיות

הערה: נוירונים לא לדבוק היטב פלסטיק או משטחי זכוכית.

  1. יום אחד לפני הבידוד של הנוירונים, מעיל את הבארות של צלחת 24 תרבות סטרילית עם 0.5 מ"ל של פולי-D- ליזין (PDL, טבלה 2 ) ולהשאיר אותו ברדס זרימה למינרית O / N.
    הערה: השיטה המועדפת היא להשתמש 24-גם צלחות מעיל רק בארות מרכז, כמו אידוי מן בארות הפריפריה נוטה להיות מואצת יותר ולהוביל לתוצאות עקבי. בנוסף, זכוכית שקופיות ניתן להציב את הבארות לפני לאO ציפוי. הנוירונים יצרפו את השקופיות זכוכית מצופה ניתן להסיר מאוחר יותר עבור הדמיה מיקרוסקופית נוספת .
  2. ביום של בידוד, להסיר את PDL מן הבארות. לשטוף עם מים סטריליים במשך כמה דקות לפני הסרת כל המים הנותרים ומאפשר להתייבש במשך שעה 1 (ראה להלן).
  3. לאחר ייבוש, מעיל את השקופיות עם laminin ( טבלה 2 ).
    הערה: כ 10 μL של laminin (10 מיקרוגרם / μL) מספיק כדי מעיל כל טוב של צלחת סטרילית 24 גם. זה מעורבב עם μL 340 בינוני (נפח כולל: 350 μL) על מנת לכסות את כל טוב. תן זה לשבת על 2 שעות ב RT ברדס תרבות ולאחר מכן לשאוב לפני ציפוי התאים.

3. קצירת חוט השדרה

הערה: כל המכשירים צריכים להיות autoclaved (135 ° C ו 30 psi עבור מחזורי 4 x 7 דקות) עבור סטריליות.

  1. להרדים 1-3 יום בן C57BL / 6 גורים העכבר בחדר עם isoflurane. לַחֲכוֹת30 s לאחר הפסקת התנועה וקמצוץ את הרגל כדי לאשר חוסר תגובה.
  2. להפריד את הראש מן הגוף באמצעות מספריים, עם גור במצב נוטה.
  3. לייצב את הרגליים האחוריות או זנב וזרועות על השולחן ההליך, עם הצד הגב מול המשתמש.
  4. חותכים את העור באמצעות מספריים איריס מעוקל.
  5. חותכים את חוט השדרה מן האזור המותני רק מעל הירכיים ולהמשיך לחתוך את שני הצדדים של בית החזה להפריד אותו מהגוף.
    הערה: זה דורש דיסקציה זהיר של חוט השדרה מאיברים הקרביים, כדי למנוע נזק מכוון לאיברים אחרים ( איור 1 א ).
  6. לשטוף ברצף במשך 10 שניות ב 3 x 10 ס"מ צלחות פטרי המכיל 5 מ"ל של 0.2 מיקרומטר מסנן מעוקר פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להסיר רקמת עודף.
  7. הכנס מחט 22 G מזרק מלא 5 מ"ל של מסנן מעוקר PBS אל קצה הזנב של עמוד השדרה ואת סומק cranially, המאפשר את כבל tO היציאה לתוך צלחת פטרי הרביעי ( איור 1b ).
  8. איסוף חוט השדרה בצינור 15 מ"ל עם 5 מ"ל של HABG ( טבלה 1 ) על הקרח. השתמש בזהירות כדי למנוע מוחץ את חוט השדרה.
  9. חזור על שלבים 3.1-3.8 עבור כל גור במיטה.
    הערה: באופן אידיאלי, תהליך זה צריך לקחת פחות מ -30 דקות לכל חוט השדרה כדי להבטיח בידוד נוירון בריא.

4. בידוד נוירונים

הערה: השלב הבא צריך להתבצע מכסה המנוע זרימה למינרית. היכרות עם טכניקה סטרילית בסיסית צפויה.

  1. רקמות
    1. קח את הצינור המכיל את חוט השדרה ולנער קלות להשעות את הרקמה.
    2. יוצקים רקמות מן הצינור לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ זכוכית וקוביות עם להב גילוח כדי ליצור חתיכות בסדר ~ 0.5 מ"מ בגודל.
    3. מעבירים את הרקמה עם פיפטה רחב נשא לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של HABG.
    4. מניחים אותו ב30 ° C אמבטיה למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים לאזן בטמפרטורה זו. שמור את התאים על שייקר מספיק רק כדי לאפשר להם להיות מושעה בנוזל.
      הערה: צעד זה נעשה כדי למנוע מזעזע את התאים עם המעבר מן הקרח המדיום העיכול. שמירה על התאים ב 30 מעלות צלזיוס מסייעת להפחית את המוות התא הקשורים מטבוליזם מוגברת אחרת ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכן את המדיום העיכול ( טבלה 1 ).
  3. הכן את שיפוע צפיפות (טבלה 1).
    1. הכן כל אחת 4 שכבות 4 צינורות נפרדים 15 מ"ל, כפי שתואר בטבלה 1 .
    2. הוסף 1 מ"ל מכל שכבה לתוך צינור 15 מ"ל חדש. התחל עם שכבה 1 בתחתית להוסיף ברצף עד להגיע השכבה 4 בראש. הימנע להפריע את השכבות תוך הוספת.
  4. לשטוף את צלחות מצופה PDL משלב 2.2. לשטוף עם מים סטריליים במשך כמה דקות לפני הסרת כל המים הנותריםהמאפשר להם להתייבש במשך 1 שעות.
  5. מעבירים את הרקמה המדיום עיכול.
    1. הסר את הצינור המכיל רקמות מן האמבט מים שייקר ב 30 מעלות צלזיוס ולאפשר לו להתיישב במשך כמה דקות.
    2. הסר את צינור העיכול בינוני מן האמבט מים 37 מעלות צלזיוס לשאוב אותו לתוך מזרק לנעול leur.
    3. לשאוב את HABG עודף מן הצינור המכיל רקמות.
    4. השתמש leur- לנעול 0.2 מסנן מיקרומטר על המזרק להוסיף בינוני עיכול לצינור המכיל רקמה.
    5. מניחים את הצינור באמבט מים 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שמור על התאים רועד מספיק רק כדי לאפשר להם להיות מושעה בנוזל.
      הערה: חשוב לא לשמור את התאים במדיום העיכול זמן רב מדי או לתת לטמפרטורה להגיע גבוה מדי, אשר עלול להוביל לעיכול מופרז וכתוצאה מכך הרקמה הופכת תלויה בתערובת ג'לטין.
  6. במהלך תקופה זו, מעיל laminin כמו בשלב 2.3.
  7. לבצע טחינה ( כלומר, הפרדת התאים מן הרקמה).
    1. הסר את הצינור מן רועד 30 מעלות צלזיוס אמבט מים ולאפשר לו להסתפק דקות ספורות.
    2. לשאוב עודף מערכת העיכול.
    3. להשעות את הרקמה ב 2 מ"ל של HABG.
    4. באמצעות פיפטה צרה נשא, triturate 10x במשך 45 שניות.
      הערה: זה כנראה הצעד החשוב ביותר אחד יכול להפחית באופן משמעותי את התשואה אם ​​לא נעשה כראוי.
      1. לשאוב את הרקמה לתוך פיפטה ומיד לרוקן את התוכן בחזרה.
      2. הימנע החדרת אוויר, שכן זה יהיה להפחית באופן משמעותי את התשואה קיימא.
        הערה: פיפטה האידיאלי הוא פיפטה זכוכית 9. קצה פיפטה צריך להיות מלוטש כדי להחליק את המשטחים הגסים.זה צריך להיות siliconized על ידי מיקום ב 1:20 פתרון של dichlorodimethylsilane (DMDCS) ב chloroform ו שמאל O / N. לאחר מכן, יש להסיר את פיפטה מותר לאוויר יבשהוא יהיה autoclaved עבור עיקור.
        זהירות: DMDCS ו chloroform הם דליקים מאוד, siliconizing צריך להתבצע במנדף קטר.
    5. לשאוב את מ"ל העליון של supernatant ומכניסים אותו לתוך צינור חדש 15 מ"ל שכותרתו "אוסף".
    6. חזור על שלבים 4.7.3-4.7.5 שתי פעמים נוספות (צינור איסוף התא צריך 6 מ"ל בסוף).
    7. לאט להעביר את התוכן צינור אוסף לתוך צינור שיפוע מוכן בשלב 4.2, הימנעות הפרעה של שיפוע.
  8. בשלב זה, להסיר את המדיום neurobasal מוכן מראש ( טבלה 1 ) מהמקרר ולאפשר לו להתחמם ב 37 ° C אמבטיה.
  9. לטהר את הנוירונים.
    1. צנטריפוגה צינור שפופרת במשך 15 דקות ב 800 xg ו 22 ° C.
    2. אסוף את השכבה הרצויה (ים) עם פיפטה ( איור 2 ) ו במקום צינור חדש 15 מ"ל. עבור נוירו הגבוהה ביותר טוהרN בידוד ( כלומר > 90%), לאסוף שכבה 3. לקבלת תשואה יותר עם פחות טוהר ( כלומר > 70-80%), לאסוף שכבות 2 & 3.
    3. לדלל את שיפוע צפיפות על ידי הוספת 5 מ"ל של HABG לשכבות שנאספו זה עתה.
    4. צנטריפוגה ב XG 200 דקות 2 ב 22 ° C.
    5. מחק supernatant, מחדש להשעות 5 מ"ל של HABG, וכן קפיצי גלולה להשעות את התאים.
    6. צנטריפוגה ב 2 דקות x 200 ב 22 ° C.
    7. מחק supernatant, resuspend ב 3 מ"ל של המדיום neurobasal, ואת קפיצי גלולה resuspend התאים.
  10. ספירת התאים.
    1. קח 10 μL של הפתרון, עכשיו עם תאים במדיום neurobasal, ומערבבים עם 10 μL של כחול Trypan.
    2. מקום 10 μL של תערובת זו בספירת זכוכית ספירה.
    3. באמצעות תא ספירת זכוכית רגילה, לספור את מספר התאים בכל אחד מארבע 4 x 4 הרביעים. הוסף את כל התאים נספר (n), רברובד של 2 (גורם דילול), לחלק 4 (מספר הרביעים נספר), להכפיל את ידי 3 (נפח המדיום neurobasal), להכפיל ידי 10 4 כדי להשיג את ריכוז התאים בתאים / מ"ל.
      figure-protocol-1
  11. זרע את התאים על לוחות תרבות
    1. לדלל את ההשעיה התא 300,000 תאים 1 מ"ל של המדיום neurobasal.
      הערה: בהתבסס על ריכוז של תאים שהתקבלו בשלבים לעיל, בינוני נוירובאס נוסף נוסף כדי להשיג ריכוז סופי של 3 * 10 5 תאים / מ"ל. המשוואה היא C 1 V 1 = C 2 V 2 , כאשר C 1 הוא הריכוז הראשוני של תאים המתקבלים מן הקציר; V 1 הוא 3 מ"ל; ו C 2 הוא 3 * 10 5 תאים / מ"ל, כפי שפורט לעיל. המשוואה נפתרת עבור V 2 . הוסף את נפח המדיום neurobasal צורך להפוך את הנפח הכולל של תאים בפתרון שווהאשר.
    2. לנער בעדינות כדי להפיץ את התאים בפתרון ולהוסיף 1 מ"ל היטב כל מצופים 24-גם צלחות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות טכניקה זו, יחיד המלטה (4-10 גורים) מאפשר בידוד של 1-2.5 10 6 נוירונים מתאים זריעה על צלחות תרבות. בדרך כלל, בארות 4-8 הם seeded בריכוז שהוזכר לעיל ( כלומר 300,000 תאים / מ"ל). איור 3 מראה את המראה של נוירונים בריכוז זה לאחר שבוע בתרבות ב נמוך ( א ) גבוה ( ב ) מיקרוסקופ אור הגדלה. עם זאת, יש לנו גם מסוגל לתאי התרבות בריכוזים גבוהים כמו 500,000 תאים / טוב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טכניקה זו מאפשרת תרבות אמין של נוירונים חוט השדרה. לאחר מיומנות הטכניקה מושגת, זה לוקח בערך 3.5 שעות כדי להשלים. הצלחנו לבצע את הבידוד של נוירונים מ 2 litters נפרדים (16 סה"כ עכברים) כ 4 שעות. צעד המפתח היתכנות היא היכולת לחלץ את חוט השדרה מן העכברים. התשואה מאפשרת ציפוי כמה בארות ועל היכולת לבחון את הנוירונים בתנאים שונים. הצלחנו לטפל נוירונים לאחר בגרות להעריך באופן אמין ביטוי חלבון באמצעות ניתוח כתם המערבי. יתר על כן, באמצעות שקופיות זכוכית בתוך הבארות עבור קבצים מצורפים נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין גילויים.

תודות

למחברים אין תודות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Hibernate A בינוני - 500 מ"לThermo-FisherA1247501https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501
Hibernate A מינוס סידן - 500 מ"לBrainbitsHA-Cahttp://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/
Glutamax 100X - 100 מ"לThermo-Fisher35050061 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079
תוסף B27 50X - 10 מ"לתרמו-פישר17504044https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044
פפאין, ליופיליזציה - 100 מ"גוורת'ינגטוןLS003119http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html
נוירובזל A בינוני - 500 מ"לתרמו-פישר10888022https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח"ל/מ"ל)תרמו-פישר15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
פולי-די-ליזין (PDL) הידרוברומיד - 5 מ"גלמינין עכבר http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US סיגמא-אולדריץP6407-5 מ"
ג - 1 מ"גתרמו-פישר23017015https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015
טריפאן כחול - 20 מ"לסיגמא-אולדריץ'T8154-20 מ"לhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US
שיפוע צפיפות OptiPrep בינוני - 250 מ"לסיגמא-אולדריץ'D1556-250 מ"לhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US
דיכלורודימתילסילן ( DMDCS, סיגמא סיליקואט)סיגמא-אולדריץ'440272-100 מ"ל
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US כלורופורםסיגמא-אולדריץ'288306-1 ליטר
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US זכוכית פיפטה - 9 אינץ'סיגמא-אולדריץ'13-678-20C
נורת פיפטה http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US - 5 מ"לSigma-AldrichZ186678-3EAhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1
BRAND®   צלחת פטרי, זכוכית - 60 x 15 מ"מSigma-AldrichBR455717-10EAhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US
צלחת תרבית תאים סטרילית 24 בארותSigma-AldrichM8812-100EAhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US
Hausser Hemacytometer (תא ספירת זכוכית)פישר סיינטיפיק02-671-6
https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 שקופיות זכוכית - זכוכית כיסוי סטרילית 12 מ"מ - לא מצופהNeuvitroGG-12-1.5-Pre
http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm NeuN Rabbit נוגדן חד שבטי - 100 ומיקרו; LAbcamab177487לאחר קיבוע בפרפורמלדהיד (PFA) וחסימה עם 5% BSA, תאים על כיסוי כיסוי של 12 מ"מ הודגרו בנוגדנים מדוללים 1:200 למשך 18 שעות ב-4 מעלות;
C MAP-2 נוגדן חד שבטי לעכבר - 50 ומיקרו; LAbcamab11267לאחר קיבוע בפרפורמלדהיד וחסימה עם 5% BSA, תאים על כיסוי כיסוי של 12 מ"מ הודגרו בנוגדנים מדוללים 1:500 למשך 18 שעות ב-4 מעלות; ג
'

מקורות

  1. Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
  2. Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
  3. Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  5. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
  6. Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
  7. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
  8. Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
  9. Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
  10. Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
  11. Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  12. Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
  13. Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
  14. Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
  15. Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
  16. Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
  17. Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
  18. Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בידוד נוירוניםתרבית תאיםטכניקת טריטורציהסנטריפוגה במדרג צפיפותתמיסת HABGמצע Neurobasalזריעת תאיםהבשלה של נוירונים
נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.