שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטת התבוננות מופרה ב תודרנית באמצעות סיווג ביצית ואחריו את הבדיקה של היווצרות תבנית העובר תחת מיקרוסקופ.

תקציר

בהתחשב באופי מאוד לחיזוי ההתפתחות שלהם, העוברים תודרנית שימשו כמודל ללימודי של מורפוגנזה בצמחים. עם זאת, עוברים בשלב מוקדם של הצמח הבמה הם קטנים ומכילים כמה תאים, שהופך אותם קשה להתבונן ולנתח. שיטה מתואר כאן על אפיון הדפוס-צורה צמח העוברים תחת מיקרוסקופ באמצעות האורגניזם דגם תודרנית. בעקבות פינוי של טרי ovules באמצעות הפתרון של שותפה עסקית, יכול להיות שנצפו תא במספר של המורפולוגיה של העוברים ולאחר השלב ההתפתחותי שלהם יכול להיקבע על ידי התערבות דיפרנציאלית ניגודיות מיקרוסקופ באמצעות 100 X עדשה טבילה שמן. בנוסף, הביטוי של חלבונים ספציפיים סמן מתויג עם ירוק ניאון חלבון (GFP) נוטרה כדי להוסיף ביאורים תא מפרט זהות במהלך המתבנת העובר על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. לכן, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לצפות דפוס-צורה פראי-סוג צמח עוברי ברמות תאית ומולקולרית, לאפיין את התפקיד של גנים ספציפיים בהמתבנת העובר על-ידי השוואת צורה דפוס העוברים בין פראי-סוג צמחים מוטנטים קטלניים העובר. לכן, השיטה ניתן לאפיין מופרה ב תודרנית.

מבוא

מופרה הוא האירוע המוקדם ביותר בהתפתחות הצמח גבוה יותר. טפסים העובר בוגר מ זיגוטה דרך חלוקת התא ובידול תחת בקרת גנטי קפדנית^1,2. תודרנית העוברים הם מודל שימושי ללמוד את השליטה מורפוגנזה כי הרצף של חלוקות תאים במהלך מופרה עוקב אחר^3,דפוס הצפויות⁴. אולם, העובר תודרנית המכיל מספר תאים אחד הוא קטן מדי כדי להיות שנצפו וניתח. בנוסף, המוטציה של גנים מסוימים יכולים לגרום העובר lethality⁵, המציינת את התפקיד של הגנים האלה ב מופרה. האפיון של דפוס-צורה מוטנטים קטלניים העובר מספק בסיס להבנת המנגנון המולקולרי לפיה גנים חיוניים לווסת את התפתחות העובר.

שיטה מפורטת מתואר כאן על האפיון של היווצרות העובר דפוס בצמח דגם תודרנית באמצעות התבוננות מיקרוסקופית ישירה. השיטה כוללת סיווג ביצית ואחריו התצפית מיקרוסקופיים של העובר. אפיון מוטנטים קטלניים העובר גם מתואר.

המורפולוגיה של עוברי בשלבים התפתחותיים שונים יכול להיקבע ישירות על ידי מיקרוסקופ באמצעות ovules זה נוקו עם שותפה עסקית של פתרון^6,7. כזה ovules התערוכה של השבירה הגבוה במדד; לכן, זה ביצית ניקוי בשיטה הוא מועיל במיוחד דגימות שאינן יש להקפיד על ידי מיקרוסקופ ניגודיות (DIC) התערבות דיפרנציאלית.

בנוסף, הגנים מבוטאים לתא מסוים או במספר מצומצם של תאים במהלך מופרה יכול לשמש סמנים לזיהוי תאי העובר. לכן, יכול להיות מבואר המפרט זהות תא במהלך מופרה על-ידי ניטור הביטוי של חלבונים מתויג GFP סמן באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. לעומת זאת, התבוננות למשמעות הביטוי גן פונקציונלי unknown -GFP פיוז'ן במהלך מופרה יכול מספקים קישור בין העובר המתבנת הביטוי של הגן הזה, להקל על זיהוי גנים חדשים הדרושים מופרה ב תודרנית.

השיטה המתוארת כאן יכול לשמש גם כדי לאפיין את פנוטיפ של מוטציה העובר-קטלני, וכדי לקבוע את ההשפעה של הגן המושפעים על מופרה ברמה התאית. יתר על כן, בשילוב עם השוואה של התבנית ביטוי של גנים סמן במהלך מופרה בין הצמחים פראי-סוג של מוטציה, השיטה ניתן תשואות רמזים אודות המנגנונים המולקולריים המעורבים מופרה^8,9. אכן, השיטה היה מוחל על צמחים naa10 , התברר כי החלוקה לא נורמלי של hypophysis ב החשבונאי שעלול להיגרם שינוי בחלוקת אוקסין במהלך מופרה⁵.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה יש שלושה חלקים: 1) התבוננות היווצרות תבנית בפראי-סוג תודרנית עוברי באמצעות מיקרוסקופ DIC; 2) אפיון של העובר דפוס היווצרות דרך התבוננות סמן ביטוי חלבון באמצעות לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ; ו 3) קביעת התפקיד של גן מסוים ב מופרה (באמצעות המוטציה naa10 בתור דוגמה).

1. ביצית סליקה

1. הכנת חומרים צמח
   הערה: פרוטוקול המתואר כאן הוא דוגמה על איך לגדל צמחים בריאים; דרכים אחרות כדי לגדל צמחים בריאים גם לעבוד.
   1. להוסיף זרעים 100 צינור 1.5 mL, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 1.5% נתרן תת-כלורי (mix 15 מ"ל של 10% כלור עם 85 מ ל מים) כדי לחטא הזרעים במשך 5 דק ' היפוך ' ברכבת התחתית מספר פעמים כדי להבטיח כי הזרעים ואת הפתרון מעורבב היטב כדי לחטא את הזרעים משטח לחלוטין.
   2. לכפות את הזרעים לתחתית הצינור על ידי צנטריפוגה ב-30 s-g 1,200 x, להסיר את תגובת שיקוע, ולשטוף את הזרעים במים סטריליים ארבע פעמים על ספסל כדי להסיר שאריות נתרן תת-כלורי.
   3. להוסיף 4.4 g של Murashige ו- Skoog (MS) תערובת מלח הבזליים ו- 10 גר' סוכרוז 1 ליטר של מים הנדסה גנטית. מערבבים את התערובת כדי להמיס את מלחי וסוכרוז. להתאים את פתרון ה-pH 5.8 עם 1 מ' KOH, להוסיף דור 3 של הסוכן ג'לי, כגון Phytagel, הפתרון MS-סוכרוז, לעקר את הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות להפוך MS בינוני.
   4. יוצקים 30 מ של המדיום MS לתוך תבשיל תרבות 12 ס מ כדי ליצור לוחות בינוני MS.
   5. מקם את הזרעים סטיריליים בצלחת MS. להעביר את הצלחת אל. התא צמיחה ולשמור את הצלחת בתנאים היום (22 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות האור, 18 ° C עבור 8 שעות בחושך) לאחר ריבוד זרע (3 ימים ב 4 ° C בחושך).
   6. לאחר 8 ימים של צמיחה, להעביר את הצמחים בקרקע (תערובת אדמה עשירות, ורמיקוליט ביחס של 1:1) מגש, מכסים את המגש עם מכסה לבן, שקוף 5 ימים למנוע אובדן מים, יש מספיק כדי להימנע ויטריפיקציה של הצמחים.
   7. הרם את המכסה המגש ולטפח את הצמחים בתוך תא ותא בתנאים יום ארוך (ראה 1.1.5). להדליק את האור בשעה 6 בבוקר לסירוגין בשעה 10 בערב. לאחר כ 20 ימים של גידול תא ותא, הצמחים פרחונית, המיוצר siliques.
   8. מארק פקעי עם חוט במיקום של הזרע עוקב אחרי ב התפרחת בשעה 8 בערב (אל תשתמש הראשון עד השלישי פקעי; siliques שנוצר מתוך אלה פרוח ניצנים בדרך כלל לפתח כמה זרעים מופלים, ואת זה עשוי לשנות את הפרופורציה של הנורמה כדי ovules לא תקין). הגדר תחילתו של האבקת להפרייה כמו ניצן מסומן נפתח פרח בשעה 8:00 בבוקר למחרת.
2. הכנה של הפתרון של שותפה עסקית
   1. להוסיף 24 גר' קלוראל-הידרייט שפופרת 50-mL, לעטוף את הצינור לחלוטין עם רדיד אלומיניום (פתרונות של קלוראל-הידרייט אינם יציבים תחת אור).
   2. בשלב הבא, להוסיף 9 מ של מים הנדסה גנטית ו- 3 מ"ל של גליצרול הפתרון ומנערים את הצינור כדי להמיס את קלוראל-הידרייט. כדי להפוך את הפתרון של שותפה עסקית, תן את הצינור לעמוד במשך הלילה בטמפרטורת החדר לחסל בועות.
3. סיווג והגליונות ביצית
   1. צרף פיסת סקוטש דו צדדי לשקופית זכוכית מיקרוסקופ. המקום של silique גדל במשך מספר ימים לאחר ההאבקה (DAP) על השקופית עם pseudoseptum בניצב למשטח; הרצוי זה יהיה קל. לפצל את carpels (דמויות 1A ו 1B).
   2. לפצל את carpels משני צידי pseudoseptum עם מחט מזרק ולצרף את carpels גזור שני לשקופית, כך ovules, silique גלויים תחת סטריאוסקופ (דמויות 1C וד' 1).
   3. לוותר על µL 70 בפתרון של שותפה עסקית על גבי השקופית זכוכית ולאחר מכן להרטיב את קצה זוג מלקחיים שקצהו בסדר עם הפתרון של שותפה עסקית על ידי טבילה. באמצעות את סטריאוסקופ, להזיז את ovules לתוך הפתרון של שותפה עסקית בשקופית עם הפינצטה לנקות את העוברים. להחיל את coverslip של השקופית בעדינות כדי למנוע יצירת בועות.
   4. לשים את השקופית סיים לתוך תיבת בחדר חשוך עבור h 2-12 (מפותח יותר ביצית הוא, יהיה צורך זמן רב יותר) בטמפרטורת החדר. יכול להיות שנצפו העוברים בשלב 2/4 תאים (1-2 DAP) ברמה המיקרוסקופית לאחר 2 h, בעוד העוברים בין octant לבין בשלבים המוקדמים הכדוריים (3 DAP) יכול להיות שנצפו לאחר 4 שעות. יכול להיות שנצפו עוברי בוגרים יותר (4-8 DAP) לאחר 12 שעות.
   5. לבחון את ovules שנוקה באמצעות הפונקציה DIC של מיקרוסקופ. לאתר את העוברים תחת שדה צריכת חשמל נמוכה (10 X) ולאחר מכן שנה לשדה ובעוצמת (100 X שמן טבילה עדשה) כדי לבחון את דפוס הסלולר של העוברים מפותחת.
   6. לבחון את העוברים בשלבים התפתחותיים שונים.

2. אפיון של העובר המתבנת וזהות התא באמצעות התבוננות סמן ביטוי חלבון

1. הכנה של חומרים צמח
   1. שיבוט האמרגן וקידוד רצף של סמן גנטי או הורמון התגובה יסוד, ואז הפתיל זה עם חלבון פלואורסצנטי (כגון GFP); לאחר מכן, הכנס הבונה הווקטור בינארי (כגון pCambia1300). כאן, הרכיב התגובה אוקסין DR5 מוצג בדוגמה¹⁰.
   2. להציג את פלסמיד DR5-GFP שנוצר לתוך פראי-סוג הצמחים מאת Agrobacterium tumefaciens-מתווכת טרנספורמציה¹¹. בחר את הצמחים T1 באמצעות MS צלחות בינוניות המכילים hygromycin (50 מ"ג/מ"ל של אמא ליקר, מדולל 1:1, 000). הצמחים הטרנסגניים התערוכה שורשים ארוכים וצור שני עלים רוזט לאחר 8 ימים של גידול בתנאים המתוארים 1.1.5.
   3. להעביר את הצמחים הטרנסגניים אדמה ולטפח אותם כמצוין 1.1.6 ו 1.1.7.
   4. לאסוף את הזרעים T2 הקווים T1 עצמאית. לזרוע את הזרעים על צלחות MS-hygromycin, בחר את הצמחים נושאת עותק אחד של ההכנסה DR5-GFP (היחס בין צמחים עמידים צמחים רגישים יהיו בערך 3:1) ולאחר להעביר אותם באדמה.
   5. לטפח את הצמחים T2 כמצוין 1.1.6 ו 1.1.7.
   6. לאסוף את הזרעים T3 הצמחים T2. לזרוע את הזרעים על צלחות MS-hygromycin, בחר את הצמחים הטרנסגניים homozygous (כל הצמחים מקו אחד תערוכת hygromycin ההתנגדות) ולאחר להעביר אותם באדמה.
   7. סמן את ניצני פרחים וצמחים T3 homozygous כפי שמעידה 1.1.8.
2. GFP אות התצפית
   1. מערבבים 3 מ"ל של גליצרול עם 47 מ ל מים הנדסה גנטית כדי ליצור פתרון גליצרול 6%.
   2. צרף פיסת סקוטש דו צדדי לשקופית מיקרוסקופ זכוכית ולתקן silique כפי שמעידה 1.3.1.
   3. לפצל את carpels משני צידי pseudoseptum עם מחט מזרק, לצרף את carpels גזור שני השקופית תחת סטריאוסקופ כפי שמעידה 1.3.2.
   4. לוותר על 30 µL של 6% גליצרול אותן לשקופית זכוכית ומניחים כולן ovules מן carpels גזור לתוך הפתרון באמצעות פינצטה שקצהו פיין. במקום של coverslip על השקופית בעדינות.
   5. כמו המעיל הזרע ואת האנדוספרם של כל ביצית יכול למנוע את ההתבוננות GFP אותות של העובר, לחלץ את העובר להפרייה. הקש על השקופית במהירות ובעדינות כדי הבלטת העובר מתוך ביצית (מפותח יותר ביצית היא, הכוח פחות צריך להיות מוחל על השקופית).
   6. לבחון את השקופית עבור זריחה GFP באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. למצוא את העוברים מבודד תחת שדה צריכת חשמל נמוכה (10 X), להקליט את מיקומם ולאחר מכן לשנות שדה ובעוצמת (100 X שמן טבילה עדשה) כדי לצפות DR5-GFP ביטוי העוברים על-ידי הגדרת מקור האור עירור 488 ננומטר לגילוי של אות ה-GFP.
   7. לזהות את הביטוי GFP העוברים כדי לבחור את שורת T3 מתאימים לצורך ניתוח נוסף.

3. אפיון של העובר דפוס-צורה מוטציה קטלני העובר דרך סיווג ביצית והתבוננות החלבון הסמן: Naa10 כדוגמה

1. העובר המתבנת בצמחים מוטציה naa10
   1. הכנת החומרים צמח כמצוין ב- 1.1.1-1.1.7.
   2. לזהות את naa10^{+ −} צמחים על-ידי ה-PCR באמצעות גנים ספציפיים תחל⁵ולאחר מכן מארק פקעי של לאמילי10^{+ −} צמחים כפי שמעידה 1.1.8.
   3. ביצית אישור לבצע בבדיקה מיקרוסקופית של לאמילי10^{+ −} עוברי כמצוין ב- 1.2, 1.3.
2. סמן חלבון ניתוח באמצעות naa10 עוברי
   1. להשיג מתאימים DR5-GFP הטרנסגניים קווים באמצעות ההליך שמתואר 2.1-2.2.
   2. לחצות קו homozygous DR5-GFP הטרנסגניים עם לאמילי10^{+ −} המפעל להשיג לאמילי10^{/ −} צמחים נמצאים homozygous של דה מרקר פלורסצנטיות GFP הדור F2 (המזוהה על ידי גנים ספציפיים PCR) כדי לאפיין naa10^{+ / −5} ולבחון את האות ה-GFP תחת מיקרוסקופ באמצעות קו DR5-GFP homozygous.
   3. לסמן את ניצני פרחים של לאמילי10^{+ −} צמחים homozygous עבור DR5-GFP כפי שמעידה 2.1.7.
   4. לחפש האות ה-GFP ב עוברי naa10 כי הם homozygous על DR5-GFP כמצוין ב- 2.2.

תוצאות

השיטה המתוארת במאמר זה יכול לשמש כדי להתבונן מופרה ישירות תחת מיקרוסקופ, ביאור המפרט את הזהות תא במהלך מופרה עם סמנים ספציפי לאפיין את התפקיד של גן מסוים במהלך מופרה.

נציג תוצאות הניתוח של העובר תכנים (החל משלב זיגוטה מוארך לבמה מקל ההליכה בוגרת) פראי-סוג תודרנית מוצגים באיור2. לאחר אישור ביצית, העוברים בשלבים התפתחותיים שונים יכולה להיות מאופיינת DIC מיקרוסקופ (איור 2<...

דיון

סיווג ביצית היא שיטה שימושית עבור חלוקת התאים ולהתאושש להערכת המורפולוגיה במהלך מופרה ב תודרנית; בעזרת טכניקה זו, העוברים יכול להיות שנצפו ישירות מתחת DIC מיקרוסקופ^5,12. השלב הקריטי לאישור ביצית היא צעד 1.3.4. הזמן הנדרש לאישור ביצית בשלב 1.3.4 הוא משתנה. העוברים בשלב 2/4 תאים ניתן בבירור לראות לאחר 2 h בפתרון של שותפה עסקית, ואילו הם נראים לא ברור לאחר 12 שעות. לכן, מפותח יותר ביצית הוא, ככל הזמן הנדרש לאישור.

בשלב 2.2.5, לבו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Chloral Hydrate	Sigma	15307
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519
Phytagel	Sigma	P8169
Hygromycin	Roche	10843555001
תא גידול	Percival	CU36L5
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	Zeiss Oberkochen	Zeiss Image M2	מצלמה: AxioCam 506 צבע
סריקת לייזר קונפוקלית מיקרוסקופיה	Zeiss Oberkochen	Zeiss LSM 5	מסננים: BP 495 - 555 ננומטר
סטריאוסקופ	Zeiss Oberkochen	Axio Zoom V16	מצלמה: AxioCam MRc5
אדמה עשירה בחומרים מזינים	KLASMANN, גרמניה
צינור 50 מ"ל	Corning Inc.
צינור 1.5 מ"ל	קורנינג בע"מ
		נתרן היפוכלוריט 10%	מגיב אנליטי
ביתי סוכרוז			מגיב אנליטי ביתי
KOH			מגיב אנליטי ביתי
גליצרול
		תרבית	אספקה ביתית
ורמיקוליט			ציוד ביתי
זכוכית שקופיות			ציוד ביתי
מחט			ציוד ביתי
פינצטה			ציוד ביתי
ספסל			ציוד ביתי