הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

לוקליזציה של גנים קולטן Odorant ב אנטנות ארבה על ידי RNA

7.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55924

⸱

13 ביולי 2017

 ,  , 
1Department of Entomology, China Agricultural University, 2Bio-tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול RNA מפורט ויעיל בפרוטוקול הכלאה באתרו, במיוחד עבור גנים של קולטנים (OR), המופיעים ברמה נמוכה, וכן בגנים אחרים, באנטנות חרקים באמצעות בדיקות דיגוקיגנין (DIG) או תוויות ביוטין.

תקציר

חרקים פיתחו מערכות מתוחכמות של קליטת חוש הריח לחוש אותות כימיים אקסוגניים. אלה האותות הכימיים הם transduced על ידי נוירונים קולטן חוש הריח (ORNs) שוכנים במבנים דמויי שיער, המכונה chemosensilla, של האנטנות. על קרום של ORN, Odorant קולטנים (ORs) הם האמינו להיות מעורב ריחוף ריח. לפיכך, היכולת לזהות גנים הממוקמים ל- ORN נחוצה כדי לזהות גנים, ומספקת בסיס יסודי לתפקוד תפקודי נוסף באתרו . רמות ביטוי RNA של ספציפיים או S אנטנות חרקים הם נמוכים מאוד, ושימור רקמות חרקים עבור היסטולוגיה מאתגרת. לכן, קשה למקם OR לסוג מסוים של sensilla באמצעות RNA ב הכלאה באתרו . במאמר זה, רנ"א מפורט ויעיל בפרוטוקול הכלאה באתרו במיוחד עבור גנים לידי ביטוי נמוך של חרקים, הוא הציג. בנוסף, או ספציפי גןS זוהה על ידי ביצוע ניאון פעמיים צבע ניסויי הכלאה באתרו באמצעות שיתוף קולטן ביטוי קולטן, אורקו , כסמן.

מבוא

אנטנות חרקים, שהן האיברים הכימוזנריים החשובים ביותר, מכוסים במבנים רבים דמויי שיער - הנקראים סנסיליה - המושרשים על ידי נוירונים של קולטן חוש הריח (ORN). על הממברנה של חרקים ORN, רצפטורים אודורנט (ORs), סוג של חלבון המכיל שבעה תחומים transmembrane, באים לידי ביטוי עם corceptor (ORCO) כדי ליצור heteromer המתפקד כמו ערוץ יון מלוטש יון 1 , 2 , 3 . ORs שונים מגיבים לשילובים שונים של חומרים כימיים 4 , 5 , 6 .

ארבה ( Locusta migratoria ) בעיקר להסתמך על רמזים חוש הריח כדי להפעיל התנהגויות חשובות 7 . ORS ארבה הם גורמים מרכזיים להבנת מנגנוני הריח המולקולריים. לוקליזציה של ארבה או גן ספציפי לנוירון שלמורפולוגית ספציפית סוג sensillum על ידי RNA ב הכלאה Situ (RNA ISH) הוא הצעד הראשון בחקר הפונקציה ORs.

רנ"א משתמשת בדיקה מסומנת RNA משלים למדוד ולמקם רצף מסוים RNA בסעיף של רקמות, תאים או mounts כולו באתרם , מתן תובנות תהליכים פיזיולוגיים מחלה פתוגנזה. Digoxigenin שכותרתו (DIG שכותרתו) ו ביוטין שכותרתו בדיקות RNA כבר בשימוש נרחב הכלאה RNA. RNA תיוג עם digoxigenin-11-UTP או biotin-16-UTP יכול להיות מוכן על ידי שעתוק במבחנה עם SP6 ו T7 RNA פולימריות. DIG ו- biotin שכותרתו בדיקות RNA יש את היתרונות הבאים: לא רדיואקטיבי; בטוח; יַצִיב; רגיש מאוד; ספציפיים מאוד; וקל לייצר באמצעות PCR ו שעתוק במבחנה . DIG ו- biotin שכותרתו בדיקות RNA יכול להיות chromogenically ו זוהה fluorescently. DIG שכותרתו בדיקות RNA יכול להיות מזוהה עם אלקלי דיגוקסגנין אנטיNe-phosphatase (AP) נוגדנים conjugated כי ניתן לדמיין גם עם המצעים chemiluminescent רגיש nitroblue tetrazolium כלוריד / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine מלח (NBT / BCIP) באמצעות מיקרוסקופ אופטי או עם 2 הידרוקסיה -3-naphtoic חומצה -2 '-phenylanilide פוספט (HNPP) יחד עם 4-chloro-2-methylbenzenediazonium חמי אבץ כלוריד מלח (אדום מהיר) באמצעות מיקרוסקופ confocal. Biotin שכותרתו בדיקות RNA יכול להיות מזוהה עם אנטי ביוטין streptavidin צנון סוס צחצוח Peroxidase (HRP) - conjugated נוגדנים שיכולים להיות דמיינו עם tyramides פלואורסצין באמצעות מיקרוסקופ confocal. לכן, פעמיים צבע פלואורסצנט הכלאה באתרו יכול להתבצע כדי לזהות שני גנים היעד בפרוסה אחת באמצעות בדיקות DIG ו ביוטין שכותרתו RNA.

RNA ISH עם DIG- ו / או בדיקות שכותרתו ביוטין שימש בהצלחה למקם גנים ההרחה הקשורות, כגון OR, ionotropic קולטן, חלבון odorant מחייבואת החלבון נוירון חישה, ב אנטנות חרקים של, אך לא רק, תסיסנית melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria ואת ארבה המדבר Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . עם זאת, ישנם שני אתגרים משמעותיים בעת ביצוע RNA ISH עבור חרקים ORS: (1) או גנים (למעט ORCO ) באים לידי ביטוי ברמות נמוכות ורק במספר תאים, מה שהופך זיהוי האות קשה מאוד, (2) שימור רקמת חרקים עבור היסטולוגיה, כך שהמורפולוגיה נשמרת ורעש הרקע נמוך, יכול להיות מאתגר. במאמר זה פרוטוקול מפורט ויעיל המתאר RNA ISH עבור לוקליזציה או גנים חרקיםאנטנות מוצג, כולל הן Chromogenic ו Tyramide איתות הגברה (TSA) גילוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כדי להגביל השפלה RNA, להכין פתרונות באמצעות מים מזוקקים רטוב autoclaved (ב 121 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות) וגם חומרים אוטוקלאב רטוב.

1. הכנת RNA ISH Antisense והרגשות בדיקה

  1. המטרה הגברה הגן וטיהור
    1. ראשית, לייצר קטע BP 387 כפול stranded של L. Migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) מן הפלסמיד המכיל את cDNA באורך מלא של LmigOR1 עם פולימרז DNA Taq שמוסיף adenines לשני הקצוות של שברי.
      1. השתמש 100 μL נפח התגובה הסופי, המכיל 50 μL של תערובת תגובה 2x, 4 μL כל תחושות חושים antisense ( טבלה 1 ), 1 μL של תבנית פלסמיד, ו 41 μL של RNase חינם H 2 O. השתמש PCR הבאים פרוטוקול: 94 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, ואחריו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 s, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך דקה 1, ואחריו 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      2. חזור על שלבים אלה כדי לייצר את 1,303 bp פעמיים נתקע קטע של LmigOR2 (GenBank: JQ766966) ו 1,251 bp פעמיים נתקע קטע של Lmigorco (GenBank: JN989549). פריימרים המשמשים בניסויים אלה מוצגים בלוח 1 .
      3. הפעל מוצרים PCR על 1.2% agarose ג'ל 1x חיץ טריס אצטט-EDTA לדמיין באמצעות מכתים ethidium bromide.
    2. חלץ מוצרים אלה PCR באמצעות ערכת מיצוי ג 'ל.
      1. בעקבות אלקטרופורזה, להקות ה- DNA הבלו מן הג'ל ומניחים את פרוסות ג'ל בצינור 1.5 מ"ל. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של חיץ מחייב (Buffer PN) לכל 0.1 גרם של פרוסת ג'ל. וורטקס ו דגירה על 50 מעלות צלזיוס עד פרוסת ג'ל הוא מומס לחלוטין.
      2. הכנס עמודה ספיחה CA2 לתוך צינור איסוף ולהוסיף 500 μL למאגר איזון (מאגר B). זה משפר את יכולת קליטה ויציבות של קרום סיליקה. CentriFuge ב 12,400 xg עבור 1 דקות.
      3. מעבירים את תערובת ג'ל מומס על הרכבה טור הספינה ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. ואז, צנטריפוגה צינורות ב XG 12,400 דקות. מחק את הזרימה דרך מחדש את עמודה ספיחה לתוך צינור אוסף.
      4. הוסף 600 μL של פתרון לשטוף (הוסיף אתנול, PW הצפת) פעמיים. צנטריפוגה ב XG 12,400 במשך 1 דקות. מחק זרימת דרך מחדש את עמודה ספיחה לתוך צינור אוסף.
      5. רוקן את צינור איסוף ו modernrifuge הרכבה עמודה ב XG 12,400 למשך 2 דקות כדי לאפשר אידוי של אתנול שיורית כלשהי.
      6. בזהירות העברת עמודה ספיחה לצינור 1.5 מ"ל צנטריפוגה נקי. אוויר יבש את הכדור במשך 5-10 דקות ו redissolve את הדנ"א בנפח מתאים ( למשל, 30 μL) של מים ללא nuclease.
      7. דגירה ב RT במשך 2 דקות. צנטריפוגה ב XG 12,400 במשך 2 דקות. מחק עמודה ספיחה ולאחסן את ה- DNA ב 4 מעלות צלזיוס או -20 מעלות צלזיוס.
  2. לבנות את הפלסמידים רקומביננטי
    1. בנפרד ligate את קטע 387 bp של LmigOR1 , 1,303 קטע bp של LmigOR2 ו 1,251 קטע bp של Lmigorco לתוך וקטור T המכיל האמרגן עבור T7 (במעלה) ו SP6 (במורד הזרם) פולימרים RNA צמוד דנ"א מוכנס באמצעות ליגז T4 DNA. הכן את התגובה הבאה 10 μL: 5 μL של חיץ קשירת 2x, 1 μL של וקטור T, 3 μL (~ 100 ng) של ה- DNA של הגן מוכנס 1 μL של ליגז DNA T4, ו דגירה O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. הוסף 5 μL של כל פלסמיד רקומביננטי המכיל את קטע bp 387 של LmigOR1 , 1,303 קטע bp של LmigOR2 ו 1,251 קטע BP של LmigORco בנפרד לתוך 50 μL של תאים Escherichia coli DH5α מוסמך ב סטרילי צינורות 1.5 מ"ל.
      1. מערבבים בעדינות ולשים את צינורות לתוך הקרח במשך 30 דקות ולאחר מכן דגירה אותם עבור 90 s ב 42° C. מעבירים אותם בחזרה לקרח במשך 3 דקות.
      2. הוסף 450 μL של Luria-Bertani בינוני (LB) נוזל בינוני ללא ampicillin לכל צינור ו דגירה אותם שייקר בסל"ד 150 עבור 1 שעה ב 37 ° C כדי לשחזר את E. coli DH5α.
      3. קח 100 aliquot μL של כל transformant ולהשתמש בהם כדי לחסן LB מוצק צלחות המצע המכיל 50 מיקרוגרם / mL ampicillin, 24 מיקרוגרם / מ"ל ​​isopropyl β-D-1-thiogalactopyranנוסide (IPTG), ו 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​5-bromo-4 כלורו -3-אינדוליל-β-D-galactopyranoside (X-gal).
      4. דגירה אלה צלחות בחממה קבועה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. מסך היעד פלסמידים רקומביננטי באמצעות שיטת ההקרנה כחול לבן. רצף היעד פלסמידים רקומביננטי באמצעות סידור רצף ולזהות את שלושת הגנים או להוסיף כיוונים.
  3. בחר הגבלת endonucleases כדי ליניארי פלסמידים רקומביננטי
    1. השתמש endonucleases הגבלה לאלא רק לעכל באתר שיבוט מרובים של הווקטור, אלא גם לא לחתוך את ה- DNA להוסיף. בניסוי זה, כל 3 גנים מוכנסים לתוך וקטור T בכיוון המתאים לזה של וקטור.
    2. השתמש non אני הגבלה endonuclease כדי לינאריזציה רקומביננטי פלסמידים המכילים את החלק 387 BP של LmigOR1 , 1,303 קטע bp של LmigOR2 ו 1,251 קטע BP של Lmigorco לייצר את בדיקות antisense. השתמש Sp e אני הגבלה endonuclease לייצר בדיקות חוש.
      הערה: אם הכיוון להוסיף מתאים לזה של וקטור, ולאחר מכן אתר הגבלה ייחודי מסוף T7 נבחר לינאריזציה רקומביננטי פלסמיד ו SP6 RNA פולימראז משמש להכנת בדיקה antisense. אתר הגבלה ייחודי מסוף SP6 נבחר ללינאריזציה של הפלסמיד רקומביננטי, ואת הפולימרז T7 RNA משמש להכנת בדיקה חוש. אחרת, אם כיוון ההוספה אינו מתאים ל - tהוא כיוון של וקטור, ואז אתר הגבלה ייחודי מסוף SP6 נבחר לינאריזציה רקומביננטי פלסמיד ו T7 RNA פולימראז משמש להכנת בדיקה antisense. אתר הגבלה ייחודי מסוף T7 נבחר לינאריזציה רקומבינציה רקומביננטי, ואת פולימרז SP6 RNA משמש להכנת בדיקה חוש.
  4. טיהור פלסמידים רקומביננטי ליניארי
    1. Digest 20 מיקרוגרם כל אחד משלושת פלסמידים רקומביננטי המכיל את קטע BP 387 של LmigOR1 , 1,303 קטע BP של LmigOR2 ו 1,251 קטע BP של LmigORco באמצעות endonuclease NCO אני הגבלה בתגובת 100 μL המכיל 10 μL של חיץ 10x, 40 μL של 0.5 מיקרוגרם / μL פלסמיד, 3 μL של NCO אני ו 47 μL של RNase חינם H 2 O, ואחריו הדגירה 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
    2. באופן דומה, לעכל 20 מיקרוגרם של כל אלה שלושה פלסמידים רקומביננטי uלשיר את endonuclease הגבלת Spe לי.
    3. טיהור אלה פלסמידים מתעכל באמצעות ערכת מיצוי ג 'ל כמתואר 1.1.2. לקבוע את הריכוזים של אלה שחולצו linasmized רקומביננטי פלסמידים על ידי spectrophotometry ולהתאים 0.5 מיקרוגרם / μL.
  5. הכינו בדיקות אנטיסנס וחיישנים
    1. השתמש במערכת השעתוק T7 / SP6 RNA כדי ליצור בדיקות אנטיסנס וחוש. SP6 RNA פולימראז משמש לתעתוק RNA פעמיים תקועים עבור DIG ו- biotin שכותרתו antisense בדיקות אלה שלושה גנים באמצעות פלסמידים רקומביננטי לינארית כמו תבניות במבחנה . הפולימרז T7 RNA משמש לייצר בדיקות חוש. לבצע את התגובה בנפח סופי 20 μL, המכיל 2 μL של 10x תערובת NTP, 2 μL של חיץ תמליל 10X, 1 μL של מעכבי RNase, 2 μL של פולימרז T7 או SP6 RNA, 4 μL של 0.5 מיקרוגרם / μL linasmized פלסמיד ו 9 μL RNase חינם H 2 O, אחריועל ידי הדגירה 3 שעה ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. דגירה DIG ו- biotin שכותרתו antisense והבחינות חוש במשך 30 דקות עם DNase 1 μL ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 2.5 μL של 5 M LiCl ו 75 μL של אתנול מוחלט, ולאחר מכן דגירה התגובות במשך 30 דקות ב -70 מעלות צלזיוס.
    3. צנטריפוגה ב XG 15,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C. בזהירות decant supernatant. הוסף 150 μL של אתנול 70% לשטוף את המשקע. הכן אתנול 70% (1 L) על ידי הוספת אתנול 95% (736.8 מ"ל) למים מזוקקים סטריליים (263.2 מ"ל).
    4. צנטריפוגה ב XG 15,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C שוב ויבש את האוויר גלולה במשך 5-10 דקות ב RT. הוסף 25 μL של RNase חינם H 2 O כדי לפזר את antisense רנ"א בדיקות חוש.
    5. אם אורכו של הגן שהוכנס הוא יותר מ 1 kb, לאחר מכן רסיס RNA antisense בדיקות חוש לאורך ממוצע של 300 ~ BP על ידי הדגירה של bicarbonate-carbonate פתרונות חיץ. בצע את התגובה 50 נפח סופי μL, גOntaining 25 μL של בדיקה RNA ו 25 μL של פתרון חיץ ביקרבונט-פחמתי (80 מ"מ NaHCO 3 , 120 מ"מ Na 2 CO 3 , pH 10.2) ב 60 מעלות צלזיוס. זמן הידרוליזה נדרש על ידי נוסחה שפורסמה בעבר 17 .
    6. הוסף 5 μL של חומצה אצטית 10% כדי לעצור את התגובה. בניסוי זה, שבר את LmigOR2 ו Lmigorco antisense ואת תחושת בדיקות עבור 24 ו - 23 דקות, בהתאמה.
      t = (L o -L ו) / KXL o XL F
      O L = אורכי שהבר הראשוניים kb
      L = F אורך השבר הסופי ב kb
      K = קצב קבוע עבור הידרוליזה, כ 0.11 קילו -1 דקות -1
      T = זמן הידרוליזה בדקה
    7. לבסוף, להוסיף 250 μL של חיץ הכלאה ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.

2. הכנת קטעי קרייסטט

  1. טפחו את הפריזיNg microtome ל -24 ° C.
  2. בחר ארבה מבוגר חדש, כי הם פעילים ויש להם אנטנות שלמות. חותכים את האנטנות לחתיכות 2-3 מ"מ באמצעות סכיני גילוח סטריליים.
  3. שים מתחם OCT על מחזיק microtome מקפיא והניח אחד או שניים דגימות על המתחם אופקית. לאחר מכן, להעביר את בעל לתוך microtome מקפיא ב -24 ° C כדי לאזן עד המתחם קופא. מוציאים את המחזיק ומכסים את הדגימות במתחם קטן. מעבירים את המחזיק לתוך microtome מקפיא ב -24 ° C שוב לפחות 10 דקות ( איור 1 ).
    הערה: הימנע מקבל בועות במתחם.
  4. תקן את בעל עם דגימות לתוך microtome מקפיא, ולאחר מכן סעיף דגימות קפוא לתוך פרוסות 12 מיקרומטר עבה ב -24 ° C.
  5. להפשיר את הפרוסות בזה אחר זה על שקופיות (25 x 75 מ"מ, nuclease חינם) ואוויר יבש במשך 10 דקות.

3. תיקון מדורים

  1. לאחר הכנת cryostatסעיפים, לשים את השקופיות במיכל פלסטיק (~ 100 x 40 x 80 מ"מ), ולתקן את הרקמות על ידי דוגרים את השקופיות בפתרון paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. לשטוף את השקופיות 1X פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) במשך 1 דקות.
  3. כדי לחסל את חלבונים אלקליין, להעביר את השקופיות 0.2 M HCl במשך 10 דקות.
  4. כדי לחסל את החלבונים פני השטח של חומצה גרעין, להעביר את השקופיות ל 1XPBS עם 1% Triton X-100 עבור 2 דקות.
  5. שטפו את השקופיות פעמיים במשך 30 שניות 1x PBS.
  6. לבסוף, לשטוף את השקופיות פתרון formamide במשך 10 דקות ב 4 ° C.

4. הכלאה

  1. הכינו את החיישנים האנטישמיים והחיוניים
    1. השתמש חיץ הכלאה לדלל RNA antisense או תחושת בדיקות צינורות 1.5 מ"ל nuclease חינם. בניסוי זה, עבור כל בדיקות antisense ואת תחושת ( LmigOR1, LmigOR2, ו LmigOrco ), להוסיף 1 μL של בדיקה 99 μL חיץ הכלאה לכל שקופית. בדרך כלל, השימוש בדילול של 1: 100 של בדיקות אנטיסנס מייצר איתותים חיוביים משמעותיים ורקעים נמוכים באמצעות פרוטוקול זה.
    2. עבור זיהוי כרומוגני, לדלל DIG שכותרתו בדיקות בנפרד.
    3. עבור זיהוי TSA, לדלל DIG שכותרתו LmigOR1 עם ביוטין שכותרתו בדיקות LmigOrco או DIG שכותרתו LmigOR2 עם בדיקות ביוטין LmigOR1 שכותרתו במאגר הכלאה.
    4. מחממים את דילולים למשך 10 דקות על 65 מעלות צלזיוס ולשים אותם על הקרח במשך 5 דקות לפחות.
  2. הַכלָאָה
    1. מסננים את השקופיות ומוסיפים 100 μL של antisense בדילול בדיקות חוש (שלב 4.1) על קטעי רקמות. ואז, coverslips מקום (24 ​​מ"מ x 50 מ"מ, nuclease חינם) על קטעי רקמה.
    2. מניחים את השקופיות מכוסות אופקית לתוך תיבת לח (~ 300 x 180 x 50 מ"מ 3 , איור 2 ) ו דגירהT 55 מעלות צלזיוס למשך 22 שעות. הוסף פתרון פורממיד או 1X PBS לחלק התחתון של התיבה כדי לשמור על לחות הסביבה, אבל לא להטביע את השקופיות בנוזל.
  3. כביסה וחסימה.
    1. לאחר הכלאה, להסיר את coverslips בזהירות. לשטוף את השקופיות פעמיים במשך 30 דקות ב 0.1x מלח נתרן ציטראט (SSC) ב 60 ° C.
      הערה: כביסה פירושה לשים את השקופיות במחזיק שקופיות, ולאחר מכן להציב לתוך מיכל פלסטיק בעדינות agitated על נדנדה (~ 50 סל"ד, איור 2 ).
    2. שוטפים את השקופיות 1x Tris-Buffered מלוחים (TBS) במשך 30 s.
    3. הוסף 1 מ"ל של 1% חסימת מגיב ב TBS בתוספת 0.05% Triton X-100 על כל שקופית, ו דגירה של 30 דקות. לאחר מכן, מחק את פתרון החסימה.
  4. אימונוהיסטוכימיה.
    1. עבור זיהוי כרומוגני, להשתמש בחסימת מגיב ב TBS לדלל 750 יחידות (U) / מ"ל ​​אנטי Digoxigenin AP מצומד antiboDy כדי 1.5 U / מ"ל ​​פתרון AP. הוסף 100 μL של פתרון AP לכל שקופית (24 מ"מ x 50 מ"מ) שקופית.
    2. עבור זיהוי TSA, השתמש בחסימת מגיב ב- TBS כדי לדלל 750 U / mL של נוגדן אנטי-Digoxigenin AP- מצומדות ונגד נוגדנים נוגדי אנטי-ביוטין streptavidin HRP- מצמידים לפתרון AP / HRP. הוסף 100 μL של פתרון AP / HRP לכל מכוסה (24 מ"מ x 50 מ"מ) שקופית.
    3. דגירה השקופיות בתיבה לח ( איור 2 ) במשך 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס. השתמש פתרון פורממיד או 1X PBS לשמור על תיבת לח אך לא רטוב.

5. מכתים

  1. הסר את coverslips בזהירות. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב 1x TBS בתוספת 0.05% Tween-20. שוטפים את השקופיות במאגר DAP (זיהוי כרומוגני: pH 9.5: זיהוי ה- TSA: pH 8.0) במשך 5 דקות.
  2. מכתים (זיהוי כרומוגני)
    1. הוסף 100 μL של NBT (375 מיקרוגרם / מ"ל) / BCIP (188 מיקרוגרם / מ"ל) פתרון המצע (מדולל DAP;PH 9.5) לכל שקופית. בזהירות במקום coverslips (24 x 50 מ"מ) על השקופיות.
    2. דגירה השקופיות בתיבה לח עם פתרון המצע עבור 10 דקות - O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: בדוק את הפיתוח על ידי הסתכלות על השקופיות מעת לעת מתחת למיקרוסקופ.
    3. כאשר הפיתוח מוכן, לעצור את התגובה על ידי העברת השקופיות לתוך המים.
  3. מכתים (זיהוי TSA)
    1. השתמש מזרק להעביר את HNPP (100 מיקרוגרם / מ"ל) / אדום מהיר (250 מיקרוגרם / מ"ל) המצע מסנן מזרק (0.22 מיקרומטר, איור 2 ).
    2. הוסף 100 μL של HNPP / מצע אדום מהיר לכל שקופית מכוסה coverslip (24 x 50 מ"מ). דגירה שקופיות במשך 30 דקות עם המצע HNPP / אדום מהיר ב RT.
    3. הסר את coverslips בזהירות, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות 1X TBS בתוספת 0.05% Tween-20.
    4. השתמש 100 μL של מצע TSA / מכוסה (24 x 50 מ"מ 2 ) שקופית. דגירה שקופיות עם מצע TSA במשך 10 דקות ב RT.
    5. הסר את coverslips בזהירות, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב 1x TBS בתוספת 0.05% Tween-20.
  4. הטמיעו את השקופיות ב- PBS / גליצרול (1: 3).
    הערה: לאחר סיום הליכים אלה, השקופיות יש לראות בהקדם האפשרי, כי האות ניאון יהיה להרוות במהירות.

6. תצפית

  1. איתור כרומוגני
    1. צפה סעיפים רקמות באמצעות מיקרוסקופ אופטי. בחר את 10X, 20X, ו 40X עדשות אובייקטיביות כדי לבחון את התוצאות של זיהוי כרומוגני.
    2. השתמש בתוכנה DP-BSW כדי לנתח את התוצאות וללכוד את התמונות.
  2. זיהוי TSA
    1. צפה בסעיפים רקמה באמצעות מיקרוסקופ confocal. DIG שכותרתו גנים יש לראות תחת 543 ננומטר אור, המציג צבע אדום, גנים שכותרתו ביוטין צריך להיותנצפו תחת 488 ננומטר אור, המציג צבע ירוק. כאשר הם מופיעים, הם מציגים צבע צהוב.
    2. בחר את 20X ו 40X עדשות אובייקטיביות כדי לבחון את התוצאות של זיהוי TSA, בהתאמה.
    3. השתמש בתוכנה FV1000 כדי לנתח את התוצאות וללכוד את התמונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עם זיהוי כרומוגני, תת קבוצה קטנה של תאים antennal בכל סעיף antennal המבוגר היה מסומן על ידי DIG שכותרתו LmigOR1 ו Lmigor2 בדיקות antisense ( איור 3 ). RNA על מקטעים רצופים כדי למקם LmigOR1 ו LmigOR2 הראה כי תאים אנטנלים המבטאים את שני הגנים היו ממוקמים באשכולות ORN להביע Lmigorco , המציין כי LmigOR1 ו LmigOR2 משוערים היו למעשה ליד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

זה קשה לבצע RNA ISH כדי למקם או גנים אנטנות חרקים בגלל רמות ביטוי של גנים או, למעט ORCO , הם נמוכים מאוד ושמירה פרוסות היסטולוגית של אנטנות חרקים קשה מאוד. בנוסף, זיהוי TSA הוא גם מאוד מסובך. כדי לטפל בבעיות אלה, יש לנקוט בצעדים הבאים. האנטנות נבחרות מתוך ארבה מבוגר החדש שיש להם עור רזה רך cuticles, אשר לשמור על המורפולוגיה שלהם על השקופית. הדגימות קפואים הם מחולקים לתוך 12 פרוסות עבה מיקרומטר. נעשה שימוש בבדיקות ביוטין ובדיג שכותרתו במיוחד. דטרגנטים, כגון Tween-20 ו- Tri...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף או כל ניגודי אינטרסים אחרים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (No.31472037). אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואין פירושו המלצה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים
2 פעמים; TSINGKETM מאסטר מיקסTSINGKE, סיןTSE004
ללא RNase H2OTIANGEN, סיןRT121-02
אגרוז רגיל G-10BIOWEST, ספרד91622
מאגר מחייבTIANgel ערכת טיהור מידי, TIANGEN, סיןDP209-02
מאגר איזוןTIANgel ערכת טיהור מידי, TIANGENסיןDP209-02
פתרון כביסהTIANgel ערכת טיהור מידי, TIANGEN, סיןDP209-02
T וקטורפרומגה, ארה"בA362A
T4 DNA LigasePromega, ארה"בM180A
Escherichia coli DH5αTIANGEN, סיןCB101
AmpicillinSigma, ארה"בA-6140
איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranosideInalco, ארה"ב1758-1400
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosideSBS Genetech, סיןGX1-500
Nco IBioLabs, ניו אינגלנדR0193S
Spe IBioLabs, ניו אינגלנדRNA R0133M
DIGרוש, שוויץערכת
ביוטין רוש, שוויץערכתתיוג
DNaseDIG, רוש, שוויץ11175025910
LiClסינופארם, סין10012718
אתנולסינופארם, סין10009257
חומצה אצטיתבייג'ינג כימיקל ריג'נטס חברה, סין10000292
רקמות-טק O.C.T. תרכובתסאקורה פינטק אירופה, Zoeterwoude, הולנד4583
שקופיותטינה ג'ין האו יאנג ייצור ביולוגי ושות', LTE, סיןFISH0010
HClסינופארם, סין80070591
MillexMillipore, ארה"בSLGP033RS
Tween 20AMRESCO, ארה"ב0777-500ML
Nitroblue טטרזוליום כלוריד / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate מלח טולואידיןרוש, שוויץ11175041910
גליצרולסינופארם, סין10010618
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>תגובות
><חזק>פתרונות
1&פעמים; Tris-acetate-EDTASigma, ארה"בV900483-1KG0.04 mol/L Tris-Base
1& פעמים; Tris-acetate-EDTA חברתריג'נטס כימית בייג'ינג, סין100002920.12% חומצה אצטית
1& פעמים; Tris-acetate-EDTASigma, ארה"ב03677חומצה אתילנדיאמינטטראצטית מלח דיסודיום (EDTA)
מדיום נוזלי Luria-Bertani (LB)סינופארם, סין10019392 10 גרם/ליטר
NaCl מדיום נוזלי לוריא-ברטאני (LB)MERCK, גרמניהVM33523110 גרם/ליטר פפטון מקזאין (טריפטון)
מדיום נוזלי לוריא-ברטני (LB)MERCK, גרמניהVM3615265 גרם/ליטר תמצית שמרים
צלחת מצע מוצק LBסינופארם, סין1001939210 גרם/ליטר NaCl
LB צלחת מצע מוצקMERCK, גרמניהVM33523110 גרם/ליטר פפטון מקזאין (טריפטון)
צלחת מצע מוצק LBMERCK, גרמניהVM3615265 גרם/ליטר תמצית שמרים
צלחת מצע מוצק LBWISENT ING, קנדה800-010-CG15 גרם/ליטר אגר כיתה בקטריולוגית
10 פעמים; תמיסת מלח חומצית פוספט (PBS, pH 7.1)סינופארם, סין100193928.5% NaCl
10& פעמים; תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.1)סיגמא, ארה"בV900041-500G14 מ"מ KH<תת>2PO4
10& פעמים; תמיסת מלח חומצה פוספט (PBS, pH 7.1)סיגמא, ארה"בV900268-500G80 מ"מ Na2HPO4
10 פעמים; תמיסת מלח Tris-Buffered (TBS, pH 7.5)סיגמא, ארה"בV900483-1 ק"ג1 מ' Tris-Base
10× תמיסת מלח Tris-Buffered (TBS, pH 7.5)סינופארם, סין100193921.5 מ'
מאגר זיהוי NaCl (DAP)           זיהוי כרומוגני pH 9.5            זיהוי TSA pH 8.0סיגמא, ארה"בV900483-1KG100 מ"מ מאגר זיהוי Tris-Base
(DAP)           זיהוי כרומוגני pH 9.5            זיהוי TSA pH 8.0סינופארם, סין10019392100 מ"מ
מאגר זיהוי NaCl (DAP)           זיהוי כרומוגני pH 9.5            זיהוי TSA pH 8.0סיגמא, ארה"בV900020-500G50 מ"מ MgCl2· 6 שעות<תת>2O
20&פעמים; מי מלח-נתרן ציטראט (pH 7.0)סינופארם, סין100193923 מ' NaCl
20&; תמיסת מלח-נתרן ציטראט (pH 7.0)סיגמא, ארה"בV900095-500 גרם0.3 מ' Na-ציטראט
4% תמיסת פרפורמלדהיד (PFA, pH 9.5)סיגמא, ארה"בV900894-100 גרם4% מאגר
נתרן קרבונטסיגמא, ארה"בV900182-500 גרם0.1 מ' NaHCO<תת>3מאגר
נתרן קרבונט (pH 10.2)סיגמא, ארה"בV900182-500G80 מ"מ NaHCO3
נתרן קרבונט בופר (pH 10.2)סיגמא, ארה"בS7795-500G120 מ"מ Na2CO3
Formamide Solution (pH 10.2)MPBIO, ארה"בFORMD00250% תמיסת פורממיד פורממיד נטולת יונים
(pH 10.2)5& פעמים; מאגר חסימת מלח-נתרן ציטראט
ב-TBSרוש, שוויץ111750419101%
מאגר חסימת כתמים ב-TBSאמרסקו, ארה"0694-500 מ"ל0.03% טריטון X-100
מאגר חוסם ב-TBS1& פעמים; תמיסת מלח חוצצת
Tris תמיסת פוספטאז אלקלייןרוש, שוויץ11175041910 1.5 U/mL נוגדן מצומד אנטי דיגוקסיגנין פוספטאז אלקליין
תמיסתפוספטאז אלקליין חוסם חוצץ ב-TBS
תמיסת פוספטאז אלקליין / צנון סוסיםרוש, שוויץ111750419101.5 U/mL אנטי דיגוקסיגנין פוספטאז אלקליין מצומד נוגדן
אלקליין פוספטאז / תמיסת פרוקסידאז צנון סוסיםערכת TSA, פרקין אלמר, ארה"בNEL701A001KT 1% אנטי ביוטין סטרפטווידין צנון סוסים פרוקסידאז - נוגדן מצומד
פוספטאז אלקליין / תמיסתחוסם מאגר ב-TBS
מאגר הכלאהMPBIO, ארה"בFORMD00250% היברידיזציה של פורממיד דה-יונים
חוצץפעמיים;
מאגר היברידיזציהסיגמא, ארה"בD8906-50G10% דקסטרן סולפט
מאגר הכלאהinvitrogen, ארה"בAM711920 ומיקרו; גרם/מ"ל שמרי t-RNA
מאגר היברידיזציהסיגמא, ארה"בD3159-10G0.2 מ"ג/מ"ל זרע הרינג DNA
2-הידרוקסי-3-חומצה נפטואית-2'-פנילאניליד פוספט/ 4-כלורו-2-מתילבנזנדיאזוניום המי-אבץ כלוריד מצע מלחרוש, שוויץ117588880011% 2-הידרוקסי-3-חומצה נפטואית-2'-פנילאניליד פוספט (10 מ"ג/מ"ל)
2-הידרוקסי-3-חומצה נפטואית-2'-פנילאניליד פוספט/ 4-כלורו-2-מתילבנזנדיאזוניום המי-אבץ כלוריד מצע מלחרוש, שוויץ117588880011% 4-כלורו-2-מתילבנזנדיאזוניום המי-אבץ כלוריד מלח (25 מ"ג/מ"ל)
2-הידרוקסי-3-חומצה נפטואית-2'-פנילנליד פוספט/ 4-כלורו-2-מתילבנזנדיאזוניום המי-אבץ כלוריד מצעזיהוי אות
טירמיד ערכת TSA מצע הגברהפרקין אלמר, ארה"בNEL701A001KT2% פלואורסצאין-טירמידים
מצע הגברת אות טירמידערכת TSA, פרקין אלמר, ארה"בNEL701A001KTמדלל
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>מכשיר
מקפיא מיקרוטוםלייקה, נוסלוך, גרמניהJung CM300 קריוסטט ספקטרופוטומטר
תרמו מדעי, ארה"בNANODROP 2000
מיקרוסקופ אופטיאולימפוס, טוקיו, יפןאולימפוס IX71מיקרוסקופ
מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוס, טוקיו, יפןאולימפוס BX45 מיקרוסקופ
ערכת תיוג תיוג RNA 11175025910 RNA 11685597910 פרפורמלדהיד ב פרוקסידאז צנון סוסים מלוח-נתרן ציטראט מלח קונפוקלי

מקורות

  1. Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
  2. Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
  3. Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
  4. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
  5. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  6. Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
  7. Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
  8. Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
  9. Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
  10. Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
  11. Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412(2013).
  12. Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50(2013).
  13. Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
  14. Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
  15. You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
  16. Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33(2016).
  17. Angerer, L. M., Angerer, R. C. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. Wilkinson, D. G. , IRL Press. Oxford. 2(1992).
  18. Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
  19. Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
  20. Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
  21. Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

נוירונים של קולטני ריחכימוסנסילההיברידיזציה פלורסצנטית דו-צבעיתהגן המסמן Orcoדטקציה כרומוגניתדטקציית TSAמיקרוסקופיה קונפוקאלית
לוקליזציה של גנים קולטן Odorant ב אנטנות ארבה על ידי RNA
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.