תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים

Summary

בשיטה זו, אנו משתמשים photopolymerization, לחץ על כימיה טכניקות ליצירת דפוסים חלבון או פפטיד על פני השטח של hydrogels פוליאתילן גליקול (PEG), מתן מתאושש אותות ביו לצורך המחקר של תגובות הסלולר במבחנה .

Abstract

ישנם גירויים ביולוגיים רבים יכולים להשפיע על התנהגות תאית התמיינות תאי גזע. גישות התרבות התא הכללית להסתמך על גורמים מסיסים בתוך המדיום כדי לשלוט בהתנהגות התא. עם זאת, תוספות מסיסים לא יכולים לחקות מסוימים איתות מוטיבים, כגון גורמי גדילה מטריקס מכורך איתות התא-התא, רמזים הביוכימי המרחבי, אשר נפוץ השפעות על תאים. יתר על כן, מאפיינים ביופיזיקלי של המטריקס, כגון קשיחות המצע, לשחק תפקידים חשובים בגורל התא, אשר לא בקלות מטופל באמצעות תא קונבנציונאלי culturing פרקטיקות. בשיטה זו, אנו מתארים פרוטוקול ישיר לספק חלבונים ביו בדוגמת על hydrogels סינתטי פוליאתילן גליקול (PEG) באמצעות פוטוכימיה. פלטפורמה זו מאפשרת שליטה עצמאית של המצע נוקשות ועל סימנים ביוכימיים מרחבית. Hydrogels אלה ניתן להשיג מגוון רחב של ערכים נוקשות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, המשטחים של אלה hydrogels יכול להיות photopatterned עם פפטידים ביו או חלבונים באמצעות תיול-ene לחץ על תגובות כימיה. שיטות אלה מוטבו כדי לשמור על תפקוד החלבון לאחר הנייח משטח. זהו פרוטוקול צדדי ניתן להחיל על כל חלבון או פפטיד עניין כדי ליצור מגוון של תבניות. לבסוף, תאים נזרע על גבי המשטחים של אלה hydrogels ביואקטיביות ניתן לנטר לאורך זמן גם הם להגיב על אותות ספציפית במרחב.

Introduction

ישנם גירויים רבים המשפיעים בהתנהגות התא. באופן כללי, טכניקות culturing תא אופייני להסתמך על גורמים מסיסים להפיק תגובות הסלולר; עם זאת, קיימות מגבלות לגישה זו. שיטות אלה אינם מסוגלים להציג במדויק כל המוטיבים איתות מתמקמות ויוו. מנגנוני איתות כאלה כוללים גורמי גדילה מוחרמת, איתות התא-התא סימנים ביוכימיים ספציפיים במרחב. יתר על כן, קשיחות המצע יכול לשחק תפקיד חשוב התנהגות תאית התמיינות תאי גזע, לא בקלות מטופל באמצעות נפוצות תא culturing שיטות^1,2. גישות biomaterial מציעים פלטפורמה חדשה להתחיל לחקור מנגנונים אלה איתות. בפרט, hydrogels הם מועמדים מצוינים עבור כוונון המצע נוקשות^3,4, שיתק חלבונים ופפטידים^5,6, ויצירת דפוסי במרחב מסוים^{7, 8}.

Hydrogels משמשים בתור פיגומים בהנדסת רקמות עקב שלהם מכנה משותף biophysical וביוכימי עם מטריצה חוץ-תאית (ECM)^9,10. פולימרים טבעיים הם אפשרויות נפוצות פיגומים, הם מסתיימים, נמצאים ברקמות רבות בגוף. המגבלה של שימוש פולימרים טבעיים בשם דיאלקטריים היא היעדר בקלות בעורמה moieties כימיים עבור bioconjugation. מצד שני, hydrogels סינתטי, וככזה כמו יתד, הם מצוינים פלטפורמות בדיקות, הביוכימיה יישוב^11,12. בנוסף, פג hydrogels לא זכה לתגובה הסלולר, ולכן משמשים כמו עמוד השדרה אינרטי ליצירת ביו פיגומים.

כדי ליצור hydrogels ביו, הן photopolymerization והן תיול-ene לחץ על כימיה תגובות הם מועסקים. Photoreactions אלה דורשים photoinitiator של מקור אור UV. כאשר photoinitiators מוצגים בפני אור UV, חוב לבשר טופס רדיקלים. תזות רדיקלים הדרושים לאתחול התגובה אך יכול להשפיע לרעה על חלבון bioactivity^12,13. לכן, זה הכרחי למטב את photoinitiator ושעות החשיפה UV כדי לשמור על חלבון bioactivity.

בשיטה זו, hydrogels הם מסונתז דרך אקרילט-אקרילט שרשרת צמיחה photopolymerization. מונומרים פג-diacrylate (PEGDA) מגיבים עם השני כדי ליצור רשתות פולימריות מסועף אחראי על המבנה של הידרוג. הריכוז של מונומרים PEGDA בתוך הפתרון קודמן ג'ל ישלוט הקשיחות המצע. עקב הקטן גודל של הידרוג הנקבוביות, ECM חלבונים כגון fibronectin ניתן לשלב בקלות בתוך הידרוג לצורך התא מצורף. לבסוף, hydrogels אלה יכול להיות בדוגמת השטח עם פפטידים ביו או חלבונים באמצעות תיול-ene לחץ על תגובות כימיה. כאן, unreacted acrylates חינם בתוך מערכת הידרוג יגיבו תיולים חינם ממוקמים חלבון או פפטיד בעת חשיפה לאור UV. לאחר חלבונים או פפטידים נמצאים ותשמרו על פני הידרוג, הידרוג ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות מבלי לאבד את bioactivity. זה מציע נוחות, תכנון ניסויי גמיש, ועל האפשרות לשיתוף פעולה בין מעבדות. בסך הכל, פלטפורמה זו מאפשרת biomechanical המרחבי הביוכימי ושליטה, תלויות זו בזו, על ההזדמנות להשפיע על התנהגות הסלולר.

Protocol

1. הכנה של חומרים עבור הידרוג סינתזה

פתרונות מניות הכן

1. PEGDA, phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate סוללת ליתיום (LAP) ו fibronectin בתנאים סטריליים, המבוסס על חישובים (טבלה 1A).
   1. שוקל, מתמוסס. תרכובות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). בדרך כלל, לשמור על PEGDA עובד פתרון ריכוזים בין 50 ל- 200 מ"ג/מ"ל (5-20% משקל/נפח). Pipette הפתרון PEGDA דרך מסנן מזרק 0.22-מיקרומטר עבור עיקור.
      הערה: לשמור את הפתרונות PEGDA מכוסה ברדיד גלישת כדי להגן עליהם מפני אור. להכין פתרון טריים של PEGDA (מומלץ) עבור ניסוי.
   אבקת
   2. לשקם fibronectin חלבון מבוסס על היצרן ' s המלצה. לשמור על הפתרון מניות fibronectin ב 1 מ"ג/מ"ל, aliquot אותו 60 – 100 µL aliquots, ואחסן אותם ב-20 ° C עד השימוש. מפשירים את aliquots ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות או למשך הלילה לפני השימוש. אם המניה חלבון לא מסופק כבר בתנאים סטריליים, השתמש במסנן מזרק מיקרומטר 0.22 עבור עיקור.
      הערה: Fibronectin משמש עבור התא מצורף. . הרבה חלבונים אחרים ECM.
   3. שוקל את הברכיים עבור הפתרון מניות, להמיס ב- PBS; ריכוז מניות טיפוסי הוא 25 מ"ג/מ"ל. Sonicate אם יש בעיות עם המסת. עוברים את הפתרון מסנן מיקרומטר 0.22 עבור עיקור. לכסות את הברכיים עם אריזה רדיד ולשמור אותו ב 4 ° C עבור אפילו מספר חודשים.
      הערה: אירוטי הוא photoinitiator המשמש את פוטוכימיה.
2. להכין בתבניות שקופיות זכוכית סטריליים הידרוג היווצרות.
   1. אוטוקלב פוליאסטר גיליון אחד נדרש עבור כל עובש ג'ל. משרים שתי שקופיות זכוכית, מפרידי פלסטיק 3 (בעובי 0.5 מ"מ) עבור כל עובש ג'ל ב- 70% אתנול כבר לפחות שעתיים, אך בדרך כלל מאפשרים להם להשרות למשך הלילה. להשרות חמישה סרטונים בינדר עובש ג'ל כל 70% אתנול במשך 10 דקות לפני השימוש,.
   2. למקם את שקופיות זכוכית, מפרידי וקבצי בינדר על גבי סדין בלוק קטן בשכונה התרבות התא כדי לאפשר להם לאוויר יבש למשך מספר שעות.
   3. להכין בתבניות הידרוג על-ידי הצבת מפרידי כלי פלסטיק סביב קצה זכוכית. במקום השקופית השניה זכוכית על העליונה. לאבטח קפיציות בחוזקה אחד ליד השני עם קטעי בינדר, שניים בכל צד ארוך ואחד למעלה.
      הערה: אם זה לא כראוי התכנסה, הפתרון ג'ל תדלוף החוצה.
   4. לעקר השטח העובש עם תרבית תאים הוד אולטרא סגול במשך 30 דקות לפני השימוש. באמצע, להעיף התבנית כדי לחשוף את שני המשטחים.

2. שינוי חלבונים עם תיול חינם

1. להכין מלאי פתרונות באמצעות חישובים מהגיליון להמרת amine תיול-חלבונים (טבלה 1A).
   1. כדי להפוך את מאגר התגובה, להתאים את PBS ל pH 8 ולהוסיף 5 מ מ EDTA. פיפטה מאגר התגובה לתוך מזרק מיקרומטר 0.22 מסנן עבור עיקור.
      הערה: EDTA חשוב, כמו זה מגן תיולים ויוצרים קשרים דיסולפידי. קבוצות תיול חייבים להישאר בצורתם מופחת עבור התגובה להתרחש.
   2. שוקל את 2-iminothiolane (Traut ' s ריאגנט) להמיס במאגר התגובה על ריכוז פתרון מניות של 2 מ"ג/מ"ל (14 מ מ). עוברים את הפתרון 0.22-מיקרומטר מזרק מסנן עבור עיקור. לאחסן את הפתרון מניות ב 4 ° C עבור אפילו מספר חודשים.
      הערה: 2-iminothiolane הוא מולקולת מגיב עם הממס החשופים אמינים חינם על החלבונים, וממירה אותם לתוך תיולים בחינם.
   3. לשקם את החלבון במאגר התגובה-ריכוז בין 0.1 1 מ"ג/מ"ל. אלא אם כן בעבר סטרילי, pipette פתרון זה דרך מסנן מזרק 0.22-מיקרומטר עבור עיקור.
      הערה: חלבון זה הוא האות הביוכימי בדוגמת על גבי המשטח הידרוג. בנוסף, בזמן ריכוז חלבון יכול להשתנות, ריכוז גבוה הינם אידיאליים עבור תבניות חלבון חזקה יותר.
2. להגיב החלבון עם 2-iminothiolane על ידי ערבוב שני פתרונות מניות יחד; להשתמש 1B טבלה לחישוב היחס אמצעי האחסון הנכון. בדרך כלל, משתמשים יחס טוחנת של 8:1 2-iminothiolane לחלבון.
   הערה: עבור חלבונים גדולים יותר או יותר לדלל את ריכוז, השתמש טוחנת יחס גבוה של 2-iminothiolane. להפנות ליצרן ' s פרוטוקול ¹⁵.
3. דגירה התגובה לשעה בטמפרטורת החדר. השתמש ספין desalting מיקרו-עמודה כדי להסיר את המוצר חלבון thiolated שני המגיבים הנותרים, בעקבות היצרן ' s פרוטוקול ¹⁶.
   הערה: למגבלת אי-הכללה של שרף זה הוא 5 KDa.
4. שימוש אלמן ' s Assay באופן כמותי מודדים את מספר תיולים חינם לכל חלבון. בצע את היצרן ' פרוטוקול s עבור ה assay ¹⁷.

3. היווצרות הידרוג

1. יצירת הפתרון קודמן ג'ל המבוסס על ערכים מחושבים מתוך הטבלה 1C. מערבבים יחד את PEGDA fibronectin, הברכיים כרכים. Pipette הפתרון נמרצות כדי להבטיח פתרון הומוגני, אך להימנע מיצירת בועות. לשמור את הפתרון מוגן מפני אור.
2. Pipette הפתרון קודמן ג'ל בזהירות בין שקופיות זכוכית שני התבנית ג'ל. בדרך כלל, להוסיף אמצעי בין 800 ל- 1,000 µL את העובש. לחשוף את הפתרון ג'ל ב כייר לאור UV (אורך גל: 365 ננומטר, כוח: 3-4 mW/cm ²) למשך 1-2 דקות ליצור את הידרוג-
   הערה: אינם חושפים את הידרוג לאור UV ממושך, כמו זה יגביל את החלבון השטח תכנים יכולות.
3. להוריד את הקליפים בינדר ולהסיר בעדינות שקופיות זכוכית העליון על-ידי החלת מול הלחץ קפיציות דו צדדי.
4. להשתמש אגרוף ביופסיה בגודל מתאים כדי לגזור את הדגימות הידרוג. אגרוף hydrogels מרובים מהמלבן ג'ל כדי לשמש משכפל ולשלוט דגימות.

4. נוקשות הידרוג מדידות

1. אגרוף החוצה hydrogels עם 8 מ מ קוטר ביופסיה אגרוף עבור rheometer צלחת מקבילים 8 מ מ. טען דוגמא הידרוג אחת rheometer (ראה טבלה של חומרים).
2. התחתונה הגיאומטריה צלחת מקבילים זה 8 מ"מ בקוטר עד עשיית קשר עם פני השטח של הג'ל. שמרו על פער מרחק של 0.5 מ מ עבור מדגם 0.5 מ מעבה הידרוג-
3. בצע מטאטא זמן עבור 5 דקות ב- 0.1% זן, תדירות 0.1 Hz ו 37 ° ג ממוצע ג'י ' ערכים על-פני כל הזמן לטאטא. לרוץ עצמאית hydrogels עבור בית הרכב אחד.
   הערה: ג'י ' ערכים צריך להיות יציב לאורך זמן נקודות; אם הם לא, אחוז זן מטאטא תדירות לבצע כדי לבחור את המתאימה ערכים ¹⁴.

5. חלבון המתבנת

1. להכין התבנית הרצויה עבור photomask באמצעות תוכנית עיצוב (CAD) באמצעות מחשב. הדפס את photomask על סדין שקוף באמצעות מדפסת המדפיסה ברזולוציה גבוהה. משרים את photomask 70% אתנול במשך 10 דקות לפני השימוש. לאפשר את photomask אוויר יבש בשכונה התרבות התא לפני השימוש.
2. להוסיף את הפתרון חלבון thiolated מוכנים בשלב 2 אל פני השטח של הידרוג משטח המתבנת. Pipette 1-2 µL/cm ² בפתרון חלבון thiolated אל פני השטח של ג'ל לגזור את כל.
   הערה: חשוב למזער את האחסון חלבון; להוסיף רק מספיק כדי לכסות את כל פני השטח של המדגם הידרוג באופן שווה.
3. במקום בקפידה את photomask על פני השטח של הידרוג. אל תאפשר בועות אוויר בין photomask את פני השטח הידרוג. בעדינות לחץ כלפי מטה את המסיכה כדי להסיר את כל הבועות טופס זה.
4. לחשוף את הידרוג לסיבוב שני של אור UV (אורך גל: 365 ננומטר, כוח: 3-4 mW/cm ²) במשך 30-60 ס
   הערה: חשוב חשיפה התבנית מספיק אור UV כדי ליצור דפוס חזק ללא גרימת ההפסד של פונקציה של חלבונים-
5. לרחוץ את hydrogels עם PBS כדי להסיר מינים unreacted ומניחים כל הידרוג בתוך הצלחת היטב. היה זהיר בעת הצבת ג'לים של כל טוב; ודא כי הפנים את השטח סולידיות. לשטוף את ג'ל ב- PBS ב 4 ° C; ג'לים יציבים במשך שבועיים לפחות ב-4 מעלות צלזיוס

6. לקראת זריעה תא Hydrogels

1. דגירה של ג'לים הבזליים בינוני למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני זריעה. לשימוש יפתור תאי אנדותל (HUVECs), EGM-2 בינוני ללא גורמי גדילה. למזער את נפח בינוני נוסף לכל גם כדי למנוע הידרוג צף. לשימוש צלחת 48-ובכן, נפח 250 µL של המדיום.
2. ספין למטה הצלחת ב- 300 x גרם למשך 3 דקות על מנת להבטיח hydrogels ממוקמים בתחתית הבאר לא צף. תעשה את זה מייד לפני זריעה תא.

7. תא זריעת על Hydrogels

רגיל סטרילי בתרבית של תאים

1. שימוש תרבות נהלי תא זריעה ונהלים ניסיוני. הסר HUVECs מבחנות תרביות רקמה באמצעות פרוטוקולי ניתוק התא סטנדרטי. כדי לבשל תרביות רקמה עם PBS סטרילי, דגירה עם טריפסין למשך 3-5 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
2. להרוות את המתלים תא trypsinized עם עודף תא בינוני או טריפסין מנטרל פתרון.
3. ספין למטה התליה תא בצנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דק בזהירות להסיר את תגובת שיקוע ולשמור בגדר תא.
4. Resuspend בגדר התאים הבזליים EGM-2 ללא גורמי גדילה. השתמש hemocytometer לספירת תא.
5. 75,000 להוסיף תאים/cm ² כדי הידרוג כל השטח על ידי pipetting לאט לתוך המרכז של כל טוב כדי לא להפריע את ג'ל. להכניס את הצלחת היטב בתוך חממה תרבות התא ב- 37 מעלות צלזיוס. במשך כמה ימים, מעת לעת להסיר את המנה להשגחה.

8. הערכה של Bioactivity

1. התרבות החיידק לילה בהשעיה בתוך מרק ליברות ההשעיה מסלולית-37 ° C ו 200 סל ד. ספין למטה התרבות e. coli, decant, לשקם בגדר תא בהיקף מינימלי של PBS. שוקל החוצה את ליזוזים, לשקם ב 1 מ"ג/מ"ל עבור הפתרון מניות.
2. Pipette של אמצעי אחסון קטן (25 µL) של פתרון מניות ליזוזים לתוך צינורות microcentrifuge. הוסף רמות משתנות של הברכיים photoinitiator (0-12 מ מ) ולחשוף את הדוגמאות כדי 1 דקות של אור UV. בקבוצה נפרדת, להוסיף את אותה כמות של הברכיים (2 מ מ) פתרון ליזוזים ולחשוף דוגמאות משתנות פעמים אור UV (0-4 דקות). כוללים משכפל הטיפול.
3. הוסף נפח שווה מרוכז e. coli פתרון כל מדגם ליזוזים עבור ריכוז חלבון ליזוזים הסופי של 0.5 מ"ג/מ"ל. דגירה הפתרונות מעורב במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
   הערה: פעולה זו מאפשרת זמן ליזוזים פונקציונלי lyse הקיר תא החיידק ושחרור חלבונים בתוך תמיסת.
4. השתמש ליזוזים לא מטופל מודגרות עם e. coli עבור פקד חיובית; מחשיב זאת מידה ביואקטיביות 100%. להשתמש בפתרון ליזוזים מודגרות עם PBS לבד כפקד שלילי.
5. ספין למטה הדוגמאות כדי להסיר שאריות תאים ולשמור את תגובת שיקוע. לרוץ על שיטת ברדפורד לכמת את הריכוז של חלבון בתוך תגובת שיקוע כדי למדוד את כמות בקטריאלי lysate.
6. לרוץ וזמינותו ברדפורד בעקבות היצרן ' s פרוטוקול ¹⁸. לחשב לקפל את השינויים בריכוז חלבון לעומת הפקד שלילי.

Results

הפרוטוקול ליצירת דפוסים ביו על פני השטח של פג hydrogels מודגם באיור1. גיליון אלקטרוני פותחה כדי לחשב את נפח וריכוז עבור כל הפתרונות מניות (טבלה 1 א). חלבונים כדי להיות מרותק למיטה על פני הידרוג עוברות שינוי עם 2-iminothiolane (איור 1B). התגובה הזו מתבצעת באמצעות אמצעי האחסון של הטבלה 1B. הפתרון הידרוג קודמן הינו מוכן עם 10% משקל/נפח של PEGDA עם הברכיים (איור ...

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה ליצירת חלבון ביואקטיביות תבניות עבור יישומים ביולוגיים. ישנם מספר שינויים שניתן להתאים פרוטוקול זה לניסויים שונים. ראשית, דרישות מצורף התא ישתנו עבור סוגי תאים שונים. אם הקובץ המצורף תא המסכן ג'לים נצפית בתחילה, הגדלת ריכוז החלבון ECM בתוך הפתרון קודמן מומלץ. לחלבונים אחרים ECM יכול לשמש במקום fibronectin, כולל סוגים שונים של קולגן, laminin או שילוב שלהם. עבור כל סוג חדש של התא, התא מצורף צריך להיות מוטבת לפני הידרוג המתבנת. פרוטוקול זה מאפשר גם מעוצב משתמש photomasks. בהתבסס על היישום הרצוי, photom...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-diacrylate (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	ניתן לסנתז או לרכוש גם דרך ספקים אחרים. ניתן להשתמש במשקלים מולקולריים שונים.
ליתיום פניל-2,4,6-טרימתיל-בנזויל פוספינאט (LAP)			מסונתז במעבדה
פיברונקטין	קורנינג	356008	ניתן להשתמש בחלבוני חיבור תאים אחרים, כגון למינין, מטריג'ל
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)	Sigma	D8537-500ML
Photomask	FineLine Imaging	n/a	הדפסות מותאמות אישית על גיליונות שקופים עם DPI ברזולוציה גבוהה.
קליפס קלסר ספקים
מקור אור UV קומפקטי (365 ננומטר)	UVP	UVP-21	ניתן להשתמש במקורות אור UV אחרים, נדרש כיול כוח.
2-אימינותיולן (פירס טראוט s Reagent)	Thermo Sci.	26101
אלמן s מגיב: DTNB; 5,5-dithio-bis (2-חומצה ניטרובנזואית)	Thermo Sci.	22582
תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVECs)	לונזה		בין 6-10
EGM-2 Media	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 ללא גורמי גדילה שימש בניסויים. מדיה מלאה EGM-2 שימשה לתחזוקת תאים
0.25% טריפסין EDTA	Life Tech	25200-056
טריפסין מנטרל	Life Tech	R-002-100
צנטריפוגות	שונות
Hemocytometer	Hausser Sci. Bright-line
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0.22 ומיקרו; m מסנן	תא טיפול	229743
1 מ"ל מזרק
זכוכית מיקרוסקופ שקופיות	פישר מדע.	12-550C
מרווחי פלסטיק מוכרים			עובי 0.5 מ"מ
70% אתנול	BICCA	2546.70-1
Bio-shield	Bio-shield	19-150-0010
מגיב ברדפורד	BIO-RAD
- Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
עמודות Microspin	Thermo Sci.
AR-G2 rehometer	TA Instruments