שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו Hemicellulose בקיר תא צמחים

Summary

פרוטוקול זה נועד להציג שיטה כללית לדמיין ליגנין, תאית, hemicellulose בקירות תא הצמח באמצעות הדמיה ראמאן ניתוח רב משתני.

Abstract

היישום של הדמיה ראמאן כדי ביומסה צמח גדל כי זה יכול להציע מידע מרחבי ומלחבי על פתרונות מימיים. הניתוח אינו דורש בדרך כלל הכנת מדגם נרחב; מידע מבניים וכימיים ניתן להשיג ללא תיוג. עם זאת, כל תמונה ראמאן מכיל אלפי ספקטרום; זה מעלה קשיים בעת חילוץ מידע מוסתר, במיוחד עבור רכיבים עם מבנים כימיים דומים. עבודה זו מציגה ניתוח רב משתני כדי לטפל בבעיה זו. הפרוטוקול קובע שיטה כללית לדמיין את המרכיבים העיקריים, כולל ליגנין, תאית, hemicellulose בתוך קיר התא צמחים. בפרוטוקול זה, נהלים להכנת המדגם, רכישה ספקטרלית, ועיבוד נתונים מתוארים. זה תלוי מאוד במיומנות המפעיל על הכנת המדגם וניתוח נתונים. באמצעות גישה זו, חקירה ראמאן יכול להתבצע על ידי משתמש שאינו מומחה לרכוש higנתונים באיכות h ותוצאות משמעותיות עבור ניתוח קיר התא צמחים.

Introduction

ביומסה צמחית היא המשאב המתחדש הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ; מורכבת בעיקר מליגנין, תאית והמיצלולוז; ונחשבת למקור אטרקטיבי של ביו-אנרגיה וכימיקלים מבוססי ביו¹. למרבה הצער, הוא יכול לעמוד בפני השפלה ולהעניק יציבות הידרוליטית או חוסן מבני לדופן תא הצמח. עמידות כזו מיוחסת לשטח הפנים הנגיש, גודל חלקיקי הביומסה, מידת הפילמור, גבישיות התאית ומחלקת הליגנין². הבנה מקיפה של האופי המבני והכימי של דופן תא הצמח היא אפוא משמעותית מנקודת המבט של הביולוגיה והכימיה של הצמח, כמו גם מנקודת המבט של השימוש המסחרי. ניתוחים כימיים רטובים נפוצים, כגון כרומטוגרפיה, ספקטרומטריית מסה וספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית, מספקים רק נתוני הרכב ממוצעים של הדגימה הנמדדת. יתר על כן, שיטות אלו פולשניות והורסות את המבנה המקורי של רקמת הצמח³.

טכניקת הדמיית ראמאן היא כלי רב עוצמה להדמיה לא הרסנית של מידע כימי שנפתר מרחבית⁴. הוא משתמש באור לייזר כדי לגרום לפיזור לא אלסטי עם פוטון ומסתמך על שינויים בקיטוב הנובעים מהתנודות המולקולריות. במקרה זה, מים גורמים לפיזור רמאן חלש, מה שהופך גישה זו למתאימה לחקירות באתרן של דגימות ביולוגיות⁵. היישום של טכניקת הדמיית ראמאן על דופן תא הצמח יכול להבהיר את המבנה וההרכב של דפנות תאי הצמח במצבם המקורי, עם הרזולוציה בקנה המידה של התא הבודד ואפילו של שכבות דופן התא⁶. ניתוח הדמיית ראמאן טיפוסי של דופן תא צמח מורכב בדרך כלל משלושה שלבים: 1) הכנת דגימה, 2) רכישה ספקטרלית ו-3) עיבוד נתונים.

למרות שאחד היתרונות העיקריים של הדמיית ראמאן הוא היכולת להשיג ספקטרום נטול תוויות ולא הרסני עם הכנת דגימה מינימלית, עדיין יש צורך בחיתוך דגימה פיזי כדי לחשוף את פני השטח. יש לבצע תהליך זה בזהירות כדי להשיג משטח ישר, מכיוון שהטכניקה תלויה בשמירה על מיקוד אופטי⁷. רכישה ספקטרלית דורשת איזון בין איכות התמונה לבין זמני רכישה נרחבים⁸. עיבוד הנתונים נועד לחלץ ביעילות את המידע הכימי מנתוני התמונה, במיוחד עבור רכיבים בעלי מבנים כימיים דומים, כגון תאית והמיצלולוז. בשל החפיפה הספקטרלית החזקה, קשה להבחין בספקטרום המדויק. במקרה זה, ניתוח רב-משתני הוא גישה פשוטה לחשוף ביעילות את המידע המבני והכימי המסתיר⁹. עבודה זו מציגה פרוטוקול כללי המתאר את השימוש בהדמיית רמאן כדי להמחיש את המרכיבים העיקריים בדפנות תאי הצמח, כולל ליגנין, תאית והמיצלולוז.

Protocol

1. הכנה לדוגמא

1. לחתוך גוש רקמות קטן (כ 3 מ"מ x 3 מ"מ x 5 מ"מ) מן המדגם צמח ( למשל, גזע צפצפה).
2. לטבול את הרקמה במים רותח deionized למשך 30 דקות. מיד להעביר אותו מים deionized בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות. חזור על שלב זה עד שהרקמה שוקעת לתחתית המיכל, דבר המעיד על כך שהאוויר ברקמות הוסר וכי הרקמה התרככה.
   הערה: עבור הדגימות כי לשקוע לתחתית לפני שלב זה, בדרך כלל לחזור על מחזור זה 3-5 פעמים.
3. הכן 20, 50, 70, 90% (V / V) aliquots של פוליאתילן גליקול (PEG) במים deionized, כמו גם PEG טהור, ולשמור על פתרונות ב 65 מעלות צלזיוס.
4. דגירה הרקמה בסדרה של אמבטיות PEG מדורגת כדי לתפוס את המים ולאפשר PEG להסתנן.
   הערה: בדרך כלל, PEG עם משקל מולקולרי 2,000 (PEG2000) משמש עבור הטבעה.
   1. לעבד את הרקמה עם g(P) 50% PEG עבור 1.5 שעות, (c) 70% PEG עבור 2 שעות, (d) 90% PEG עבור 2 שעות, ו - (ה) 100% PEG למשך 10 שעות.
5. טרום חם קלטת על 65 מעלות צלזיוס בתנור. יוצקים את PEG המכיל את הבלוק לתוך הקלטת ולאחר מכן למקם את בלוק רקמות במצב הרצוי באמצעות פינצטה מראש פינצטה או מחטים.
6. לאט לאט להתקרר את הקלטת ולאחסן את הרקמה ב RT עד לשימוש.
7. לנתח את גוש PEG המכיל את רקמה היעד לתוך גוש קטן (על 1 ס"מ x 1 ס"מ x 2 ס"מ) באמצעות להב סכין חד להרכיב אותו על microtome.
8. גזור חלקים רזים של בלוק PEG (בדרך כלל 3-10 מיקרומטר).
9. שוטפים את החלק עם מים deionized שעון זכוכית 10 פעמים כדי להסיר את PEG מן הרקמה.
10. לטבול את הסעיפים עם טולואן / אתנול (2: 1, V / V) במשך 6 שעות כדי להסיר את extractives. הכן את נוזל התגובה על ידי ערבוב 65 מ"ל של מים deionized, 0.5 מ"ל של חומצה אצטית, ו -0.6 גרם של נתרן chloלטבול בכוס. הוסף סעיף אחד ו 3 מ"ל של נוזל התגובה בקבוקון 5 מ"ל. בורג על החלק העליון של הבקבוקון.
11. מחממים את הבקבוקון באמבט מים על 75 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי להסיר את הליגנין של הרקמה. שוטפים את החלק עם מים deionized שעון זכוכית 10 פעמים.
12. מעבירים את החלק המטופל / delignified לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. לפתוח את הקטע בזהירות באמצעות מברשות או מחטים. הסר את המים deionized נוסף עם נייר טישו.
13. לטבול את הקטע לתוך D ₂ O. לכסות את המדגם עם כיסוי זכוכית להחליק. חותם את כיסוי להחליק עם לק על מנת למנוע את אידוי של D ₂ O.

2. רכישת Spectral

1. פתח את תוכנת ההפעלה המכשיר של מיקרוסקופ ראמאן confocal. הפעל את הלייזר (אורך גל 532 ננומטר), להתמקד על פני השטח של סיליקון גבישי עם מטרה מיקרוסקופ 100X, ולחץ על כפתור הכיול לכייל את המכשיר.
2. הפעל את המכשירלמצב מיקרוסקופ אופטי ולהדליק את מנורת המיקרוסקופ. הר השקופית מיקרוסקופ על הבמה, עם כיסוי להחליק מול המטרה.
3. הצג את המדגם עם מטרה מיקרוסקופ 20X ולאתר את האזור של עניין. החל שמן טבילה coverslip ולעבור למיקרוסקופ טבילה המטרה (60X, הצמצם המספרי NA = 1.35). דגש על פני השטח של המדגם.
4. החלף את המכשיר למצב בדיקה ראמאן לכבות את מנורת מיקרוסקופ.
5. בחר אזור מיפוי באמצעות כלי מלבני. לשנות את גודל צעד כדי לקבוע את מספר הספקטרום שהושג.
   הערה: להיות מודעים לגודל צעד (בדרך כלל גדול יותר מאשר קוטר ספוט מחושב על ידי הצמצם המספרי של המטרה, תיאורטית 1.22λ / NA). הגדלים הבאים יגרמו לדגימת יתר.
6. קבע את הפרמטרים הספקטרליים האופטימליים כדי להשיג את יחס אות לרעש הטוב ביותר (SNR) ואיכות ספקטרלית בזמן רכישה מתאים (בדרך כלל <8 שעות),Nding על ההתאמה המדגם. באופן כללי, הקלט את פרמטרים הדמיה בתוכנת המכשיר כדלקמן: לייזר (532 ננומטר), מסנן (100%), חור (300), חריץ (100), ספקטרומטר (1,840 ס"מ ^-1 ), חריצים (1200t), אובייקטיבי שמן 60X), וזמן הרכישה (2 שניות).
7. שמור את הנתונים ספקטרלי לפני עיבוד נתונים להמיר אותם לפורמט אוניברסלי ( למשל, קבצי TXT).

3. ניתוח נתונים

1. טען את הנתונים ספקטרלי (קבצי TXT) לתוך תוכנת ניתוח נתונים ( למשל, Matlab). החלת טכניקת הפחתת רעש על הנתונים להגדיר כדי לשפר את SNR ( למשל, אלגוריתם Savitssky-Golay או אלגוריתם אדוה)
2. השתמש בדגימות לא מטופלות כדי לייצר את התמונות של ליגנין ופוליסכרידים. עבור הדמיה ליגנין, שקול את שיא רפאים סביב 1,600 ס"מ ^-1 בשל טבעת ארומטית סימטרי מתיחה רטט. עבור הדמיה פוליסכריד (כולל תאית hemicellulose), להשתמש שיא רפאים אעגול 2,889 ס"מ ^-1 בגלל CH ו- CH ₂ .
3. השתמש דגימות delignified כדי ליצור את התמונות של תאית hemicellulose. בצע רזולוציה עצמית עקומת מודלים (SMCR) על הספקטרום רכשה להפלות את הספקטרום של תאית hemicellulose ולתדמיהם ההפצות.
4. ביצוע ניתוח רכיב עיקרי (PCA) וניתוח אשכולות על הנתונים שנרכשו כדי להבדיל בין ספקטרום ראמאן מ שכבות קיר התא השונים.

Results

איור 1 מציג סקירה של מערכת טיפוסי מיקרו ראמאן הדמיה ראמאן של קיר תא צמחים. כדוגמה, ספקטרום ראמאן המקורי של צפצפה ( Populus nigra L.) יש היסודות משמעותיים דוקרנים ( איור 2 א ). לאחר ביצוע שיטת עיבוד אוטומטי מראש עבור נתונים הדמיה ראמאן להגדיר (APRI), אלה שני מזהמים ספקטרליים מוסרים בהצלחה ( איור 2 ב ). ספקטרום ראמאני טיפוסי של צפצפה מוצג

Discussion

קיר תא הצמח הוא מורכב כי מאורגן למספר שכבות, כולל פינת התא (CC), הקיר המשני (SW, עם S1, S2, ו S3 שכבות), ו lamella תרכובת באמצע (CML, lamella באמצע בתוספת העיקרי יסודי קיר), אשר מקשה להשיג משטח שטוח במהלך הכנת המדגם. לפיכך, דגימות צמח, במיוחד הדשא, אשר יש מבנה מסובך יותר מאשר עץ, לעתים קרובות צריך להיות מוצק כדי לאפשר חתך בסדר. PEG הוא מטריצה ​​קשה אידיאלי לחיתוך החקירה ראמאן, שכן הוא מסיס במים. זה ניתן להסיר בקלות על ידי שטיפה במים deionized. PEG המשמש להטבעה יש משקולות מולקולריו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיקרוטום	תרמו מדעי	מיקרום HM430
מיקרוסקופ רמאן קונפוקלי	Horiba Jobin Yvon	Xplora
תנור	שנחאי ZHICHENG	ZXFD-A5040