הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

11.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55913

⸱

12 ביולי 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, 3Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, 4IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, 5Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

עבודה זו מתארת ​​את סטנדרטיזציה של שיטה להשיג אוכלוסיות תאים נבט מטופלים מרקמת האשכים של מינים שונים של יונקים. זהו פרוטוקול פשוט המשלב דיסוציאציה פשוטה מכנית, מכתים עם Hoechst-33342 ו propidium iodide, ו FACS מיון, עם יישומים רחב במחקרים השוואתיים של ביולוגיה הרבייה הגברית.

תקציר

פלואורסצנטי מופעלת תא מיון (FACS) כבר אחת השיטות של בחירה לבודד אוכלוסיות מועשר של תאים נבטיים יונקים נבט. נכון לעכשיו, זה מאפשר את ההפליה של עד 9 אוכלוסיות Murine תא נבט עם תשואה גבוהה וטוהר. זה ברזולוציה גבוהה של אפליה וטיהור אפשרי בשל שינויים ייחודיים במבנה הכרומטין וכמות לאורך spermatogenesis. דפוסים אלה יכולים להיות שנתפסו על ידי cytometry הזרימה של תאים נבט גבריים מוכתמים פלואורסצנטי DNA מחייב צבעים כגון Hoechst-33342 (Hoechst). הנה תיאור מפורט של פרוטוקול שפותחה לאחרונה לבודד תאים נבטיות יונקים יונקים. בקצרה, השעיות תא בודד נוצרים רקמות האשכים על ידי דיסוציאציה מכנית, מוכתם פעמיים עם Hoechst ו propidium יודיד (PI) ומעובד על ידי cytometry הזרימה. אסטרטגיה gating טורי, כולל הבחירה של תאים חיים (PI שלילי) עם תוכן DNA שונים (עוצמת Hoechst), אניS בשימוש FACS מיון כדי להפלות עד 5 סוגי תאים נבט. אלה כוללים, עם ממוצע purities (נקבע על ידי הערכת מיקרוסקופיה): spermatogonia (66%), העיקרי (71%) ו משני (85%) spermatocytes, ו spermatids (90%), עוד מופרדים לתוך עגול (93%) ו הארכת (87%) subpopulations. ביצוע העבודה כולה הוא פשוט, מאפשר בידוד של 4 סוגי תאים בו זמנית עם מכונת FACS המתאים, והוא יכול להתבצע תוך פחות מ 2 שעות. כמו זמן עיבוד מופחת הוא חיוני כדי לשמר את הפיזיולוגיה של תאים vivo לשעבר , שיטה זו אידיאלית עבור מחקרים במורד הזרם גבוהה של ביולוגיה תא נבט הגברי. יתר על כן, פרוטוקול סטנדרטי עבור טיהור multispecies של תאים נבט יונקים מבטלת מקורות מתודולוגיים של משתנים ומאפשר קבוצה אחת של ריאגנטים לשמש מודלים בעלי חיים שונים.

מבוא

בהינתן היעדר של מערכת חוץ גופית נציג של התקדמות spermatogenesis, ואת הנוכחות של הטרוגניות הסלולר גדול testis, מחקרים של ביולוגיה תא נבט זכר דורשים טכניקות חזקות לבודד אוכלוסיות מועשר של סוגי תאים ספציפיים. פלואורסצנטי המופעל תא מיון (FACS) כבר בשימוש נרחב למטרה זו 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , כפי שהוא מספק תשואה גבוהה טוהר, עולה על שיטות בידוד אחרים במספר סוגי נבט תאים כי הוא יכול לזהות ו בחר 6 , 7 , 8 . העיקרון של ניתוח זרימת cytometry מבוסס על זיהוי של דפוסי אור דיפרנציאלי בעקבות עירור קרן לייזר של תאים בודדים. כמו תא עובר דרך הלייזר הוא משקף / מפזר אורבכל זווית, פרופורציונלית לגודל התא (פיזור קדימה, FSC) ולמורכבות תאיים (פיזור צד, SSC). ראה Ormerod 9 לקבלת מידע מפורט על cytometry הזרימה.

תאי נבט זכריים עוברים שינויים ספציפיים בתכולת הדנ"א, מבנה הכרומטין, גודלו וצורתו לאורך שלבים שונים של הזרע. לפיכך, אוכלוסיות תאים שונים ניתן לזהות ולהפריד על ידי שילוב של פיזור אור מכתים דנ"א עם צבעי ניאון 10 , 11 . מספר צבעים יכולים לשמש למטרה זו (נסקרת ב Geisinger ו רודריגז-Casuriaga 3 ), כגון Hoechst-33342 (Hoechst) אשר שימש לעתים קרובות בניתוח cytometry זרימה של תאים האשכים בעשור האחרון 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . אפוN עירור עם אור UV, Hoechst פולט כחול פלואורסצנטי יחסי לתוכן ה- DNA הסלולר בעוד הקרינה אדום רחוק משקף השתנות במבנה הכרומטין דחיסה 1 , 13 , 14 . כתוצאה מכך, תאים נבט זכר בשלבים שונים של בידול התערוכה דפוסים ספציפיים במהלך FACS של השערות תא בודד מוכתם Hoechst (Ho-FACS, 1 , 12 ). מעניין, בשל מנגנון של זרימת צבע כי הוא פעיל רק בשלב spermatogonial, עוצמת הקרינה הכחולה Hoechst אינו פרופורציונלי לתוכן הכרומטין בתאים אלה, והם אשכול כאוכלוסיית צד במהלך Ho-FACS 15 . בנוסף, שילוב מכתים Hoechst עם יומין propidium יופיים לצבוע (PI) מאפשר למשתמשים להפלות לחיות (PI שלילי) מתאים (PI חיובי) תאים במהלך FACS 1 , 2 , 10 , 12 . אסטרטגיה זו שימשה בעבר בניתוח זרימת cytometric של תאים נבטיקולריים ו אופטימיזציה באופן נרחב העכבר להפלות עד 9 סוגי תאים נבט, כולל תאים 4 שלבים שונים של המיוזה אני 1 , 2 , 4 , 16 . לצורך עבודה זו, מכתים Hoechst יש שלושה יתרונות עיקריים. ראשית, Ho-FACS יושמה בהצלחה על בידוד של תאים נבט זכר במודל העכבר 1 , 2 , 12 , ומכרסמים אחרים כגון חולדה ו חזיר 17 , 18 , 19 . שנית, Hoechst הוא צבע תא חדיר ואינו דורש permeabilization הממברנה, ולכן זה preserשלמות תאים Ves. לבסוף, אין צורך בטיפול ב- RNase מאחר שה- Hoechst נקשר באופן מועדף לרצפי DNA של פולי (d [AT]) 1 , 20 , מה שאומר ש- RNA נשמר, ובנוסף לדנ"א ולחלבונים, ניתן להשתמש בו למחקרים מולקולריים נוספים של הנבט התא הבידול.

למרות הדמיון ב- DNA ו / או stainability שנצפו בזרם cytometry ניתוח של מינים יונקים (הנסקרת ב Geisinger ו רודריגז, Casuriaga 3 ), יש כבר מידה רבה של השתנות בפרוטוקולים המתוארים בידוד תא נבט הגברי על ידי cytometry הזרימה. מחקרים שונים השתמשו בפרוטוקולים ספציפיים עבור דיסוציאציה של רקמות, והשתמשו בצבעים שונים של די-אן-אי (לבד או בשילוב) ו- FACS באסטרטגיות מודל שונות, בעיקר עכבר, חולדה וחזירי ים. לפיכך, השוואה ישירה של נתונים שנאספו עבור מינים שונים יכול להיות מושפע על ידי אוקומרכיבים טכניים שלא נוצרו כתוצאה משינויים בין מתודולוגיות. חשוב לציין, שימור מרשים של הדינמיקה הכרומטין לאורך spermatogenesis יונקים (2N-4N-2N-1N) עולה כי פרוטוקול סטנדרטי יכול להיות מיושם על מגוון רחב של מינים יונקים.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח זרימת עבודה אחת כי הוא ישים מינים של יונקים שונים, על ידי שילוב והתאמה טכניקות שפורסמו בעבר 2, 20. סטנדרטיזציה של שיטה לעיבוד רקמות הושגה על ידי ביצוע דיסוציאציה מכנית כדי להתגבר על הצורך מינים ספציפיים התאמות הדרושות לעיכול אנזימטי 5 . ראוי לציין כי ניתוק מכני של רקמת האשכים המכרסמים הוכח לבצע טוב יותר מאשר עיכול רקמות אנזימטיות 20 ו הו FACS של השעיות תא בודד שנוצר על ידי שתי השיטות התערוכהזה תוצאות דומות 5 . כהוכחה עקרונית, פרוטוקול זה מתאר את ההגדרות המשמשים לבודד עד 5 אוכלוסיות תאים נבט: spermatogonia (SPG); ראשוני (SPC I) ו spermatocytes משני (SPC II), ו spermatids (SPD) - סיבוב (rSPD) ו מאריך (eSPD). חשוב לציין, קל ליישם במעבדה, עם הדרישות העיקריות להיות מערכת לרקמות דיסוציאציה וגישה סדרן התא מצויד לייזר UV. זרימת עבודה זו ( איור 1 ) הוא מהיר ופשוט ומאפשר בידוד סימולטני של 4 אוכלוסיות תאים נבט מרקמת האשכים טריים פחות מ 2 שעות. זמן עיבוד מופחת הוא חיוני כדי לשמור על שלמות הסלולר עבור נהלים נוספים במורד הזרם. יתר על כן, הביצועים המוצלחים שלה ב -5 מינים שונים מעידים על כך שניתן להחיל אותה באופן רחב בתוך הצלב היונקי, מה שהופך אותו לשיטה האידיאלית לבודד תאי נבט עבור מחקרים השוואתיים של ביו הרבייה של הרבייה הגבריתאוגי.

פרוטוקול זה מורכב משלושה חלקים עיקריים, מלבד שלבי הכנה: (1) ניתוק מכני של רקמת האשכים ו (2) מכתים של תאים באשכים עם Hoechst ו PI, ואחריו (3) FACS מיון של תאים רלוונטיים spermatogenic. לאחר שנאספו, אוכלוסיות אלה מועשר של תאים שונים נבטיות יונקים תאים יכול לשמש למגוון רחב של יישומים. פרוטוקול זה מתאר "גודל אחד מתאים לכל" שיטת דיסוציאציה לטהר תאים נבט זכר מינים יונקים שונים. בהתאם לסוג המשתמשים במחקר רוצה לנהל עם תאים נבט מבודד, מדיה אחרים או מאגרים ניתן להשתמש. השלבים הבאים פרוטוקול הם להפקת מתלים תא בודד מ testis Murine שלם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים המתוארים להלן עמדו בתקנות הוועדה ללימודי בעלי חיים באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס.

1. ההכנות פרוטוקול דיסוציאציה מכנית

  1. טרום רטוב 50 מיקרומטר רקמות חד פעמיות המחסנית דיסוציאציה של testis Murine שלם.
    הערה: זה מחסנית חד פעמית מחסנית מכיל microblades המיועד חיתוך של רקמות רשת פלדה נייחים עם כ 100 חורים משושה. בגדלים שונים של רשת עבור מחסנית חלוקת רקמות זמינים להתאים את הפרוטוקול הזה מבוסס על מינים סוגי התא הרצוי. 50 מיקרומטר מחסניות שימשו עבור כל מינים יונקים המוזכרים במאמר זה.
    1. טען 1 מ"ל של פנול קר קרח אדום חינם 1x Dulbecco השתנה בינוני הנשר (DMEM) על 50 מיקרומטר רקמות חד פעמי מחסנית דיו.
      הערה: פנול אדום עלול להפריע לזיהוי של פלואורס אדוםCANC במהלך FACS.
    2. לשאוב 1x DMEM מן המחסנית רקמה מחסנית עם מזרק חד פעמיות 3 מ"ל מחט פחות מן הנמל מזרק.
  2. הפעל מערכת הפרדת רקמות על ידי לחיצה על כפתור "ON". מערכת זו אינה דורשת "להתחמם" זמן.
  3. טרום רטוב שלושה 40 מיקרומטר מסננים חד פעמיות עם DMEM קר 1x DMEM. מניחים כל 40 מיקרומטר מסנן חד פעמיות על צינור חרוטי 50 מ"ל. פיפטה 1 מ"ל של 1x DMEM ולאפשר לעבור דרך הנוזל.
  4. הכינו 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי לאוסף של רקמות האשכים. פיפטה 500 μL של DMEM 1x על צלחת פטרי.

2. הכנת רקמות האשכים עבור פרוטוקול דיסוציאציה מכנית

  1. לנתח עכבר זכר להסיר בקפידה כל האשכים טריים או שברי האשכים (אם להתמודד עם מינים יונקים אחרים) עם מספריים כירורגי ומלקחיים.
    הערה: ודא רקמות ללא שומן ונמק. 22 Esh רקמות אשכים לייצר מעולה ההשעיה תא בודד איכות מאשר רקמות קפוא.
    1. העברת שנאספו אשכים / שברי מוכן 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי המכיל 500 μL של DMEM 1x.
    2. בעדינות לשטוף את הרקמה 1x DMEM להסיר תאי דם אדומים (אם קיים).
  2. בזהירות להסיר tunica albuginea. עובי הטוניקה אלבוגינה ישתנה במינים שונים.
    1. לתפוס קצה אחד של testis עם מלקחיים.
    2. לנקב את הקצה השני של testis עם אזמל בעוד עדיין מחזיק את קצה אחד של testis עם מלקחיים משלב הקודם.
    3. לגרד tubules אשכים באמצעות אזמל בעוד עדיין מחזיק את קצה אחד של testis עם מלקחיים משלב 2.2.1.
  3. חותכים tubules האשכים לחתיכות של ~ 2-3 מ"מ 3 באמצעות אזמל.

3. קבלת השעיות תא בודד על ידי דיסוציאציה מכנית של רקמות האשכים

אונטנט "> הערה: שלבי הניתוק המתוארים להלן הם עבור בדיקת עכבר אחת למבוגרים.כרכים של רקמות האשכים של עכברים צעירים או מינים שאינם Murine צריך להיות מותאם בהתאם.בעלי חיים צעירים לא יכול להכיל את כל השלבים של תאים נבט.יש מינים יונקים יש הרכב רקמות האשכים משתנה במהלך עונת הרבייה בהשוואה לעונת ההזדווגות.

  1. מעבירים את חתיכות קטנות אבובית האשכים על 50 מ"מ מראש הרטבה רקמה מחסנית באמצעות מלקחיים ולהוסיף 1 מ"ל של DMEM 1x.
  2. טען את המחסנית רקמות רקמה מערכת רקמות ההפרדה תהליך 5 דקות על ידי סיבוב הכפתור ממצב המתנה למצב "הפעלה".
  3. הסר את המחסנית רקמה רקמה מן מערכת ההפרדה רקמות ההשעיה תא לשאוף עם מזרק חד פעמיות 3 מ"ל מחט פחות מן הנמל מזרק.
    1. לשאוב כמה פעמים כדי להסיר את כל הנוזל ממחסנית רקמות להפריד. לֹאכל 1 מ"ל עשוי להיות התאושש ממחסנית רקמות ההפרדה.
  4. לעבור את ההשעיה תא aspirated דרך שני חד פעמיות מראש הרטובות 40 מסננים מיקרומטר. מסנן פעמיים כדי להסיר כל אגרגט תאים.
    1. מניחים 1 מראש הרטוב מסנן 40 מיקרומטר בצינור חרוטי 50 מ"ל. להוסיף ישירות תאים aspirated במזרק על מסנן 40 מיקרומטר. פיפטה לעבור תנור יחיד ההשעיה עם פיפטה חד פעמיות.
    2. הסר את המסנן מראש הרטוב 40 מיקרומטר מסנן במקום אחר הרטוב מסנן 40 מיקרומטר בצינור 50 מ"ל חרוטי. פיפטה שנאספו ההשעיה תא בודד על מסנן נקי 40 מיקרומטר.
    3. איסוף ההשעיה מסוננים תא בודד עם פיפטה חד פעמיות נקי.
  5. פיפטה סינון ההשעיה התא בחזרה 50 מיקרומטר רקמה מחסנית התפלגות תהליך עוד 5 דקות במערכת רקמות ההפרדה.
  6. לשחזר את כל הנוזל מן dissgregati רקמותעל המחסנית.

4. מכתים עם Hoechst ו Propidium יודיד (PI)

  1. העברת ההשעיה התא התאושש מן 50 מיקרומטר רקמה מחסנית דיו צינור נקי 1.5 מ"ל. כ 1-1.5 מ"ל של ההשעיה תא בודד יהיה התאושש.
  2. מחלקים את ההשעיה התא התאושש יחיד לתוך ארבעה צינורות 1.5 מ"ל או 5 מ"ל.
    1. במשך שלוש צינורות הראשון, פיפטה 150 μL של ההשעיה תא בודד ושאר פיפטה ההשעיה תא בודד לתוך האחרון של ארבע צינורות (כ 550 μL של ההשעיה תא בודד).
      הערה: כמות ההשעיה תא בודד בצינור האחרון עשוי להשתנות בהתאם ליעילות התאוששות ההשעיה התא בשלב 3.6.
  3. הגדר את הצינור הראשון של ארבע צינורות כמו שליטה unstained עבור הפעלה FACS.
  4. הכן צבע יחיד מוכתם (PI או Hoechst) השעיות תא כמו שולטת. הוסף 2.5 μL של Hoechst או 1 μL של PI לכל צינור (השני thiמחקר ופיתוח).
  5. הכן צינור מוכתם פעמיים. זה ישמש לאיסוף subpopulations תא נבט. הוסף 2.5 μL של Hoechst ו 1 μL של PI לצינור האחרון.
    הערה: Hoechst יש חיי מדף של 2-3 חודשים. שימוש במלאי ישן של צבע יגרום שינויים משמעותיים במהלך הפעלה FACS.
  6. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך. מקום דגימות בצינור או לסובב את צינורות 1.5 מ"ל כל 5-10 דקות.
  7. סנן ההשעיה התא עם מסננת מראש הרטוב 40 מיקרומטר ולשמור על פתרון מסונן על הקרח בחושך עד הפגישה FACS.
    הערה: שלב הסינון נחוץ למניעת גושי תאים עבור FACS. בנוסף, טיפול עם DNase (ראה איור 1 ) או 2-Naphthol-6,8-disulfonic חומצה dipotassium מלח (NDA 20 ) ניתן להשתמש כדי להגביל את התא clumping. תקופות המתנה ממושכות ישפיעו על האות ניאון זוהה במהלך FACS ועלול לגרום למוות התא גדל.

5. פלואורסצנטי מופעלת תא מיון (FACS) התקנה וטיהור של תאים האשכים

  1. הכן FACS איסוף צינורות.
    1. מעיל 5 מ"ל פוליפרופילן צינורות התחתונה התחתונה או צינורות 1.5 מ"ל עם μL 400 של FBS עבור אוסף תאים. עודף עודף FBS לאחר ציפוי.
    2. הוסף FACS איסוף בינוני (1x DMEM + 10% בסרום עוברי בסרום, FBS) כדי צינורות: 1 מ"ל עבור 5 צינורות מ"ל או 100 μL עבור צינורות 1.5 מ"ל.
  2. הגדרת תנאי מיון מתאימים של סדרן תאים ותוכנה.
    הערה: תאים אחרים תא מיון ותוכנות הניתוח ניתן להשתמש עם ההתקנה דומה gating אסטרטגיות שתוארו להלן. התנאים המתוארים כאן הותאמו מ- Gaysinskaya ו- Bortvin 2 , Geisinger ו- Rodriguez-Casuriaga 3 , ו- Getun, et al. 4
    1. טען לייזר אולטרה סגול עם 463/25 nm הלהקה לעבור מסנן לזהות Hoechst כחול 680 ננומטר הלהקה לעבור הלהקה כדי לזהות Hoechst אדום כדי לזהות PI.
    2. השתמש במראה dichroic 555DLP להבחין כחול מן הקרינה האדומה.
    3. השתמש זרבובית 70 מיקרומטר תאים מיון בשיעור של 1000-2000 תאים / השני.
      הערה: יעילות המיון מושפעת ישירות משיעור הזרימה. שיעורי זרימה גבוהים (> 3500 אירועים / ים) מגדילים את מהירות המיון אך גורמים לזיהום אוכלוסיות. למידע נוסף, ראה התייחסות 12 .
  3. הגדר שערים באמצעות דגימות בקרה.
    1. לטעון ולהפעיל מדגם unstained.
    2. לא לכלול פסולת התא מבוסס על FSC לעומת דפוס העלילה SSC. פסולת סלולרית יצוץ ברביע השמאלי התחתון של העלילה. באופן שרירותי להגדיר את סף פסולת התא על ידי המשתמש או טכנאי סדרן התא.
    3. שער על תאים בודדים על ידי התאמת סף רוחב FSC ודופק. תאים שונים cellers יש דרכים שונות כדי distinג 'ינג. כמו רוחב הפולס משקף את התאים הזמן לקחת לחצות את הלייזר, תאים בודדים יש ערכים נמוכים יותר בהשוואה אגרגטים multicellular. התאמת סף על מגרש עבור FSC לעומת רוחב הדופק ניתן להשתמש כדי לבחור עבור singlets.
    4. הגדר אופטימלי צינור מכני (PMT) מתח.
    5. השתמש בשני כתמי צבע מוכתם כתם יחיד כדי לקבוע את סף האות PI או Hoechst הקרינה.
      הערה: חשוב לייעל את המתח הבסיסי PTM עבור התאים של עניין על מנת לקבוע את טווח הקרינה הנכון עבור כל צבע. זה קריטי עבור זיהוי אותות אופטימלי ורגישות. תאי הבקרה הלא מוכתמים והמוכתמים משמשים לבניית מגוון של תאים מוכתמים שלילית וחיובית עם צבעי PI ו / או Hoechst ומזעור הרעש באותות. לקבלת הסברים נוספים על אופטימיזציה של מתח PMT באמצעות תאי בקרה, עיין Gaysinskaya ו Bortvin 2
    6. שער על תא חיS מבוסס על מכתים PI (PI שלילי) ו FSC העלילה. תאים מתים יהיה חיובי עבור פלואורסצנטי PI.
    7. הגדר שער תוכן ה- DNA על ידי התוויית היסטוגרמה של ספירת תאים על בסיס פלואורסצנטי כחול Hoechst. 3 פסגות עם ריכוז הולך וגדל של הקרינה הכחולה Hoechst אמור להופיע, המייצג הפלואידים (1C), דיפלואידי (2C), ו tetraploid (4C) תאים. הגדר 3 שערים, אחד לכל שיא.
    8. שימו לב לפחות 500,000 אירועים על FSC לעומת העלילה SSC לפני שתמשיך gating על אוכלוסיות תאים נבט.
  4. שער שונים אוכלוסיות תאים נבט.
    1. טען Hoechst / PI מדגם מוכתם.
    2. הגדר את 3 שערי האב הראשונים המשותפים לכל האוכלוסיות.
      1. לא לכלול פסולת התא מבוסס על FSC לעומת ה- SSC העלילה. בחר singlets מבוסס על FSC לעומת דופק רוחב העלילה. בחר תאים חיים על ידי gating תאים שליליים PI.
    3. הגדר שער spermatogonia.
    4. חלקות PI תאים שליליים המבוססים על Hoechst כחול ואדום הקרינהעוצמות. Spermatogonia מופיעים כאוכלוסיית צד (ראה איור 1 ).
    5. הגדר שערים עבור אוכלוסיות תאים נבט הנותרים. הערה: ראה איור 1 ואיור משלים 2 לפרטים חזותיים.
    6. מגרש PI תאים שליליים בשער התוכן DNA.
      1. עבור שער spermatids השיא עם פלואורסצנטי Hoechst הנמוך ביותר (1C).
      2. עבור spermatocytes II, השער את השיא עם בינוני הקרינה Hoechst (2C).
      3. עבור spermatocytes אני, השער את השיא עם הקרינה הגבוהה ביותר Hoechst (4C).
    7. מגרש Hoechst כחול ואדום עוצמת הקרינה לחדד spermatocytes ו spermatids אוכלוסיות משערי תוכן ה- DNA.
  5. לאסוף את השערים subpopulation שנבחרו לתוך צינורות איסוף שהוכן בעבר. כל testis ייקח בממוצע 45 דקות עד 1.5 שעות לאסוף כ 0.5-6.0 x 10 6 תאים עבור כל subpopulation.
    הערה: חשיפה ממושכת לתא ל- Hoechst maY מעט לשנות את המיקום של אוכלוסיות עם הזמן. רענן את ההגדרות לאחר 20-30 דקות של FACS. התשואה המקסימלית לכל תת-אוכלוסייה תהיה מותנית ביעילות של שלב ניתוק.

6. הערכה מיקרוסקופית של תאים מטוהרים

  1. ספין תאים שנאספו ב XG 500-600 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  2. Re- להשעות תא גלולה עם 1 מ"ל של פתרון קר 1x פוספט חיץ (PBS) או 1x DMEM.
    הערה: ניתן לשנות את עוצמת ההשעיה מחדש בהתאם למספר התאים הממוינים ולריכוז הסופי הרצוי.
  3. פיפטה 40 μL של תאים שטפו על גבי שקופית זכוכית נקייה במקום coverslip.
  4. תקן את התאים הנותרים עם paraformaldehyde 4% (PFA) ו חנות תאים קבועה ב 4 ° C בחושך לעיון בעתיד.
    1. פיפטה 100 μL 4% PFA ישירות צינורות איסוף.
    2. בקצרה מערבולת צינורות או פיפטה כמה פעמים כדי להבטיח היטב ערבוב ההשעיה התא.
  5. דמיינו את שקופיות מוכן במיקרוסקופ מצויד מנורת UV כדי לזהות Hoechst הקרינה תחת המטרה 63X. עיין בסעיף תוצאות - הערכה מורפולוגית של אוכלוסיות תאים נבטיות ממוינות - לפרטים נוספים על אופן זיהוי סוגי תאי נבט ספציפיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תא בודד השעיות מ ניתוק מכני של רקמות האשכים

איור 2 משווה השעיות תא בודד המתקבל על ידי דיסוציאציה מכנית של רקמת האשכים העכבר בתנאים שונים. דוגמאות שהתקבלו על ידי עיבוד רקמות טריות, ללא כתם ( איור 2 א ) או מוכתם Hoechst ( איור 2 ב ), להראות נוכחות של תאים בודדים בש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בהתחשב בדינמיקה הכרומטית המשופרת ביותר במהלך spermatogenesis אצל יונקים, המטרה של עבודה זו היתה לפתח פרוטוקול לבודד תאי נבט גברי בשלבים שונים של בידול מ רקמות שונות של יונקים ( איור 1 ). אחד המכשולים העיקריים ביישום של זרימת עבודה אחת למודלים שונים של בעלי חיים הוא הצורך בהתאמות ספציפיות למין, במיוחד בכל הנוגע לפרוטוקולי דיסוציאציה של רקמות. שיטות הנוכחי בעיקר להסתמך על עיכול רקמות אנזימטיות ופרוטוקולים לעתים קרובות להשתנות גם בתוך מינים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים אינם מכריזים על אינטרסים מתחרים.

תודות

המחברים מודים לבית החולים לבעלי חיים של הילסייד (סנט לואיס, מישיגן) לבדיקות כלבים; ג 'ייסון ארנד ואת המעבדה ד"ר טד Cicero באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס (WashU) על מתן מבחני חולדה בריאן Tabers לסיוע עם האוסף; ג'ארד הרצוק וד"ר סאלט מעבדה בוואשאו לבחינות חזיר השפן; וד"ר מייקל טלקוט בחוג לרפואה השוואתית ב- WashU עבור מבחן החזירים המיניאטורי. החוקרים גם מכירים במרכז הסרטן אלווין ג 'סיטמן בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון, ובית החולים בארנס-יהודי בסנט לואיס, מישיגן, לצורך שימוש ב- Cyman Flow Cytometry Core, שסיפק שירות מיון תא ממוחשב. מרכז הסרטן Siteman נתמך בחלקו על ידי NCI סרטן מרכז תמיכה גרנט # P30 CA91842.

מחקר זה מומן על ידי מלגה דוקטורט FCT [SFRH / BD / 51695/2011 ל ACL], מענקים של המכון הלאומי לבריאות [R01HD078641 ו R01MH101810 DFC] וחוזה מחקר FCT [IF / 01262/2014 ל- AML].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4% פרפורמלדהידVWR#157104% PFA, לקיבוע תאים ממוינים
MedimachineBD Biosciences#340588;מערכת לדיסוציאציה של אשכים
1X Dulbecco שונה Eagle mediumLife Technologies#31053DMEM, לדיסוציאציה של האשכים
MediconBD Biosciences#340591מחסנית דיסאגרגציה לדיסוציאציה של האשכים
סרום בקר עובריThermo Scientific#10082139FBS, לקולקציית FACS
Hoechst 33342Invitrogen#H3570Hoecsht, לצביעה של
FACS40 ומיקרו; מסננת תאים mGREINER BIO-ONE#89508-342לפירוק אשכים
100x 15 מ"מ צלחת פטריפלקון#351029לדיסקציה של אשכים
5 מ"ל פוליפרופילן צינורות תחתונים עגוליםפלקון#352063לקולקציית FACS
1.5 מ"ל צינורות אפנדורףVWR#20170-650לאוסף FACS
3 מ"ל מזרק מיותרBD Biosciences#309657לדיסוציאציה של האשכים
50 מ"ל צינור חרוטיMIDSCIלדיסוציאציה של האשכים 
Propidium IodideInvitrogen#L7011PI, עבור FACS צביעת
MoFlo סדרן תאים מדור קודםבקמן קולטר#ML99030עבור
תוכנת מיון תאים FACS Summitבקמן קולטר#ML99030עבור FACS
פוספט חוצץ מלחThermo Scientific#AM9625PBS, למיקרוסקופיה
שקופית זכוכית מיקרוסקופיתפישר סיינטיפיק#12-544-4למיקרוסקופיה
כיסוי זכוכיתפישר סיינטיפיק#12-548-87למיקרוסקופיה
פיפטת העברה חד פעמית (3 מ"ל)Samco Scientific#225לדיסוציאציה של האשכים
DNase IRoche#10104159001לפירוק אשכים
להב כירורגי מפלדת פחמןMiltex#4-111לדיסקציה של האשכים
מונה תאים אוטומטי של רוזנתInvitrogen#C10227לספירת תאים אוטומטית
תמיסה כחולה טריפן (0.4%)סיגמא#T8154לצביעה כדאיות
#C50R

מקורות

  1. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  2. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
  3. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
  4. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  5. Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
  6. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
  7. Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
  8. Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39(2014).
  9. Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
  10. Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
  11. Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
  12. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
  13. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  14. Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
  15. Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
  16. Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
  17. Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
  18. Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
  19. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  20. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
  21. Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
  22. Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
  23. Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
  24. Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
  25. Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Hoechst
גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.