השיטה הנוכחית משמש לזיהוי מעכבי isoform ספציפיים של היסטון deacetylases (HDAC) בתאים הלה על ידי ניתוח UHPLC-MS של סובסטרטים מרובים. זוהי שיטה ללא נוגדנים שפותחו כדי לשקף את פעילות HDAC1, HDAC6 החיים בסביבת תא, בניגוד חד-isoform תא ללא מבחני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
המדידה בו זמנית HDAC1 ופעילות HDAC6 הלה תאים באמצעות UHPLC-MS
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
החיפוש אחר חדש היסטון deacetylase (HDAC) מעכבי היא גוברת ההתעניינות גילוי תרופות. Isoform סלקטיביות באור הזרקורים מאז האישור של romidepsin, מחלקה אני HDAC מעכב טיפול בסרטן, החקירה קליני של מעכבי HDAC6 ספציפיים עבור מיאלומה נפוצה. השיטה הנוכחית משמש כדי לקבוע את פעילות המעכבת של תרכובות מבחן על HDAC1 ועל HDAC6 בתאים. הפעילות isoform נמדד באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית של ביצועים גבוהה במיוחד – ספקטרומטר מסה (UHPLC-MS) ניתוח של סובסטרטים ספציפי מודגרות עם תאים הלה טיפול ללא טיפול. השיטה יש את היתרון של המשקף את הפעילות HDAC אנדוגני של סביבת התא, בניגוד ללא תא הביוכימי מבחני שנערכו על איזופורמים מבודד. יתר על כן, משום שהיא מבוססת על כימות של סובסטרטים סינתטי, השיטה אינה דורשת הכרה נוגדן של חלבונים acetylated אנדוגני. . זה בקלות לצורכי מספר שורות תאים, תהליך אוטומטי. השיטה כבר הוכיח שימושי למצוא את תרכובות סלקטיבית HDAC6 neuroblasts. נציג התוצאות מוצגות כאן עם תקן HDAC מעכבי trichostatin (שאינם ספציפיים), MS275 (HDAC1-ספציפי), tubastatin (HDAC6-ספציפי) באמצעות תאים הלה.
מבוא
HDACs שייך למשפחת אנזימים מסוגלים deacetylate שינויים היסטוניים בתוך מבנה כרומטין. הם גם יש מצעים חלבונים אחרים ציטוזול, ממוקמים תאים תאים שונים. סך של 18 HDAC איזופורמים זוהו עד כה, קשורה עם מספר מנגנונים התא, לרבות ברגולציה של גורמי שעתוק גנים, וכן איתות התא ולהעביר1,2,3,4,5,6,7. מעכבי קטליטי HDAC הופיעו כמו תרופות טיפולית לטיפול בסרטן. רוב מעכבי HDAC כעת אושרה על ידי ה-FDA לטיפול של לימפומה T-cell, מיאלומה נפוצה, הן מעכבי HDAC שאינם ספ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבית תאים
הערה: השלבים הבאים מבוצעות בשכונה רגילה תרביות רקמה. היכרות עם סטרילי טכניקה צפוי.
- התרבות התאים הלה עד 80% confluency בבקבוקון תרבות תא T75 ב MEM בתוספת 10% סרום שור עוברית, פניצילין G (100 U/mL), ואת סטרפטומיצין (100 מ"ג/מ"ל).
הערה: התרבות תאים, וטיפול, פירוק צעדים מתנהלים תחת זרימה שכבתית, בצעדים הדגירה תא ב 37 מעלות צלזיוס הופיעה אווירה humidified של 5% CO2 בתנאים סטריליים. - לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ של DPBS, וארוקן את DPBS ולהוסיף 1 מ"ל של ריאגנט דיסוציאציה התא. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לנתק את התאים.
- 9 מיליליטר MEM תרבות בינוני, ביסודיות resuspend התליה תא, וספירה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להדגים את היישום של השיטה לזיהוי מעכבי לא בררניים, סלקטיבי עבור HDAC1 (מחלקה אני) ו HDAC6 (כיתה IIb), הלה תאים שטופלו תרכובות ידועות סטנדרטי: trichostatin A (לא בררניים בין HDAC1 ו HDAC6)18, MS275 (מעכב סלקטיבי-HDAC1)19ו- tubastatin (מעכב סלקטיבי-HDAC6)20. באמצעות השיטה הנוכחית (איור 1), IC50 ערכים יכול ישירות שיקבע בתאים חיים עבור HDAC1 (על-ידי צפייה MOCPAC deacetylation),.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עיכוב HDAC הוא נושא חם, גילוי תרופות, תוך התמקדות מעכבי HDAC6 סלקטיבית עבור סרטן טיפול21הנוכחי. HDAC סלקטיביות מוערך בדרך כלל על ידי סדרה של מבחני תפוקה גבוהה, ללא תאים, אשר מתכוון לקבוע את העוצמה מעכבות לכיוון HDAC בודדים איזופורמים21. עם זאת, מידת הבררנות של מעכב יש בנוסף לאשר בתאים חיים הערכת המצב acetylation של מצעים חלבון אנדוגני, כגון שינויים היסטוניים (עבור מחלקה אני HDACs) וטובולין (עבור HDAC6). לכן, תא מבחני מעורבים זיהוי נוגדנים (למשל, immunostaining תספי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים להכיר עלות פעולה CM1406 (Epigenetic ביולוגיה כימית). מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי קרן פייר מרסייה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| BATCP | סיגמא-אולדריץ' | B4061 | |
| MAL | סיגמא-אולדריץ' | SCP0168 | שם נרדף: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | סיגמא-אולדריץ' | M2195 | |
| MS275 | סיגמא-אולדריץ' | EPS002 | |
| טריכוסטטין A | סיגמא-אולדריץ' | T8552 | |
| טובסטטין A | סיגמא-אולדריץ' | SML0044 | |
| פישר סיינטיפיק | בדרגת HPLC | ||
| 10596814 | פישר סיינטיפיק | בדרגת LC/MS | |
| H2O, | H2O מזוקק בדרגת | ||
| תאי HeLa | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| דיסוציאציה של תאים מגיב TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, Applichem בדרגת תרבית תאים | 146463 | ||
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| סרום בקר עוברי | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA מאגר | Abcam | ab156034 | |
| טבליות מעכב פרוטאז Sigma-Aldrich | S8820 | ||
| 96 בארות, סטריליות, תחתית שטוחה, מטופלות בתרבית רקמות Corning | VWR | 29442-058 | |
| צלחות 96 בארות, לא סטריליות, V-bottom Corning | VWR | 29442-404 | המשמשות בשלב הצנטריפוגה |
| צלחת 96 בארות, תחתית חרוטית, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | תואמת למערכת Acquity UHPLC |
| צלוחיות תרבית תאים T75 Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| רדיד איטום חום מתקלף | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC מערכת Waters | |||
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| תוכנת אינטגרציה: MassLynx V4.1 | Waters | מספר קטלוגי לא זמין | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | מספר קטלוגי לא זמין | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole | System Waters | מספר קטלוגי לא זמין |
מקורות
- Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
