הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר

7.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55942

⸱

15 בדצמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Translational Research Imaging Center, Department of Clinical Radiology, University Hospital Münster

במאמר זה

סיכום

הגששים במטרה לייצג כלי חדשני עבור ניתוח המנגנונים המולקולריים, כגון חלבון ביטוי בסוגים שונים של המחלה (למשל, דלקת, זיהום, ו- tumorigenesis). במחקר זה, אנו מתארים הערכה כמותית טומוגרפי תלת מימדי של הסתננות מקרופאג מעיים במודל מאתר של קוליטיס באמצעות טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות F4/80-ספציפיות.

תקציר

מודלים מאתר של המחלה הן תנאי הכרחי למחקר מדעי. עם זאת, כלי אבחון רבים כגון אנדוסקופיה או הדמיה טומוגרפי לא שגרתי מועסקים במודלים של בעלי חיים. המפרט ניסיוני קונבנציונאלי מסתמכים בדרך כלל על ניתוח לאחר המוות ו- ex-vivo , אשר למנוע בדיקות מעקב התוך אישי, להגדיל את מספר חיות מחקר צריך. טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות מאפשר את ההערכה לא פולשנית, החוזרות על עצמן, כמותיים, תלת מימדי של הגששים פלורסנט. היא רגישה מאוד, מאפשר את השימוש מקבלי מולקולרית, אשר מאפשר זיהוי ספציפי, איפיון מטרות מולקולריות שונות. בפרט, יישוב הגששים מייצגים כלי חדשני עבור ניתוח ביטוי גנים הפעלה וחלבון, דלקת, מחלות אוטואימוניות, זיהום, מחלת כלי דם, נדידת תאים, tumorigenesis, וכו '. במאמר זה, אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב על זו טכנולוגיית הדמיה מתוחכמות זיהוי ויוו , אפיון של דלקת (קרי, הסתננות מקרופאג F4/80-חיוביים) מודל מאתר בשימוש נרחב של דלקת מעיים. טכניקה זו עשויה לשמש גם בתחומים אחרים מחקר ', כגון מעקב תא או תאי מערכת החיסון.

מבוא

מודלים בעלי חיים נמצאים בשימוש נרחב במחקר מדעי, הליכים פולשנית רבים קיים צג פעילות המחלה, חיוניות, כגון כימות של שינויים במשקל הגוף או הניתוח של דם, שתן וצואה. עם זאת, אלה רק פרמטרים הפונדקאית עקיף עלולות גם להשתנות בין-אישי. הם לעתים קרובות חייב לקבל השלמה על ידי ניתוח לאחר המוות של רקמות הדגימה, אשר מונע טורי התבוננות בנקודות הזמן חוזרות, ישיר התבוננות פיזיולוגיים או פתולוגית תהליכים בתוך vivo. טכניקות הדמיה מתוחכם של חיית-קטן הופיעו, כולל קרוס הדמיה סקציות הדמיה אופטית, אנדוסקופיה, אשר מאפשר את פריט חזותי ישיר של תהליכים אלה ומאפשר גם ניתוחים חוזרים של חיות באותו1 , 2 , 3. בנוסף, האפשרות לפקח שוב ושוב מצבים שונים של מחלת החיה אותו עשוי להקטין את מספר בעלי חיים לצורך, אשר עשוי להיות נחשק אתיקה בעלי חיים מנקודת מבט.

מספר טכניקות דימות אופטי שונות קיימות עבור ויוו פלורסצנטיות הדמיה. במקור, הדמיה קונאפוקלית הועסק ללמוד משטח ואירועים פלורסנט מהסבא4,5. לאחרונה, עם זאת, הטומוגרפיה מערכות המאפשרות עבור הערכות רקמות תלת מימד כמותי כבר מפותחת6. זה הושג באמצעות הפיתוח של הגששים פלורסנט הפולטות אור בספקטרום (ניר)-סגול, מציע קליטה נמוכה, גלאי רגיש, מקורות אור מונוכרומטי7. ואילו טכניקות הדמיה הצלבה מסורתיים, כגון טומוגרפיה (CT), דימות תהודה מגנטית (MRI) או אולטרסאונד (ארה ב), מסתמכים בעיקר על פרמטרים פיזיים והמחש מורפולוגיה, הדמיה אופטית יכולים לספק מידע נוסף על תהליכים מולקולריים הבסיסי באמצעות פלורסנט אנדוגני או אקסוגני רגשים8.

ההתקדמות בביולוגיה מולקולרית סייעו כדי להקל על הדור של הגששים מולקולרית פלורסנט חכם, ממוקד עבור מספר גדל והולך של מטרות. לדוגמה, ספיגת קולטן בתיווך והפצה באזור היעד נתון, ניתן לאבחן באמצעות נוגדנים התווית על-ידי נגזרת carbocyanine9. השפע של נוגדנים זמינים, ניתן שכותרתו שישמשו המשדרים ספציפיים באזורים נגישים אחרת של הגוף, מספק תובנות ותהליכי מולקולרית הסלולר במודלים של tumorigenesis, ניווניות, חסר תקדים מחלות לב וכלי דם, אוטואימונית, דלקתיות7.

במחקר זה, אנו מתארים את השימוש בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה במודל של מאתר של קוליטיס כיבית. לתוספי נתרן גופרתי (DSS)-קוליטיס המושרה הוא מודל העכבר המושרה כימי סטנדרטי של דלקת מעיים הדומה מעי דלקתיות המחלה (מחלת המעי הדלקתי)10. זה שימושי במיוחד להעריך את התרומה של מערכת החיסון המולדת להתפתחות של דלקת מעיים11. מאז הגיוס, הפעלה, חדירה של ומונוציטים ו מקרופאגים לייצג שלבים קריטיים בפתוגנזה של מחלת המעי הדלקתי, ויזואליזציה של הגיוס שלהם וקינטיקה של חדירה חיוניים ניטור, לדוגמה, את השפעת חומרים טיפולית פוטנציאל גם עם הגדרת פרה12. אנחנו מתארים את תנאי הגיוס של קוליטיס DSS ומדגימים בתיווך טומוגרפיה אפיון מקרופאג חדירה לתוך רירית המעיים באמצעות טומוגרפיה מולקולרית פלורסצנטיות עבור הפריט החזותי ספציפי של סמן מונוציט/מקרופאג F4/80 13. בנוסף, אנחנו להמחיש שגרות עזר ומשלימה, כגון נוגדנים labelling; הגדרת הניסוי; ניתוח ופרשנות של תמונות שהושג, מתאם עם המפרט קונבנציונלי כגון מדדי פעילות המחלה, flow cytometry ניתוח היסטולוגית, ואת אימונוהיסטוכימיה. נדון מגבלות של הטכניקה הזאת השוואות כדי שיטות הדמיה אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על-ידי לדנציג Landesamt נטור, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen על פי חוק הגנת חיות גרמנית (Tierschutzgesetz).

1. הגדרת הניסוי וחומרים

  1. טיפול בבעלי חיים.
    1. להשתמש סקס - ואת גיל-מתאימים עכברים של כל זן DSS, רגישים (לדוגמה, C57BL/6) 20-25 גרם משקל גוף.
    2. תוכנית עכברים לפחות חמישה או יותר לכל קבוצה ניסיונית והבית העכברים לפי הנחיות טיפול בבעלי חיים מקומיים.
    3. מספקים תקן האוכל מכרסמים דיאטה ופעילות בלוק שתיית מים ad libitum.
    4. להסיר את האוכל הרגיל ולהחליף אותו עם צ'או אספסת ללא לפחות שלושה ימים לפני סריקה כדי להפחית את endoluminal אוטומטי-זריחה.
  2. אינדוקציה של קוליטיס DSS-induced חריפה.
    1. לפזר 2 גר' DSS (משקל מולקולרי ~ 40,000 דא) ב- 100 מ של בלוק שתיית מים כדי להשיג של % 2 (w/v פתרון).
    2. למלא את האספקה שתייה של העכברים באופן בלעדי עם הפתרון DSS ולהעריך 5 מ של נוזל לכל עכבר לכל יום. לספק המים לשתייה אותו בלי DSS בקרת עכברים10.
      הערה: לפקח על העכברים מדי יום עד סוף הניסוי. המתת חסד העכברים זה לאבד גדול מ- 20% ממשקל גופם הראשונית או זה הפכה אדעך (קרי, מגובנן יציבה, התנועה ירד בהתמדה, בצורה ניכרת את תפקוד, להקים את המעיל) בהתאם להנחיות מקומיים החלים על בעלי חיים רווחה.
  3. הכנת טומוגרפיה בתיווך זריחה.
    1. תווית הנוגדן הרצוי (למשל, עכברוש אנטי עכבר F4/80) עם פלורסצנטיות צבע (למשל, Cyanine7, λעירור: 750 ננומטר, λפליטה: 776 ננומטר) כפי שמתואר הפרוטוקול של היצרן. Dialyze נוגדנים מטוהרים קרום דיאליזה המתאים (גודל הנקבוביות < 50-100 kDa) נגד 1 ליטר של 0.15 מ' נתרן כלורי לפחות 2 שעות או לילה.
      1. להעביר את הנוגדן 1 ליטר של 0.1 M NaHCO3 , dialyze כבר לפחות שעתיים.
      2. להמיס את הכמות הנדרשת של הפלורסנט ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) (10.8 µL/מ ג של נוגדנים) ולהוסיף אותו לפתרון של נוגדן. השתמש את הפלורסנט עודף טוחנת 20-fold להשגת צבע-כדי-חלבון יחס של 1:3.
      3. דגירה בחושך ב 4 ° C עבור ה 1 להסיר ללא תווית נוגדנים על ידי דיאליזה נגד 1 ליטר של 0.15 מ' נתרן או באמצעות עמודה desalting PD-10 ולפתור בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) עבור יישום ויוו .
      4. לקבוע את ריכוז נוגדן הסופי ואת יחס תיוג על ידי ספקטרופוטומטר.
      5. למדוד את ריכוז חלבון-בליעת 250-330 nm ולשקול קליטה נוספים מאת לצבוע. לתקן את הספיגה המרבי-280 ננומטר (חלבון) על ידי 11 אחוז הספיגה המרבי-750 ננומטר (השלב הבא) עבור תיוג Cyanine7.
      6. למדוד לדילול של המתחם (בדרך כלל 1:10) ב- 250-800 nm ולחלץ את הריכוז של Cyanine7-750 ננומטר.
      7. לקבוע את היחס לצבוע-כדי-חלבון כמו: צבע/נוגדנים = ספיגה מירבית-750 ננומטר / 200,000 / (ספיגה מירבית-280 nm - 0.11 x מקסימום ספיגה-750 ננומטר) / 170,000.
      8. לשמור את הפתרון נוגדנים ב 4 ° C, מגן על זה מפני אור כדי למנוע הלבנת לפני ההזרקה.
    2. לטעון נוגדנים הדרושים לפתרון האחסון במחט סטרילית מיד לפני ההזרקה, מגן מפני אור עד הוא משמש.
    3. לקבוע העיתוי אופטימלית של הזרקת בדיקה וההליך סריקה, בהתאם פרמקוקינטיקה מעקב.
    4. עזים ומתנגד העכברים באמצעות איזופלוריין 1.5-2.5% בשאיפה חמצן או למקם אותם בצורה מאובטחת restrainer ייעודי עבור הזרקה וריד הזנב של הנוגדנים עם תוויות.
    5. עבור נוגדנים באורך מלא, להזריק את הנוגדן שכותרתו לפחות 24 שעןת לפני סריקה, כגון עבור אנטי-העכבר F4/80 מקרופאג ויזואליזציה של קוליטיס מאתר. מזריקים לווריד עכברים (עירוי) דרך הזנב הווריד עם נוגדן שכותרתו בסכום המתאים nmol 2.0 של צבע.
    6. השתמש באותה מידה כאנטי נוגדנים לא ספציפי (למשל, עכברוש IgG או isotype אחר התואם המורשת נוגדן ראשוני) פקד isotype במנות שוות ערך לאלו של המכשיר הספציפי.
      הערה: התוצאות של in vivo סורק לאחר הזרקה של המתחם שליטה יכול לשמש כנקודת התייחסות הפרשנות של המכשיר הספציפי לעיבוד נתונים.
    7. השתמש מכונת גילוח חשמלית לגלח את פרוות בעלי חיים באזור הבטן כדי למזער את השתקפות האור וספיגה.

2. ציוד טכני

  1. להשתמש בהתקן וטרינרי בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה (FMT) עבור חיית-קטן קרינה פלואורסצנטית ( איור 4).
  2. ליצור מחקר חדש עבור כל פרוייקט על-ידי לחיצה על "מחקר חדש" כפתור וכלול בתיאור המחקר את המשדרים הרלוונטיים, כולל פרמטרים הדמיה מינונים לשימוש עתידי.
  3. במסגרת מחקר זה, ליצור קבוצות לימוד על פי תכנון המחקר המתאימים (למשל, ספציפית מעקב ובקרה isotype לא ספציפי) על-ידי לחיצה על "קבוצת המחקר החדשה" כפתור. לצייד כל קבוצת מחקר עם מספר בעלי החיים המתאימים.
  4. לכייל את המערכת עבור המבנה מעקב.
    1. לבצע את הכיול עבור כל אצווה של המשדרים לנרמל עבור הווריאציה תיוג ולאפשר מדידה כמותית מנתונים. היי.
    2. בצע ההדרכה של היצרן מכשיר הכיול של כל מערכת בודדים; בעת בחירת "הוסף חיצי מעקב חדש", תספק המערכת מדריך לאורך השלבים. מספקים הדילול של הפתרון נוגדן יישומית, ריכוז מוחלט מחושב מעקב את הגשוש.
    3. עבור FMT, להשתמש פנטום מחקה רקמות של מאפיינים שהוגדרו עובי וקליטה (דמוי רקמה חיונית) ולמלא אותה עם נפח מסוים של הפתרון הנוגדן בשימוש. מדוד את זה על המכשיר FMT.
      הערה: המערכת ישתמש המדידה הפניה של המכשיר שסופקו, יחד עם ריכוז נתון, כדי לחשב ריכוזים מעקב מוחלטת מן העתיד ויוו מדידות.
  5. השתמש קלטת בדיקה מחוממת עם חום של 42 מעלות צלזיוס.
    הערה: פעולה זו מונעת העכברים הופך חום במהלך הבדיקה.

3. בעלי חיים הרדמה

  1. השתמש זרימה רצופה של 1.5-2% איזופלוריין של % vol ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]), /min21.5 L O כדי עזים ומתנגד העכברים.
להשתמש במערכות שאיפת שתוכננה במיוחד עבור מכרסמים הרדמה (איזופלוריין מאדה) כדי לשלוט בקלות את עומק הרדמה וכדי לצמצם חשיפה צוות.
  • הנח את העכבר בבית הבליעה עמיד בפני נזילה אינדוקציה והפעל את מכשיר אידוי לאספקת איזופלוריין (100% (v/v), כרך 5% חמצן, 3 L/min). לפקח על העכבר עד שכיבה ואף הבלתי-מודעים.
  • ממקמת הקלטת בדיקה עבור טומוגרפיה ממוחשבת, עם איזופלוריין רציף שאיפה דרך האף חרוט במינון של 100% v/v, 1.5% vol חמצן, 1.5 ליטר/דקה כדי למזער את חפצי אמנות תנועה במהלך הבדיקה. עבור שגרות שנמשך יותר מ 5 דקות, להחיל משחה עין העיניים העכבר כדי למנוע נזק הקרנית.
  • להעריך את עומק הרדמה על ידי בדיקת הרפלקסים. הנח את העכבר על גבו; אם הרדמה מספקת, העכבר אין לבטל. לצבוט את העכבר בעדינות בין הבהונות שלו; אם הרדמה מספקת, הרגל לא תהיה מופנמים (שלב של סובלנות כירורגית).

    • 4. סריקת טומוגרפיה קרינה פלואורסצנטית בתיווך

    הערה: להתאים את הפרטים הבאים, שהם ספציפיים למערכת FMT בשימוש זה ללמוד (ראה את הטבלה של חומרים) עבור התקני הדמיה של השתקפות פלורסצנטיות חלופי או FMT מערכות, לפי הצורך.

    1. הנח את העכבר anesthetized על גבו במגרה הבדיקה.
    2. בצע את ההליך סריקה.
      1. הכנס את הקלטת לתוך מערכת ההדמייה, לסגור אותו מיד כדי להבטיח הרדמה רציפה. בחר את הדגימה המתאימה מתוך קבוצת המחקר שיצרת קודם לכן. בחר את רכיב המעקב המנוהל מתוך התפריט הנפתח כדי להבטיח כי הערכים עבור מעקב ריכוז מחושבים כהלכה.
      2. לרכוש פלורסצנטיות התמונה השתקפות-אורך הגל המתאים (720 nm עבור Cyanine7) עבור סריקה ותכנון חלוקה לרמות השדה סריקה על-ידי לחיצה על לחצן "לרכוש תמונות".
      3. ראה כי השדה סריקה מופיע ככיסוי על התמונה השתקפות זריחה. להתאים אותו לאזור של הריבית (למשל, המעי הגס או הבטן), הימנעות אוויר או אזורים של פרווה הנותרים. בהתאם המטרה התמונה, להגדיר את מספר התמונה נקודות נתונים בתוך השדה סריקה על-ידי בחירה גס לרזולוציית סריקה-שדה בינוני וקנס בתפריט בצד הימין.
        הערה: עליך לזכור כי שדה סריקה בסדר אולי להציע יותר רזולוציה מרחבית על חשבון זמן סריקה משמעותית יותר.
      4. התחל ייבוא נתונים/תמונות-אורך הגל שנבחרו על ידי לחיצה על "סרוק".
        הערה: זמן הסריקה בינונית-פיין סריקה של הבטן כל תהיה בסביבות 5 דקות; בזמן הזה, כל נקודת נתונים בנפרד מואר על ידי עירור לייזר, קרינה פלואורסצנטית וכתוצאה מכך נרשם.
      5. הסר את החיה הקלטת הדמיה בסוף הסריקה ולאפשר החיה להתאושש לחלוטין לפני הנחת בחזרה לתוך הכלוב.
      6. חוזר את FMT אם לנכון בנקודות זמן שונות במהלך הניסוי (למשל, ימים 0, 5, ו 9-10 (סוף הניסוי)), אך קח בחשבון ההצטברות של נוגדנים בגוף, לכן הגדלת האות פלורסצנטיות רקע.

    5. שלאחר סריקה

    1. הנח את העכבר בכלוב נפרד על מגבת נייר תחת מנורה מחממת האורות האדומים ונטר את העכבר סימנים של אי נוחות או מצוקה עד החלמה מלאה. הנח את העכבר בחזרה לכלוב שלו בהתאמה כאשר ער לגמרי.
    2. המתת חסד של עכברים בסוף הניסוי על ידי המשלוח של CO2 isolator במינון של 100% (v/v), 100 vol % ו 3 L/min. לא מראש למלא את התא עם CO2, כמו חשיפה פתאומית ריכוזים גבוהים של CO2 עלול לגרום מצוקה. ודא מוות לאחר העכבר הפסיקה לנשום על ידי מצב משני עוקבות של המתת חסד כגון פריקה מהירה צוואר הרחם.
    3. Explant המעי הגס על ידי פתיחת בטן בטן ולבצע בסריקה ex-vivo של המעי הגס explanted, כמוסבר בשלבים 4.2.1 - 4.2.4. פתח כל המעי הגס longitudinally באמצעות קורות חיים כירורגי, שטפים היטב עם תמיסת לפני הכנתו עבור ניתוח נוסף.
    4. השתמש באזמל לחתוך קטע 0.5 ס מ מן המעי הגס דיסטלי ולמקם אותו מיד בשפופרת הקפאה 1.5-mL. . תקפיא את זה חנקן נוזלי, חנות ב-70 מעלות צלזיוס עד להמשך השימוש (למשל,מידות myeloperoxidase (MPO))
    5. תשתמשו במקל עץ, סכם הנותרים longitudinally פתחו המעי הגס מ דיסטלי למטרה צינתור, עם להקרין רירית ("טכניקה רולדה"), עבור ניתוחים היסטולוגית. למקם את ההכנה מקבע (ראה את הטבלה של חומרים) ומקפיאים -80 ° C14.

    6. נתונים שחזור ופרשנות

    1. להשתמש בכלי בנייה של תוכנת ההדמיה המתאימות ליצירת מפות תלת-ממדיות של התפלגות קרינה פלואורסצנטית הדמיה הנתונים הגולמיים; סריקות מתווספים באופן אוטומטי הכלי בנייה מחדש, כאשר בעת סריקה, הפונקציה 'הוספה לתור שחזור' נבחרה.
      1. אחרת, בחר את הסריקות מתוך התפריט הנפתח תחת המחקר בהתאמה, קבוצת לימוד, הסריקה באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר "להוסיף השיקום".
    2. לצורך ניתוח נוסף, לטעון את ערכת נתונים לתוך התוכנה ניתוח. בתפריט הנפתח בשורה העליונה, בחר המחקר המתאימים ולאחר מכן בחר את קבוצת המחקר, לחיה הבודדת מהתפריט בצד הימין; כל הסריקות שבוצעה עבור חיה זו יוצגו. בחר את הסריקה הנכונים ולחץ על "לטעון".
      הערה: שחזור תלת-ממד של ההתפלגות מעקב יופיע משמאל ככיסוי של התמונה השתקפות פלורסצנטיות בתחילה רכשה. הדגם ניתן לסובב, מוגדל עבור ניתוח קל יותר.
    3. לזהות מוקדים של הצטברות תווית לא ספציפי (למשל, הכבד או שתן בשלפוחית השתן) במפות תלת-ממד המשוחזרת, להבדיל ברקמות היעד (למשל, המעי הגס או המעי).
    4. בסרגל העליון, בחר את הצורה רועי המתאים ביותר עבור המטרה. תווית רקמת המטרה כמו אזורים מעניינים (ROI) על-ידי הצבת כלי המדידה המתאים בתוכנת ניתוח; התוכנה תספק עוצמת קרינה פלואורסצנטית רועי, וכן (pico-) כמויות טוחנת רכיב המעקב את הסריקה כוילה עבור.
    5. בחר את הסכום הכולל של מעקב ההחזר המתאים, מנורמל עבור גודל רועי, כמקבילה המתאימים ביותר עבור הערכת פעילות המחלה מתאם עם לחדור דלקתיות (היסטולוגיה).
      הערה: תכונות אחרות של רועי יכולה להיבחר במידת הצורך כנציג של דגם מסוים.

    7.לשעבר Vivo ניתוחים

    1. Hematoxylin אאוזין מכתים, immunofluorescence מכתים.
      1. Deparaffinize סעיפים על-ידי הצבתם 70% אתנול (EtOH) למשך 2 דקות; לאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים. כתם עם פתרון hematoxylin במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם מים חמים מהברז למשך 10 דקות.
      2. לשטוף עם מים מזוקקים, counterstain עם פתרון אאוזין למשך 2 דקות, ולשטוף שוב עם מים מזוקקים.
      3. במקום 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH, וקסילן (פי 2) למשך 2 דקות כל מייבשים ולנקות את הסעיפים. הר שרפי הרכבה בינונית.
    2. Immunofluorescence מכתים.
      1. השתמש הסעיפים רקמות שהושג בעבר ("סיפורי רולדה") עבור immunofluorescence מכתים והכן הקפאה-לחתוך קטעים של 7 מיקרומטר.
      2. לחסום את המעי הגס אצטון-קבוע וקפואים סעיפים ב- 5.0% עכברוש בסרום למשך 10 דקות, דגירה בין לילה עם מדולל (v 1/500/v) biotinylated החולדה הראשית העכבר נגד נוגדן F4/80. לשטוף את הסעיפים שלוש פעמים בתוך תמיסת מלח באגירה טריס (TBS), דגירה עם Streptavidin-FITC (בטחונות וי/v) ב- PBS/BSA (0.1% w/v) לילה ב 4 º C.
      3. רוחצים בסעיפים TBS את הכתם עם 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, 1:1000 v/v) להשגת חדות. לנתח את התמונות פלורסצנטיות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה את הטבלה של חומרים; 40 x הגדלה קוביה מסנן N2.1 מסנן עירור 515-560) ולספור את התאים F4/80-חיובית לכל שדה ובעוצמת.
        הערה: שקול להשתמש נוגדנים של שיבוט, תבנית זהה בשעת שילוב ויוו FMT, אחרי המוות היסטולוגיה ניתוחים כגון אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence מכתים, בהתאם המטרה המיועדת. איתור F4/80-חיוביות מקרופאגים ויוו ו- ex-vivo, שימשו בפורמטים שונים.
    3. מדידות MPO בדגימות המעי הגס.
      1. שימוש להשיג טריים, לשטוף-PBS דוגמאות המעי הגס או הדגימה המופשרים למדידות MPO. שוקל כל הדגימות ואת homogenize הרקמה במאגר פירוק הניתנים את אליסה קיט (ראה את הטבלה של חומרים)-נפח של µL 20 פירוק מאגר לכל מ"ג של רקמות.
      2. Sonicate 15 s (sonication תדר: 20 kHz, כוח: 70 W), centrifuge את הדגימות 10 דקות ב- 200 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
      3. שימוש אליסה זמינים מסחרית קיט (ראה את הטבלה של חומרים) על פי תיאורו באתר לפי יצרנים. לבצע את בדיקת כפילויות.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    הערכה של קוליטיס כיבית:

    DSS-induced קוליטיס היא דוגמנית מאתר המושרה כימית של דלקת מעיים דומה האדם מחלת המעי הדלקתי, מוביל לירידה במשקל, דימום רקטלי, כיבי שטחית של נזק הרירית עכברים רגישים15. זה שימושי במיוחד לחקור את התרומה של מערכת החיסון המולדת להתפתחות של דלקת מעיים10,11. לזירוז מנע בעוצמה colitic דלקת, עכברים היו ללא הרף מנוהל...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    למרות טכניקות הדמיה רפואית התפתחו במהירות בשנים האחרונות, אנחנו עדיין מוגבלת היכולת לזהות תהליכים דלקתיים או גידולים, כמו גם מחלות אחרות, בשלבי ההתפתחות. עם זאת, דבר זה חיוני להבנה הגידול, הפלישה, או גרורות, תהליכים תאיים בהתפתחות של מחלות דלקתיות ומחלות ניווניות, וכלי דם אימונולוגי. ואילו טכניקות הדמיה המסורתית להסתמך על פרמטרים פיזיים או פיזיולוגיים, הדמיה מולקולרית מאפשרת את החזיית מסוים סמנים מולקולריים ויוו20.

    עבור הדמיה חיית-קטן, גישות מונחה רדיונוקלידים ...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    המחברים אין לחשוף.

    תודות

    אנו מודים גב' סוניה Dufentester, גב אלקה וובר, גב' נעמה Niepagenkämper לסיוע טכני מעולה.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    <בריאגנטים חזקים>
    דיאטה נטולת אספסתHarlan Laboritories, מדיסון, ארה"ב2014
    משחת עיניים BepanthenBayer, Leverkusen, Germany80469764
    Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, אופסלה, שוודיהDB001
    EosinSigma - Aldrich, Deisenhofen, גרמניהE 4382
    חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)                                                 Sigma - Aldrich , Deisenhofen , גרמניהE 9884
    Florene 100V/VAbbott , וויאסבאדן, גרמניהB506
    Haematoxylin                                                                                                       Sigma - Aldrich, Deisenhofen, גרמניהHHS32-1L
    O.C.T. תרכובת רקמות טק                                                                 Sakura, Zoeterwonde, הולנד4583מקבע לניתוחים היסטולוגיים
    תמיסת מלח חוצצת פוספט, PBSLonza, Verviers, בלגיה4629
    נתרן כלורי 0,9%בראון, Melsungen, גרמניה5/12211095/0411
    אבקת נתרן ביקרבונטSigma Aldrich Deisenhofen, גרמניהS5761
    תזונה סטנדרטיתAltromin, Lage, גרמניה1320
    Tissue-Tek CryomoldSakura, ליידן, הולנד4566
    Hemoccult (מבחן נייר גואיאק)בקמן קולטר, גרמניה3060
    נוגדן ביוטין חולדה נגד עכבר נגד F4/80Serotec, אוקספורד, בריטניהMCA497B
    ביוטין חולדה נגד עכבר נגד GR-1 BD Pharmingen, היידלברג גרמניה553125
    Streptavidin-Alexa546, דרמשטדט, גרמניהS-11225מקסימום עירור/פליטה:  556/573nm
    נוגדן נגד עכברים נגד עכברים נגד עכברים TCCalteg, Burlingame, ארה"בR2b06
    נוגדן מטוהר נגד עכבר F4/80BioLegend, לונדון, בריטניה123102
    DAPISigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניהD9542
    FITC מצומד נגד Ly6C נוגדן נגד עכבריםBD Pharmingen, היידלברג, גרמניה553104
    FACS bufferBD Pharmingen, היידלברג, גרמניה342003
    Cy7 NHS EsterGE Healthcare  אירופה, פרייבורג, גרמניהPA17104
    MPO ELISAImmundiagnostik AG, בנסהיים, גרמניהK 6631B
    Cy5.5 עם תווית נוגדן נגד עכבר F4/80 BioLegend, לונדון, בריטניה123127מוכן לשימוש נוגדנים מסומנים (אלטרנטיבה)
    אנטי-עכבר F4/80 אנטיגן PerCP-Cyanine5.5eBioscience, וולת'אם, ארה"ב45-4801-80מוכן לשימוש בנוגדנים מסומנים (חלופה)
    DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma-Aldrich , דייזנהופן, גרמניה67-68-5
    IsofluraneSigma-Aldrich , דייזנהופן, גרמניה792632
    אתנולסיגמא-אולדריץ', דייזנהופן, גרמניה64-17-5
    אלבומין סרום בקר (BSA)Sigma-Aldrich, דייזנהופן, גרמניהA4612
    Tris תמיסת מלח חוצצת (TBS)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניהSRE0032
    שםCompanyCatalog NumberComments
    strong>Equipment
    FACS Calibur Flow Cytometry SystemBD Biosciences GmbH, היידלברג, גרמניה
    FMT 2000 In Vivo Imaging SystemPerkinElmer Inc., Waltham, MA, ארה"בFMT2000
    True Quant 3.1 Imaging Analysis SoftwarePerkinElmer Inc., Waltham, MA, ארה"ב כלול ב-FMT2000
    Leica DMLB מיקרוסקופ פלואורסצנטיLeica,   35578 Wetzlar, גרמניה DMLB
    Bandelin Sonopuls HD 2070Bandelin, 12207 ברלין, גרמניהHD 2070הומוגנייזר
    קולי אזמל חד פעמי מס' 10סיגמא-אולדריץ', דייזנהופן, גרמניהZ692395-10EA
    מספריים מצנבאום 14 ס"מEhrhardt Medizinprodukte GmbH, גייזלינגן, גרמניה22398330
    מזרק נעילת לואר 5 מ"לסיגמא-אולדריץ', דייזנהופן, מחטיZ248010
    Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, גרמניהZ192368 
    שפופרת פלקון 50 מ"לBD Biosciences, ארמבודגם, בלגיה352070
    בדיקות מולקולריות מזרק בגרמניה

    מקורות

    1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
    2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
    3. Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
    4. Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
    5. Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
    6. Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
    7. Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
    8. Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
    9. Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
    10. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
    11. Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
    12. Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
    13. Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
    14. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
    15. Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
    16. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678(2012).
    17. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
    18. Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
    19. Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
    20. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
    21. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
    22. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
    23. Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
    24. Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
    25. Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
    26. Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
    27. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
    28. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
    29. Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
    30. Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
    31. Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
    32. Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
    33. Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006(2013).
    34. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
    35. Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
    36. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    תגיות

    F4 80
    בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר
    צור קשר
    המלצה לספרייה

    פרטיות

    תנאי שימוש

    מדיניות

    2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.