מאמר שיטה

בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

DOI:

10.3791/55918

⸱

26 ביולי 2017

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, Geneva University Hospitals & Faculty of Medicine, 2Department of Basic Neurosciences, Geneva Medical Center, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Geneva Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מן רקמת שריר בוגר. תאים אלה משמשים ללמוד בידול שריר השלד במבחנה , בפרט, ללמוד חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי הלוויין (SC) הם תאי גזע שרירים הממוקמים בין קרום הפלזמה של סיבי השריר לבין הלמינה הבסיסית. הם חיוניים עבור התחדשות שריר. עם פגיעה, אשר מתרחשת לעתים קרובות בשרירי השלד, SCs מופעלים. הם מתרבים כמו myoblasts ולהבדיל לתקן נגעים שרירים. בין אירועים רבים המתרחשים במהלך בידול השריר, cytosolic Ca 2 + אותות הם בעלי חשיבות רבה. אלה Ca 2 + אותות נובעים Ca 2 + שחרור מ הפנימי Ca 2 + חנויות, כמו גם מ Ca 2 + כניסה מהחלל תאיים, במיוחד את החנות המופעלות Ca 2 + כניסה (SOCE). מאמר זה מתאר מתודולוגיה המשמשת כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מדגימות שריר שנאספו לאחר ניתוח אורתופדי. הרקמה היא מתעכל מכנית אנזימטית, ואת התאים הם מוגבר ולאחר מכן מיון על ידי cytometry הזרימה על פי נוכחות של speciסמני קרום. לאחר שהושג, myoblasts האדם מורחבים ומחויבים להבדיל על ידי הסרת גורמי גדילה מן המדיום התרבות. רמות הביטוי של גורמים שעתוק ספציפיים ב immunosluorescence חוץ גופית משמשים כדי להעריך את תהליך בידול myogenic בתנאי שליטה לאחר השתקת חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות. לבסוף, אנו מפרטים את השימוש Fura-2 כמו ratiometric Ca 2 + בדיקה המספק מדידות אמין לשחזור של SOCE.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שרירי השלד האנושיים מורכבים מקבוצות של סיבי שריר רב-תכליתיים, סינתטיים, הנובעים מאיחוי של תאים מבשר מיוגניים. שרירי השלד יש את היכולת להתחדש לאחר הפציעה תודה לנוכחות של SCS, תאי גזע שריר השלד הממוקם בין קרום הפלזמה של myofibers (sarcolemma) ואת הלמידה הבסיסית. בשרירים ללא פגע, SC הם בעיקר נוכחים במצב שקט. בתגובה ללחץ מכני או לפציעה, SC הופכים לפעילים (myoblasts), מתרבים, ועוברים תהליך הבחנה כדי ליצור מיופיבים חדשים או חידוש עצמי כדי לחדש את מאגר ה- SC 1 , 2 . במהלך השנים, מספר טכניקות פותחו כדי לבודד SCs הצאצאים שלהם, myoblasts, מן ביופסיות שריר השלד. עם הבנה גדולה יותר של פני השטח סמנים תאים הביע על תאים אלה ואת המתודולוגיה של מינון תא מופעלת הקרינה (FACS) 3, 4 , 5 , עכשיו ניתן לבודד אוכלוסיות טהור של myoblasts האדם מדגימות שרירים.

סידן איתות מסדיר את התפתחות שריר השלד, הומיאוסטזיס, התחדשות. בפרט, הכניסה Ca 2 + המופעל בעקבות דלדול החנות תאיים, הנקראים SOCE, הוא בעל חשיבות רבה 6 עבור תהליכים אלה. לאחר גירוי התא, רמת Ca 2 + ב reticulum endo / sarcoplasmic (ER / SR) פוחתת, אשר בתורו מפעילה ממברנה פלזמה Ca 2 + ערוצים המאפשרים Ca 2 + כניסה למלא את ER / SR 7 . שני חלבונים עיקריים המעורבים SOCE הם ER / SR Ca 2 + -חישה מולקולת אינטראקציה סטרומה 1 (STIM1) חלבון הממברנה פלזמה Ca 2 + ערוץ Orai1. שריר השלד מבטא בשפע את שני החלבונים הללו, כמו גם חלבונים אחרים של אותן משפחות (STIM2Ora Orai2-Orai3) 8 , 9 ו כמה קה 2 + ערוצי לערוץ של קולטן חולף פוטנציאלי (TRPC) משפחה 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2 + כניסה דרך מסלול SOCE הוא בעל חשיבות רבה עבור היווצרות שריר / התחדשות 14 . מוטציות של חלבונים STIM1 או Orai1 יש השפעות מזיקות על תפקוד השרירים, המוביל בעיקר לשריר היפוטוניה 15 . מודלים בעלי חיים עם ליקוי SOCE גם להציג מסת שרירים מופחת כוח, יחד עם עייפות משופרת 6 , 16 , 17 . כאמור, חלבונים אחרים של STIM ו- Orai, כמו גם ערוצי TRPC רבים, מתבטאים בשרירי השלד, ותפקידים אלה לא נקבעו עד כה. על ידי דפיקות דמשלו רמת הביטוי שלהם, ולכן ניתן לחקור את ההשלכות שלהם ב- SOCE ואת תפקידיהם במהלך בידול שריר השלד האנושי.

המדידה SOCE ניתן לבצע באמצעות שתי גישות שונות: הקלטות הנוכחי אלקטרו ו Ca 2 + מדידות. Electrophysiology הוא בהחלט שיטה ישירה יותר, כפי שהיא מודדת את הנוכחי של עניין וחתימה אלקטרופיזיולוגי הקשורים אליו. עם זאת, טכניקה זו קשה מאוד להחיל על תאי השריר, בעיקר בגלל גודל גדול של תאי שריר וגודל קטן של הנוכחי SOCE אנדוגני. Cytosolic Ca 2 + הדמיה היא טכנית מאוד נגיש, אבל המדד הוא יותר עקיף, כמו Ca 2 + רמת נמדדת cytosol משקף הן את כניסת Ca 2 + ואת שאיבה מחדש מתוך התא או בחנויות הפנימיות.

מתודולוגיה הכוללת בידוד myoblasts מ חתיכות קטנות של skel האדםשריר etal לאחר עיכול אנזימטי, הגברה, FACS מוסבר במאמר זה. תהליך של בידול שרירים ואת פרוטוקול immunofluorescence לעקוב אחר הביטוי של סמנים בידול לאורך זמן מתוארים 18 . לבסוף, המדידה של SOCE ואת התפקיד של ערוצי יון שונים Ca 2 + איתות והבחנה שריר השלד מוסברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות שרירים אנושיים (רקמות שהתקבלו משרירים למחצה) נאספו במהלך ניתוח אורתופדי על חולים בריאים כפסולת כירורגית. כל השיטות הנוגעות למחקר האנושי בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות של רשויות הבריאות הרגולטוריות השווייצריות ואושרו על ידי הוועדה קנטונאל ד'אתייק דה לה ריצ'רצ'ה מרשות קנטונאל, שוויץ (פרוטוקול CER 12-259) . הסכמות מושכלות וכתובות התקבלו מכל הנושאים הבוגרים המעורבים במחקר.

1. בידוד של Myoblasts של שריר השלד האנושי

  1. במהלך כל ההליכים, לשמור על תנאים סטריליים על ידי עבודה תחת ברדס רמה II תרבות רקמה באמצעות מאגרים בינוניים סטרילי סטרילי.
    הערה: הליך זה יכול להיות מיושם על שרירי השלד האנושי רבים.

2. פרוטוקול דיסוציאציה

  1. העברת דגימות שריר (2 - 3 גרם) לתוך סטרילי 6 ס"מצַלַחַת.
  2. שטפו את דגימות השריר עם 5-10 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). חזור על הכביסה.
  3. הסר רקמות החיבור ואת השומן באמצעות מספריים מעוקל מהדק.
  4. לשקול את דגימת שריר (ראה שלב 2.13) ולהעביר אותו צלחת סטרילית 6 ס"מ חדש.
  5. הוסף 5 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA.
  6. שימוש במספריים, לחתוך ולמזער את רקמת השריר לחתיכות קטנות (פחות מ 2 מ"מ).
  7. באמצעות פיפטה 10 מ"ל סרולוגי, להעביר את השריר טחון בקבוק 200 מ"ל ניתוק המכיל בר מגנטי. חזור על שלב זה עד 90 מ"ל של 0.05% Trypsin-EDTA הועבר עם כל שריר טחון לתיבת ניתוק. סגור את בקבוק ניתוק דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות תחת תסיסה קלה.
  8. הסר את בקבוק ניתוק מן אמבטיה לחימום ולהפסיק את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 10 מ"ל של סרום עגל עגל (FCS, נפח 10% הסופי) על בקבוק ניתוק. Homogenize את התערובת עם פיפטה.
  9. Prepהם שני צינורות 50 מ"ל עם מסננת 70 מיקרומטר התא על כל אחד. לעבור חצי ההשעיה התא דרך מסננת התא על כל צינור על ידי pipetting מעלה ומטה על המסנן עד ההשעיה עובר.
  10. צנטריפוגה צינורות ב XG 200 ו 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; לשאוב ולהשליך את supernatant.
  11. Resuspend התאים עם 10 מ"ל של המדיום הצמיחה (GM, טבלה 1 ) ולהעביר את התאים באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר ממוקם על צינור 50 מ"ל אחד. צנטריפוגה הצינור ב XG 200 ו 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; לשאוב ולהשליך את supernatant.
  12. Resuspend התאים עם 10 מ"ל של GM ו צנטריפוגה הצינור ב XG 200 ו 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; לשאוב ולהשליך את supernatant.
  13. Resuspend התאים עם 1 מ"ל של GM לספור את התאים באמצעות תא Neubauer.
    הערה: בדרך כלל, תשואה של 3 x 10 5 תאים לכל גרם של שריר צריך לקצור. התשואה מחושבת על ידי חלוקת מספר התאים לפי משקל ביופ השריר(שלב 2.4).
  14. שים 2 x 10 5 תאים בצלחת סטרילית 6 ס"מ המכיל 4 מ"ל של GM ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס ו 7% CO 2 . הכינו כמו לוחות רבים לפי הצורך.
  15. שנה את GM לאחר 3 ימים.
    הערה: תאים ניתק טרי צריך זמן כדי לדבוק בצלחת תרבות. יתר על כן, הפעם הראשונה myogenic התא הכפלת הוא סביב 50 - 60 שעות. לאחר החלוקה הראשונה, זמן הכפלה הוא סביב 20 שעות.
  16. לאחר 5-7 ימים, כאשר התאים מגיעים מפגש 70-80% (סביב 1.5 x 10 6 תאים / לכל צלחת 6 ס"מ), להתחיל מכתים נוגדנים מיון תאים (שלב 3).

3. נוגדנים מכתים ומיון תאים

  1. לאחר שטיפה אחת עם PBS, דגירה התאים חסיד (בצלחת 6 ס"מ) עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA ב 37 ° C ו 7% CO 2 במשך 3 דקות (או לדגור על 5% CO 2 ). עצור את התגובה על ידי הוספת 2 מ"ל של GM ולאסוף את התאים צינור 15 מ"ל. לאחר צנטריפוגה (200 xg במשך 5 דקות), מילUspend התאים 1 מ"ל של GM.
  2. ספירת התאים באמצעות תא Neubauer.
  3. בצע את ההליכים הבאים על הקרח.
    הערה: הליך הגדרת פיצוי הקרינה הנכון על cytometer הוא חיוני צריך להיות דומה על כל cytometer. צינורות 1 ו -2 משמשים שולטת שלילית. צינורות 3 - 7 משמשים כדי להגדיר את הפיצוי על cytometer במהלך הניסוי הראשון ( טבלה 2 ). הריכוז הסופי המשמש עבור כל נוגדנים ועל איסוטיפ המקביל שלה צריך להיות זהה (בסביבות 1 מיקרוגרם / 10 6 תאים).
  4. שדר 1 x 10 5 תאים לכל צינור (צינור 5 מ"ל) עבור צינורות 1 - 7 ( טבלה 2 ). מניחים את ההשעיה התא הנותר בצינור 8 למיון תאים.
  5. שטפו את התאים עם 1 מ"ל של חיץ FACS קר (PBS -5% FCS). סגור צנטריפוגה צינורות ב XG 200 ו 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; לשאוב ולהשליך את supernatant.
  6. הוסף 200 μL של חיץ FACS לכל צינור. הוסף נוגדנים לE tube לפי טבלה 2 . דגירה על קרח במשך 30 דקות.
  7. שטפו את התאים: מוסיפים 1 מ"ל למאגר FACS לכל צינור. סגור צנטריפוגה צינורות ב XG 200 ו 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. לשאוב ולזרוק supernatant. חזור על שלב זה עוד פעם אחת.
  8. Resuspend התאים μL 500 של חיץ FACS. סגור את צינורות ולשמור אותם על הקרח עד התא מיון. הכן 4 צינורות של 1.5 מ"ל, כל המכיל 500 μL של GM, אשר יש צורך לאסוף את התאים במהלך מיון התא. שמור אותם על הקרח.
  9. מיין myoblasts האדם על ידי cytometry זרימה ( איור 1 ). לאחר הכללת תאים hematopoietic CD45 חיובי, נפרד CD45 שלילי תאים המבוססים על ביטוי CD56. לאחר מכן, שער את האוכלוסייה CD56 חיובי CD34, CD144, ו CD146 (myoblasts האדם מוגדרים CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- תאים). Reanalyze חלק קטן של האוכלוסייה תאים ממוינים כדי לבדוק את הטוהר.
  10. הבריכה את הצינורות המכילים מיובלה אנושיתSts בצינור 15 מ"ל אחד לשטוף פעם אחת על ידי הוספת 5 מ"ל של GM. צנטריפוגה הצינור ב XG 200 ו 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; לשאוב ולהשליך את supernatant.
  11. Resuspend התאים 1 מ"ל של GM וצלחת התאים על צלחת 6 ס"מ לא מצופה המכיל 4 מ"ל של GM (2 x 10 5 תאים לכל צלחת). לדגור על 37 מעלות צלזיוס ו -7% CO 2 .

4. תחזוקת תאים

  1. שינוי חצי המדיום תרבות כל 2 ימים. הסר 2 מ"ל של GM הישן מהצלחת תרבות להוסיף 2 מ"ל של GM.
    הערה: Myoblasts לייצר גורמי גדילה כי הם מועילים לתנאי התרבות.
  2. Trypsinize התאים כאשר הם מגיעים 70 - מפגש 80%, כדי למנוע pre-differentiation. לאחר שטיפה אחת עם PBS, דגירה התאים חסיד (בצלחת 6 ס"מ) עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA ב 37 ° C ו 7% CO 2 במשך 3 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 2 מ"ל של GM ולאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל. לאחר צנטריפוגה (200 XG במשך 5 דקות), resusלטחון את התאים 1 מ"ל של GM.
  3. ספירת התאים ולהכין 6 לוחות צלחות עם 2 x 10 5 תאים לכל צלחת 4 מ"ל של GM.
  4. שמור myoblasts האדם עד 6 מעברים או להקפיא אותם GM המכיל 10% DMSO, 1 x 10 6 תאים לכל מ"ל. להקפיא את התאים קופסת הקפאה מתקדמת (1 ° C / דקות); עבור אחסון לטווח ארוך, במקום תאים בחנקן נוזלי.

5. transfection של Myoblasts האדם עם siRNA

הערה: Myoblasts הם transfected באמצעות מגיב transfection מסחרי יומיים לפני אינדוקציה של בידול. ההשפעה של siRNA ספציפי כנגד הגן הוא תמיד לעומת ההשפעה של siRNA שליטה. SiRNAs הם RNAs תקועים פעמיים כי חייב להישמר על קרח מניפולציה עם כפפות.

  1. השגת 70 - 80% monolayer confluent של myoblasts האדם בצלחת 6 ס"מ (סביב 1.5 x 10 6 תאים).
    הערה: 5 x 10 5 תאים לכל transfection יש צורך להשיג conMonolayer שוטפת של myoblasts transfected לאחר 2 ימים ב- GM.
  2. הכן coverslips זכוכית (המתואר עבור הדמיה סידן בשלב 7).
  3. ג 'נרל מוטורס חם, 0.05% טריפסין- EDTA, ו PBS ל 37 מעלות צלזיוס.
  4. בצע את כל השלבים הבאים ברדס רמה II תרבות רקמה כדי לשמור על סטריליות.
  5. בצינור 1.5 מ"ל, לשלוח 500 μL של המדיום בסרום מופחת, 3 μL של מגיב transfection, ו 1 μL של siRNA ב 20 מיקרומטר. מערבבים בעדינות לשמור בטמפרטורת החדר (RT) במשך 15 - 20 דקות.
  6. במהלך זמן הדגירה, להכין את myoblasts transfection. לאחר שטיפה אחת עם PBS, דגירה התאים חסיד (בצלחת 6 ס"מ) עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA ב 37 ° C ו 7% CO 2 במשך 3 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 2 מ"ל של GM ולאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל. לאחר צנטריפוגה (200 xg במשך 5 דקות), resuspend התאים 1 מ"ל של GM.
  7. ספירת התאים באמצעות תא Neubauer.
  8. Resuspend 5 x 10 5 תאיםב 200 μL של GM עבור transfection כל ( כלומר, עבור transfections 2, resuspend ב 400 μL).
  9. הוסף 200 μL ההשעיה התא לכל 500 μL של תערובת siRNA- transfectant. פיפטה למעלה ולמטה פעמיים דגירה 5 דקות ב RT.
  10. הוסף את 700 μL (תאים + siRNA- transfectant) כדי צלחת 3.5 ס"מ תרבות המכילה coverslip זכוכית. הוסף GM כדי לקבל נפח סופי של 2 מ"ל.
  11. לאחר 24 שעות ב 37 ° C ו 7% CO 2 , לחלוטין להחליף את המדיום עם 2 מ"ל של GM טרי. לאחר עוד 24 שעות, monolayer confluent של תאים transfected נמצא בדרך כלל; אם כן, לגרום בידול myoblast ידי החלפת GM עם 2 מ"ל של המדידה בינוני (DM, טבלה 1 ).
  12. בצע ניסויים סידן הדמיה 24 - 48 שעות לאחר אינדוקציה של בידול או על myiferlasts מתרבים.
    הערה: Immunofluorescence מתבצע בדרך כלל 48 שעות לאחר אינדוקציה של בידול.

6. Immצפיפות של סמנים בידול

הערה: מכתים Immunofluorescence מבוצע לאחר 48 שעות DM, אבל זה יכול גם להתבצע בזמנים אחרים. Myogenin ו- MEF2 הם חלבונים גרעיניים המתבטאים רק בתאים מובחנים (לפני היתוך לתוך המוטוביות), והכתים שלהם מאפשרים הערכה של תהליך ההבחנה. השרשרת הכבדה של מיוסין (MyHC) מתבטאת רק במיוטובוסים ומשמשת לאמידה של גודל המוטוביה ואינדקס ההיתוך (מספר גרעינים במיאוטובוסים / מספר כולל של גרעינים).

  1. לאחר 48 שעות DM, לשטוף את monolayer ומחוברות של תאים מובחנים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS ב RT. לעשות זאת בזהירות כדי למנוע ניתוק של המיאוב.
  2. תקן את התאים עם 1 מ"ל של paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 15 דקות ב RT. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים, במשך 5 דקות כל אחד.
  3. Permeabilize התאים עם 1 מ"ל של PBS המכיל 0.25% טריטון X-100 במשך 45 דקות ולשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS.
  4. חסום אתPecific אתרי מחייב על ידי דוגרים את התאים PBS בתוספת 0.2% Tween-10 ו 2% בסרום עז (פתרון בלוק) במשך 30 דקות ב RT.
  5. הכן נוגדנים ראשוניים בדילול פתרון בלוק (600 μL לכל צלחת 3.5 ס"מ).
    הערה: נוגדנים ראשוניים הבאים משמשים: עכבר anti-myogenin (1: 600), ארנב anti-MEF2 (1: 300), נוגדנים נגד העכבר MyHC (MF20, 1: 1,000). ניתן לערבב את אותו פתרון חסימה, עכבר anti-myosin שרשרת כבדה או העכבר נגד myogenin, עם ארנב anti-MEF2.
  6. הסר את הפתרון לחסום ולהוסיף 600 μL של פתרונות נוגדן ראשוני לכל צלחת 3.5 ס"מ ו דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר humidified.
  7. לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS. דגירה במשך שעה 1 ב RT בחדר חשוך עם 600 μL של נוגדנים משני הכין פתרון בלוק, כדלקמן: עז נגד עכבר Alexa 488 (1: 1,000), נגד ארנבת Alexa 546 (1: 1,000), ו DAPI (1:50, פתרון המניה ב 15 מיקרומטר).
    כאוטיוN: DAPI הוא תרכובת רעילה כי צריך להיות להתמודד עם כפפות.
  8. לשאוב ולשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS.
  9. הר coverslips זכוכית באמצעות פוליויניל אלכוהול גובר בינוני עם פתרון antifading. שמור אותם על 4 מעלות צלזיוס מוגן מפני האור עד הדמיה התאים.

7. סידן הדמיה

  1. קודם התרבות, להכין coverslips זכוכית 25 מ"מ קוטר. שים את coverslips באתנול 70% במשך 48 שעות כדי להסיר כל שומן ועפר מפני השטח, מה שמקטין את התא דבקות coverslip.
  2. לאחר שטיפה פעמים coverslipsseveral עם מים, להחזיר אותם במים לעקר אותם (autoclaved).
  3. שים אחד coverslip לכל צלחת 3.5 ס"מ תרבות ולתת להם להתייבש. חנות כלים פטרי לניסויים נוספים או להשתמש בהם באופן מיידי.
  4. הוסף את myoblasts transfected (5 - 6 x 10 5 תאים) כדי coverslip זכוכית.
    הערה: הניסויים נעשים 24 - 48 שעות לאחר אינדוקציה של differentiatiעל, או על התפשטות myoblasts.
  5. כדי לבצע Ca 2 + הדמיה, לשטוף את התאים 2 פעמים עם PBS או ישירות עם המדיום המשמש לניסויים (בינוני המכיל סידן, טבלה 3 ). טען את התאים עם 2 מיקרומטר Fura-2 / AM פלוס 1 מיקרומטר חומצה פלורונית במשך כ 30 דקות בחושך ב RT.
    הערה: חומצה פלורוני עוזר solubilize Fura-2. Fura-2 / AM וחומצה פלורונית מומסים במדיום המכיל סידן.
  6. לשטוף את התאים פעמיים באותו בינוני אבל ללא Fura-2 / AM ו חומצה פלורונית ולהשאיר אותם בחושך במשך 10-15 דקות נוספות כדי לאפשר דה אסטריפיקציה של Fura-2 / AM.
  7. אם יעילות הטעינה של Fura-2 נמוכה מדי, להוסיף יותר Fura-2 ( למשל, 4 מיקרומטר) ו / או דגירה התאים במשך זמן רב יותר ( למשל, 40 דקות).
  8. הסר את coverslip מהצלחת תרבות ולהתקין אותו בחדר ניסיוני. הוסף ~ 1 מ"ל של המדיום המכיל סידן (בהתאם לנפח החוויהחדר נפשי). התקן אותו על הבמה מיקרוסקופ ולהתחיל את ההקלטה.
    הערה: פלואורסצנטי Ca 2 + רגיש בדיקה Fura-2 הוא מתרגש לסירוגין ב 340 ננומטר 380 ננומטר, ואת האור פליטה נאסף ב 510 ננומטר. כמו התנודות של ריכוז Ca 2 + הם איטיים יחסית, לרכוש 1 יחס כל 2 שניות.
  9. כדי להפעיל SOCE, הבא thapsigargin קלאסי / Ca 2 + מחדש תוספת פרוטוקול משמש: להשאיר את התאים במשך 2-3 דקות בינוני המכיל סידן. החלף את המדיום בינוני בינוני ללא סידן 1-2 דקות.
    1. הוסף thapsigargin 1 מיקרומטר כדי לרוקן את החנויות סידן פנימי.
      הערה: Thapsigargin הוא חוסם בלתי הפיך של סרקו endoplasmic reticulum Ca 2 + ATPase (SERCA) פעילות המשאבה.לאחר 8 - 10 דקות, במהירות להחליף את המדיום עם המדיום המכיל סידן. Ca 2 + יכנסו לתאים דרך ערוצי SOCE. המתן 5 דקות לפני סיום הניסויים.
      זהירות: Thapsigargin הוא תרכובת רעילה כי יש לטפל עם כפפות.

8. Ca 2 + ניתוח מדידה

הערה: בצע את הניתוח עם תוכנת הרכישה.

  1. פתח את הניסוי. צייר אזור 1 באזור שבו אין תאים (אזור רקע), וצייר את האזורים האחרים בציטופלזמה של התאים כדי לנתח (האזורים ניתן לצייר על כל תמונה: 340 ננומטר, 380 ננומטר, או את התמונה יחס). עבור אל "הפעל ניסויים"> "תמונות התייחסות". תחת 340 ו 380 ערוצים, בחר "אזור 1" ולאחר מכן לחץ על "רקע רקע".
  2. הפעל את הניסוי כולו (F4: קדימה) כדי להבטיח ששום דבר לא יפריע לאזור הרקע, כגון נקודת אבק פלואורסצנטי שנוסעת באזור הרקע, ושהתאים אינם נעים בזמן הניסויים.
    הערה: אזורי העניין שנבחרולא צריך לכלול אזורים כהים; אחרת, ערך היחס ייראה רועש, כחלק מהרקע יכללו במדידה.
  3. לחץ על "התחבר נתונים" ולשחק את הניסוי כולו שוב.
    הערה: פעולה זו תפתח גיליון אלקטרוני שבו הזמן והיחס יירשמו. ניתן גם לשמור את 340 ננומטר בודדים 380 ננומטר אורכי גל.
  4. כדי לקבל מידע על SOCE, לחלץ את שני פרמטרים חשובים מן הניסוי: משרעת של Ca 2 + מחדש תוספת המדרון של שלב הכניסה 2 + Ca ( איור 3 ).
  5. השג את משרעת על ידי הפחתת ערך היחס לפני Ca 2 + תוספת מחדש מהמשרעת המקסימלית של העליה Ca 2 + . השג את המדרון המקסימלי על ידי התאמת רגרסיה ליניארית של השניות הראשונות לאחר Ca 2 + מחדש תוספת.
    הערה: האזור מתחת לעיקול התגובה thapsigargin הוא גם פרמטר אינפורמטיבי ExtracT, כפי שהוא משקף את כמות הסידן חינם מאוחסן SR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר הדיסוציאציה האנזימטית של דגימת שריר אנושית, התאים גדלו ב- GM. מיובלסטים אנושיים, שהוגדרו כתאי CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, התקבלו לאחר FACS. Myoblasts ייצג יותר מ 60% של האוכלוסייה נותחו ( איור 1 ). ראשי myoblasts האדם הוחזרו, גדל המפגש, ותרבותי DM במשך 48 שעות. לאחר immunostaining עבור הביטוי של גורם שעתוק MEF2 ואת שריר ספציפי חלבון שרשרת כבדה (MyHC), ראינו כי רוב התאים יצרו myotubes במבחנה (תאים MyHC חיובי), עם ערכי אינדק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבידוד והתרבות של myoblasts האדם מן שריר השלד המבוגר מציע מודל במבחנה ללמוד בידול שרירים התחדשות שרירים. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול המאפשר טיהור של תשואות גבוהות של myoblasts האדם בצורה פשוטה וחסכונית. בנוסף, טכניקה זו מספקת תוצאות אמין לשחזור במונחים של אחוז myoblasts מבודדים יעילות ההבחנה myogenic שלהם. ואכן, השגנו סביב 60% של myoblasts האדם לאחר מיון התא. תאים אלה יכולים להישמר בתרבות עד 6 מעברים (סביב 30 כפילויות) ולשמור על היכולות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית (מענק מס '310030-166313), "The Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", "Foundation Marcel Levaillant" ו- "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire".

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בשר חזיר s F10ThermoFisher Scientific31550-023
FCSThermoFisher Scientific10270-106Lot 41G5532K
BSASigmaO5482
fetuinSigmaF3385
EGFCorning354001
DexamethansoneSigmaD1756
InsulinSigmaI9278
קריאטיןסיגמא27900
פירובטסיגמאP4562
אורידיןסיגמאU3003
GentamycinThermoFisher Scientific15710-049
טריפסין-EDTA 0.05%ThermoFisher Scientific25300-062
70 μ מסננת תאים mFalcon352350
40 μ מסננת תאים mFalcon352340
Falcon 50  צינור מ"לפלקון352070
פלקון 15  צינור מ"לפלקון352096
פלקון 5  צינור מ"ל (FACS)פלקון352058
מדיום תרבית: OPTI-MEMThermoFisher Scientific31985-047
Transfectant reagnt: RNAiMaxThermoFisher Scientific1756064
PBSThermoFisher Scientific14190-094
הרכבה בינוניתFluka10981
עכבר אנטי-MyHC *DSHBMF20 להתרכז
עכבר אנטי מיוגניןBD Pharmigen556358
ארנב אנטי MEF2סנטה קרוז ביוטקC-21
עז נגד עכבר Alexa488ThermoFisher ScientificA11029
עז נגד ארנב Alexa 546ThermoFisher ScientificA11035
עכבר אנטי אנושי CD56-Alexa488BD Pharmingen557699
עכבר אנטי אנושי CD146-PECy7BD Pharmingen562135
עכבר אנטי אנושי CD45-PE-CF594BD Pharmingen562279
עכבר אנטי אנושי CD34-APCBD Pharmingen345804
עכבר אנטי אנושי CD144-PEBD Pharmingen560410
Alexa Fluor 488 עכבר IgG1kBD Pharmingen557702
PECy7 עכבר IgG1kBD Pharmingen557872
PE-CF594 עכבר IgG1kBD Pharmingen562292
APC עכבר IgG1kBD Pharmingen550854
PE עכבר IgG1kBD Pharmingen556650
DAPISigmaD9542זהירות:  תרכובת רעילה
ParaformaldehydeFluka762400
Fura-2 AMThermoFisher ScientificF1201
Pluronic F-127ThermoFisher ScientificP3000MP
ThapsigarginSigmaT9033זהירות : תרכובת רעילה 
תוכנת רכישת הדמיה יחסית: Metafluor 6.3Molecular Device
* : MF 20 הופקד ב-DSHB על ידי פישמן, D.A. 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
  2. Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
  3. Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195(2014).
  4. Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
  5. Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
  6. Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
  7. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  8. Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
  9. Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
  10. Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
  11. Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
  12. Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
  13. Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
  14. Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
  15. Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
  16. Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
  17. Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805(2013).
  18. Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
  19. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  20. Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
  21. Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855(2016).
  22. Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
  23. Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
  24. Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Fura 2

מאמרים קשורים