Method Article

בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר

DOI:

10.3791/55942

⸱

December 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Translational Research Imaging Center, Department of Clinical Radiology, University Hospital Münster

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגששים במטרה לייצג כלי חדשני עבור ניתוח המנגנונים המולקולריים, כגון חלבון ביטוי בסוגים שונים של המחלה (למשל, דלקת, זיהום, ו- tumorigenesis). במחקר זה, אנו מתארים הערכה כמותית טומוגרפי תלת מימדי של הסתננות מקרופאג מעיים במודל מאתר של קוליטיס באמצעות טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות F4/80-ספציפיות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים מאתר של המחלה הן תנאי הכרחי למחקר מדעי. עם זאת, כלי אבחון רבים כגון אנדוסקופיה או הדמיה טומוגרפי לא שגרתי מועסקים במודלים של בעלי חיים. המפרט ניסיוני קונבנציונאלי מסתמכים בדרך כלל על ניתוח לאחר המוות ו- ex-vivo , אשר למנוע בדיקות מעקב התוך אישי, להגדיל את מספר חיות מחקר צריך. טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות מאפשר את ההערכה לא פולשנית, החוזרות על עצמן, כמותיים, תלת מימדי של הגששים פלורסנט. היא רגישה מאוד, מאפשר את השימוש מקבלי מולקולרית, אשר מאפשר זיהוי ספציפי, איפיון מטרות מולקולריות שונות. בפרט, יישוב הגששים מייצגים כלי חדשני עבור ניתוח ביטוי גנים הפעלה וחלבון, דלקת, מחלות אוטואימוניות, זיהום, מחלת כלי דם, נדידת תאים, tumorigenesis, וכו '. במאמר זה, אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב על זו טכנולוגיית הדמיה מתוחכמות זיהוי ויוו , אפיון של דלקת (קרי, הסתננות מקרופאג F4/80-חיוביים) מודל מאתר בשימוש נרחב של דלקת מעיים. טכניקה זו עשויה לשמש גם בתחומים אחרים מחקר ', כגון מעקב תא או תאי מערכת החיסון.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים בעלי חיים נמצאים בשימוש נרחב במחקר מדעי, הליכים פולשנית רבים קיים צג פעילות המחלה, חיוניות, כגון כימות של שינויים במשקל הגוף או הניתוח של דם, שתן וצואה. עם זאת, אלה רק פרמטרים הפונדקאית עקיף עלולות גם להשתנות בין-אישי. הם לעתים קרובות חייב לקבל השלמה על ידי ניתוח לאחר המוות של רקמות הדגימה, אשר מונע טורי התבוננות בנקודות הזמן חוזרות, ישיר התבוננות פיזיולוגיים או פתולוגית תהליכים בתוך vivo. טכניקות הדמיה מתוחכם של חיית-קטן הופיעו, כולל קרוס הדמיה סקציות הדמיה אופטית, אנדוסקופיה, אשר מאפשר את פריט חזותי ישיר של תהליכים אלה ומאפשר גם ניתוחים חוזרים של חיות באותו1 , 2 ,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על-ידי לדנציג Landesamt נטור, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen על פי חוק הגנת חיות גרמנית (Tierschutzgesetz).

1. הגדרת הניסוי וחומרים

  1. טיפול בבעלי חיים.
    1. להשתמש סקס - ואת גיל-מתאימים עכברים של כל זן DSS, רגישים (לדוגמה, C57BL/6) 20-25 גרם משקל גוף.
    2. תוכנית עכברים לפחות חמישה או יותר לכל קבוצה ניסיונית והבית העכברים לפי הנחיות טיפול בבעלי חיים מקומיים.
    3. מספקים תקן האוכל מכרסמים דיאטה ופעילות בלוק שתיית מים ad libitum.
    4. להסיר את האוכל הרגיל ולהחליף אותו עם צ'או אספסת ללא לפחות שלושה ימים לפני סריקה כדי להפ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכה של קוליטיס כיבית:

DSS-induced קוליטיס היא דוגמנית מאתר המושרה כימית של דלקת מעיים דומה האדם מחלת המעי הדלקתי, מוביל לירידה במשקל, דימום רקטלי, כיבי שטחית של נזק הרירית עכברים רגישים15. זה שימושי במיוחד לחקור את התרומה של מערכת החיסון המולדת להתפתחות של דלקת מעיים10,11. לזירוז מנע בעוצמה colitic דלקת, עכברים היו ללא הרף מנוהל.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות טכניקות הדמיה רפואית התפתחו במהירות בשנים האחרונות, אנחנו עדיין מוגבלת היכולת לזהות תהליכים דלקתיים או גידולים, כמו גם מחלות אחרות, בשלבי ההתפתחות. עם זאת, דבר זה חיוני להבנה הגידול, הפלישה, או גרורות, תהליכים תאיים בהתפתחות של מחלות דלקתיות ומחלות ניווניות, וכלי דם אימונולוגי. ואילו טכניקות הדמיה המסורתית להסתמך על פרמטרים פיזיים או פיזיולוגיים, הדמיה מולקולרית מאפשרת את החזיית מסוים סמנים מולקולריים ויוו20.

עבור הדמיה חיית-קטן, גישות מונחה רדיונוקלידים .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים גב' סוניה Dufentester, גב אלקה וובר, גב' נעמה Niepagenkämper לסיוע טכני מעולה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<בריאגנטים חזקים>
דיאטה נטולת אספסתHarlan Laboritories, מדיסון, ארה"ב2014
משחת עיניים BepanthenBayer, Leverkusen, Germany80469764
Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, אופסלה, שוודיהDB001
EosinSigma - Aldrich, Deisenhofen, גרמניהE 4382
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)                                                 Sigma - Aldrich , Deisenhofen , גרמניהE 9884
Florene 100V/VAbbott , וויאסבאדן, גרמניהB506
Haematoxylin                                                                                                       Sigma - Aldrich, Deisenhofen, גרמניהHHS32-1L
O.C.T. תרכובת רקמות טק                                                                 Sakura, Zoeterwonde, הולנד4583מקבע לניתוחים היסטולוגיים
תמיסת מלח חוצצת פוספט, PBSLonza, Verviers, בלגיה4629
נתרן כלורי 0,9%בראון, Melsungen, גרמניה5/12211095/0411
אבקת נתרן ביקרבונטSigma Aldrich Deisenhofen, גרמניהS5761
תזונה סטנדרטיתAltromin, Lage, גרמניה1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, ליידן, הולנד4566
Hemoccult (מבחן נייר גואיאק)בקמן קולטר, גרמניה3060
נוגדן ביוטין חולדה נגד עכבר נגד F4/80Serotec, אוקספורד, בריטניהMCA497B
ביוטין חולדה נגד עכבר נגד GR-1 BD Pharmingen, היידלברג גרמניה553125
Streptavidin-Alexa546, דרמשטדט, גרמניהS-11225מקסימום עירור/פליטה:  556/573nm
נוגדן נגד עכברים נגד עכברים נגד עכברים TCCalteg, Burlingame, ארה"בR2b06
נוגדן מטוהר נגד עכבר F4/80BioLegend, לונדון, בריטניה123102
DAPISigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניהD9542
FITC מצומד נגד Ly6C נוגדן נגד עכבריםBD Pharmingen, היידלברג, גרמניה553104
FACS bufferBD Pharmingen, היידלברג, גרמניה342003
Cy7 NHS EsterGE Healthcare  אירופה, פרייבורג, גרמניהPA17104
MPO ELISAImmundiagnostik AG, בנסהיים, גרמניהK 6631B
Cy5.5 עם תווית נוגדן נגד עכבר F4/80 BioLegend, לונדון, בריטניה123127מוכן לשימוש נוגדנים מסומנים (אלטרנטיבה)
אנטי-עכבר F4/80 אנטיגן PerCP-Cyanine5.5eBioscience, וולת'אם, ארה"ב45-4801-80מוכן לשימוש בנוגדנים מסומנים (חלופה)
DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma-Aldrich , דייזנהופן, גרמניה67-68-5
IsofluraneSigma-Aldrich , דייזנהופן, גרמניה792632
אתנולסיגמא-אולדריץ', דייזנהופן, גרמניה64-17-5
אלבומין סרום בקר (BSA)Sigma-Aldrich, דייזנהופן, גרמניהA4612
Tris תמיסת מלח חוצצת (TBS)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניהSRE0032
שםCompanyCatalog NumberComments
strong>Equipment
FACS Calibur Flow Cytometry SystemBD Biosciences GmbH, היידלברג, גרמניה
FMT 2000 In Vivo Imaging SystemPerkinElmer Inc., Waltham, MA, ארה"בFMT2000
True Quant 3.1 Imaging Analysis SoftwarePerkinElmer Inc., Waltham, MA, ארה"ב כלול ב-FMT2000
Leica DMLB מיקרוסקופ פלואורסצנטיLeica,   35578 Wetzlar, גרמניה DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070Bandelin, 12207 ברלין, גרמניהHD 2070הומוגנייזר
קולי אזמל חד פעמי מס' 10סיגמא-אולדריץ', דייזנהופן, גרמניהZ692395-10EA
מספריים מצנבאום 14 ס"מEhrhardt Medizinprodukte GmbH, גייזלינגן, גרמניה22398330
מזרק נעילת לואר 5 מ"לסיגמא-אולדריץ', דייזנהופן, מחטיZ248010
Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניהZ192368 
שפופרת פלקון 50 מ"לBD Biosciences, ארמבודגם, בלגיה352070
בדיקות מולקולריות מזרק בגרמניה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence mediated TomographyMacrophage DetectionIntestinal InflammationMurine Colitis ModelF4 80 AntibodyNon invasive Imaging3D ReconstructionAntibody TracerDisease Activity MonitoringIn Vivo Tracking

Related Articles