Method Article

שינוי מסוף הגבלת שבירת ניתוח לכימות אורך הטלומרים באמצעות הכלאה ב-ג'ל

DOI:

10.3791/56001

⸱

July 10th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Pathology and Infectious Diseases and Microbiology, University of Pittsburgh, 2University of Pittsburgh Cancer Institute, 3Department of Environmental and Occupational Health, University of Pittsburgh, 4Departments of Psychiatry, Psychology, Behavioral & Community Health Sciences, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, פרוטוקול מפורט לכימות אורך הטלומרים באמצעות ניתוח מסוף שונה מגבלה ניתוח נדון המספק מדידה ישירה ויעילה ישירה של אורך הטלומרים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מקורות התא של DNA עבור כימות אורך הטלומרים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנן מספר טכניקות שונות למדידת אורך הטלומרים, כל אחד עם היתרונות והחסרונות שלהם. הגישה המסורתית, ניתוח הגבלת Telomere (TRF), משתמשת בטכניקת הכלאה של דנ"א לפיה דגימות DNA גנומיות מתעכלות עם אנזימי הגבלה, ומשאירות מאחור את ה- DNA של הטלומרים וחוזרת ל- DNA תת-טלומרי. אלה מופרדים על ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל, הועברו קרום סינון הכלאה בדיקות oligonucleotide שתייגת עם או chemiluminescence או רדיואקטיביות לדמיין שברי הגבלת הטלומרים. גישה זו, תוך צורך כמות גדולה יותר של DNA מאשר טכניקות אחרות כגון PCR, יכול למדוד את התפלגות אורך הטלומרים של אוכלוסייה של תאים ומאפשר מדידה לידי ביטוי קילובזות מוחלטות. כתב יד זה מדגים תהליך הכלאה DNA שונה לקביעת אורך הטלומרים. הדנ"א הגנומי מעוכל לראשונה עם אנזימי הגבלה (שאינם חותכיםטלומרים) ומופרדים על ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל. הג'ל מיובש ואז DNA הוא denatured ו הכלאה באתרם כדי בדיקה oligonucleotide radiolabeled. זה הכלאה באתרה נמנע אובדן של הטלומרים DNA ומשפר את עוצמת האות. בעקבות הכלאה, ג 'לים הם צילמו ניצול מסכי זרחן אורך הטלומרים הוא לכמת באמצעות תוכנית גרפים. הליך זה פותח על ידי מעבדות של ד"ר. וודרינג רייט וג 'רי שי באוניברסיטת טקסס דרום מערב 1 , 2 . כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של הליך זה, עם כמה שינויים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomeres, הממוקם בקצה של כרומוזומים, הם חוזרים על נוקליאוטידים של רצף TTAGGG (על כרומוזומים אנושיים) אשר ממלאים תפקיד קריטי בהגנה על מידע גנטי סלולרי 3 , 4 , 5 . Telomeres כמה אלפי זוגות בסיס באורך לשמש להגנה על שלמות שאר הכרומוזום במהלך שכפול ה- DNA. שכפול של כרומוזומים אינו מושלם וכתוצאה מכך הקצוות של הכרומוזום לא מועתקים לחלוטין. חוסר יעילות זה בשכפול נקרא "בעיית שכפול הסיום" ומביא לאובדן של חלק חוזר הטלומרים במהלך כל סיבוב של שכפול 6 , 7 . אורך הטלומרים ניתן לשחזר לאחר חלוקת התא על ידי telomerase, אנזים המחליף את רצף הטלומרים לאיבוד 8 , 9 . Telomerase, לעומת זאת, לאהמופעלים ברוב התאים הסומטיים האנושיים וכתוצאה מכך, לאורך זמן, הטלומרים יתקצרו, ובסופו של דבר יוביל לזרימה התאית 10 . בשל קיצור הטלומרים, טלומרים נחשבים ביומרקר של הזדקנות הסיכון למחלות הקשורות לגיל 11 , 12 . בנוסף, אורך הטלומרים יכול להיות מושפע מגורמים גנטיים, סביבתיים וסגנון חיים וגירויים אחרים כגון מתח חמצוני, דבר המעיד על כך שאורך הטלומרים יכול למלא תפקיד כסימן ביולוגי במחקרים טוקסיקולוגיים, אפידמיולוגיים והתנהגותיים 13 , 14 , 15 .

מאמר זה מדגים טכניקה למדידת אורך הטלומרים באמצעות שינוי מגבלה מסוף שונה (TRF) ניתוח מותאם מ Mender ו שי 2 ו Kimura et al. 16 , ודומה להרברט, שי וריגHt 1 ו האוסמן ו Mauck 17 . באופן מסורתי, ניתוח TRF כרוך הליך דרום כתם. כתמי הדרום נחשבים ל"סטנדרט הזהב "ללימוד אורך הטלומרים ומשמשים באופן פעיל לבדיקת אורך הטלומרים של הלייקוציטים במחקרים באפידמיולוגיה 18 . זה ניתוח TRF משתמש בדנ"א גנומי מתעכל משאיר מאחור את החזרות הטלומרים. שברי ה- DNA מופרדים אז על ידי ג'ל אלקטרופורזה, מפוגל ומועבר קרום nitrocellulose. רצפים הטלומרים הם הכלאה כדי בדיקה oligonucleotide הטלומרים. במקום להעביר את הטלומרים מופרדים קרום, טכניקות אחרות TRF להשתמש בטכניקות הכלאה ג'ל עם וללא denaturation של ה- DNA. הכללת denaturation חשוב כאשר שוקלים זיהוי של טלומרים interstitial, אשר דווחו במינים מסוימים 19 . נהלים ללא צעדים denaturing רק לזהות thE חד גדילי דנ"א נטוש ב Telomeres סופני ולא יחברו interstitial הטלומרים sequences 18 .

מלבד ניתוח TRF, ישנן מספר טכניקות אחרות למדידת אורך הטלומרים שלכל אחד מהם יש יתרונות וחסרונות. טכניקת זרימה- FISH יכול למדוד אורך הטלומרים הממוצע של תאים בודדים של סוג תא ייחודי באמצעות cytometry זרימה 16 , 20 . למרות שהוא יכול לתג את הטלומרים במדויק עם בדיקות ספציפיות מאוד ולהפחית את השגיאה האנושית באמצעות אוטומציה, Flow-Fish הוא יקר, פחות יעיל דורש דגימות טריות טכנאי מיומן מאוד, הגבלת יכולתו ללימודי אפידמיולוגיה 16 . בנוסף, שיטה זו אינה אחראית לשינויים אפשריים במספר הכרומוזומים באוכלוסיית התאים. טכניקה נוספת, qPCR, מקובלת באופן נרחב כאמצעי למדידת אורך הטלומרים למחקרים אפידמיולוגיים 16 בשל תפוקה גבוהה, בעלות נמוכה הדרישה עבור כמויות קטנות של DNA בהשוואה לשיטות אחרות. עם זאת, qPCR יכול רק למדוד תוכן DNA הממוצע הטלומרי יחסית לגן עותק יחיד הוא, ולכן, הערכה עקיפה של אורך הטלומרים הממוצע. כמו כן, היא מניבה מקדם השתנות גבוה במחקרי השוואה, בהשוואה לכתמים דרומיים, המביאים לדיוק מפוקפק 21 .

הליך TRF יש ליקויים משלה כי להגביל את השימוש שלה עבור כמה מחקרים. טכניקות TRF דורשות כמות גדולה של DNA בהשוואה לשיטות אחרות (בין 2 ל -3 מיקרוגרם לכל מדגם). זה מגביל את היישומים של הטכניקה לבדיקת אורך הטלומרים של דגימות קליניות שעבורן ניתן לאסוף דנ"א גנומי מספיק, ואי אפשר להשתמש בהן על דגימות DNA נמוכות. בנוסף, ניתוח TRF הוא יקר ועבודה אינטנסיבית, הדורש 4-5 ימים כדי להניב תוצאות. עם זאת, TRF מניב מקדם נמוך של שונותמתן reproducibility שלה. בעוד פרוטוקול זה שונה מאשר הכתם הדרומי המסורתי (תוך ניצול הכלאה ג'ל באתרה ), שתי טכניקות ביסודו זהה.

הטכניקה המוצגת כאן היא שילוב של כתם דרום הכלאה ג'ל; שיוך שלב denaturing DNA מ כתמי דרום עם הכלאה ב-ג'ל. שילוב זה יש את היתרון הנוסף של שיפור כוח האות בדיקה לעומת הכתם הדרומי יש הניבה באופן עקבי תוצאות לכימות בתוך המעבדה שלנו. בנוסף, השימוש בדיקות רדיואקטיביות ולא בדיקות chemiluminescent התשואות עוצמת האות גבוהה יותר מאפשר הדמיה וכימות עם phosphorimager, מה שהופך את הניתוחים של TRF ידידותי למשתמש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. גנומי DNA לחלץ

  1. לבצע מיצוי דנ"א גנומי מן התאים (כאן, קו התא BJ-hTERT) כדי להיות מנותח באמצעות ערכת מיצוי דנ"א מסחרי, על פי הוראות היצרן.
  2. למדוד את ריכוז ה- DNA עם ספקטרופוטומטר. אם ריכוז ה- DNA הוא פחות מ -100 מיקרוגרם / מ"ל, להאיץ את ה- DNA עם אתנול ו resuspend בנפח של TE חיץ (10 מ"מ טריס-קל, 0.1 מ"מ EDTA (חומצה ethylenediaminetetraacetic), pH 8.0), כדי להבטיח ריכוז DNA של 100-600 מיקרוגרם / מ"ל).

2. הערכת ה- DNA שלמות

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מתאר הערכה שלמות DNA באמצעות מערכת ג'ל אלקטרופורזה עם ג'ל 11 ס"מ x 14 ס"מ. מערכות אחרות וגדלים ג 'ל ניתן להשתמש גם, אבל המתח והזמן הגירה DNA עשוי להשתנות.

  1. הכן 1% agarose ג'ל על ידי שילוב של 1 גרם של agarose בכיתה אלקטרופורזה ב 100 מ"ל של חיץ TAE 1x (40 mM Trבסיס; 20 מ"מ חומצה אצטית; 2 מ"מ EDTA; PH 8.5) ו מיקרוגל עד agarose הוא מומס ואת הפתרון ברור. מגניב הפתרון בטמפרטורת החדר עד שהוא מגיע 50 מעלות צלזיוס (כ 15 - 20 דקות).
  2. בעוד פתרון agarose הוא קירור, להכין מגש הליהוק ג'ל ידי הוספת הליהוק בסוף השערים למגש הליהוק. כדי למנוע דליפה agarose, לצנן את השערים בסוף עד 4 מעלות צלזיוס לפני הצמדת למגש הליהוק.
  3. לאחר פתרון agarose התקרר ל 50 מעלות צלזיוס, להוסיף 10 μL של ethidium bromide (10 מ"ג / מ"ל ​​ב DH 2 O) ויוצקים את הפתרון agarose לתוך מגש הליהוק ג'ל. הוסף את המסרק למגש הליהוק.
  4. אפשר פתרון agarose להקשות במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הכנת דגימות DNA עבור אלקטרופורזה על ידי דילול 25 ng של דנ"א גנומי באמצעות חיץ 1x TE לנפח סופי של 9 μL ולהוסיף 1 μL של 10x Loading Dye (0.25% (w / v) כחול bromophenol, 0.25% (w / v) xylene Cyanol FF, 30% (v / v) גליצרול). לערבב היטב.
  6. הכן את מערכת ג 'ל אלקטרופורזה עבור הגירה דנ"א על ​​ידי מילוי מערכת אלקטרופורזה עם חיץ 1X TAE כך רמת החיץ הוא כמה מילימטרים מעל הג' ל. טען את הבארות של ג 'ל עם מכלול דגימות DNA. הוסף 5 μL של סולם ה- DNA לבאר אחת.
  7. הפעל את הגירה דנ"א ב 100 V בערך 2 שעות או עד צבע bromophenol כחול הוא כחצי הדרך דרך הג'ל.
  8. תמונה ג'ל באמצעות transilluminator אור אולטרה סגול או שווה ערך.
    הערה: דגימות DNA עם יושר טוב יש להקות משקל מולקולרי גבוה ללא מריחה (כי בשל דנ"א שבור או שבור). אם להקות ה- DNA מרוחות, יש להן שלמות נמוכה ואינן מתאימות לניתוח כתמי דרום, ויש לבודד מחדש את הדנ"א בתאים טריים.

3. גנומי DNA העיכול

  1. בצע את העיכול של ה- DNA הגנומי בנפח סופי של μL 20-40.
    הערה: כרכים גדולים יותרמ 40 μL יהיה על גדות הבארות של ג'ל agarose.
    1. שלב 3 מיקרוגרם של DNA גנומי ואת הכמות המתאימה של חיץ digest 10x DNA (מסופק עם אנזימים הגבלה) כך הריכוז הסופי הוא 1x, microtube. הוסף 1 μL של אנזים RSAI הגבלה (10,000 U / mL) ו 1 μL של אנזים הגבלת HinfI (10,000 U / mL) לכל צינור. התאם את עוצמת הקול הסופי באמצעות סטרילי, deionized H 2 O. מערבבים היטב. צנטריפוגה בקצרה (10 - 15 s ב 16,000 xg) כדי להבטיח כי כל הרכיבים נמצאים בתחתית הצינור.
  2. דגירה העיכול על 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. לאחר העיכול, לאחסן את ה- DNA מתעכל ב 4 מעלות צלזיוס או -20 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2 ימים אם יש צורך 17 .

4. גנומי דנ"א ג'ל אלקטרופורזה

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מתאר הליך לשימוש 20 ס"מ x 25 ס"מ ג'ל אלקטרופורזה המערכת. ג'ל שונהניתן להשתמש במערכות phoresis, אך ייתכן שיהיה צורך לשנות מספר משתנים, כולל מתח, זמן הגירה וכמות החיץ האלקטרופורזה שנוספה למערכת על מנת להניב תוצאות אופטימליות.

  1. הכן פתרון agarose 0.6% על ידי שילוב של 2.25 גרם של agelose כיתה אלקטרופורזה ג'ל עם 375 מ"ל של חיץ אלקטרופורזה, או 1x TAE או 0.5x TBE (110 מ"מ בסיס טריס, 90 מ"מ חומצת בור, 2.5 מ"מ EDTA, pH 8.3).
    הערה: עבור טלומרים פחות מ 8,000 kB, מומלץ 0.5x TBE ואילו 1X TAE מומלץ טלומרים בין 8,000 kB ו 20,000 KB 1 .
  2. מיקרוגל הפתרון עד agarose יש מומס הפתרון הוא ברור. אפשר פתרון לצנן במשך 15 - 20 דקות בטמפרטורת החדר או עד agarose מגיע 50 מעלות צלזיוס.
  3. בעוד הפתרון agarose הוא קירור, להכין את מערכת ג 'ל אלקטרופורזה עבור הליהוק ג' ל כמתואר בשלב 2.2. יוצקים את הפתרון ג'ל agarose לתוך מגש הליהוק ג'ל. הכנס מסרק לתוךהג'ל. אפשר ג 'ל להקשות במשך 45 דקות חשף בטמפרטורת החדר.
  4. הכן את דגימות DNA מתעכל עבור אלקטרופורזה. במשך 40 תגובה UL, להוסיף 0.4 μL של צבע 10x טוען לתוך כל דגימה של DNA מתעכל. צנטריפוגה בקצרה (10-15 s, 16,000 xg) כדי להבטיח כי כל הפתרון הוא בתחתית הצינור.
  5. הכן את מערכת ג 'ל אלקטרופורזה עבור הגירה דנ"א. הסר את השערים סוף מסרק מן הג'ל. ממלאים את מערכת אלקטרופורזה ג'ל עם 1x TAE או 0.5x TBE לקו המילוי, כדי להבטיח כי ג'ל הוא שקוע לחלוטין במאגר.
  6. טען את הבארות של הג'ל עם דגימות DNA כגון שיש גם ריק בין דגימות. הימנע גורם בועות או לנקב את הג'ל. הוסף 10 μL של סולם ה- DNA לתוך בארות על הקצוות הנגדיים של הג'ל.
    הערה: סוג של סולם DNA יהיה תלוי באורך של הטלומרים, אשר ישתנה מאדם לאדם ובין מקורות התא.
  7. הפעל את ג'ל אלקטרופורזה ב 150 V למשך 30 דקות כדי להעביר במהירות את ה- DNA לתוך הג'ל; ואז להתאים את המתח ל 57 V ולהפעיל במשך 18-24 שעות.

5. ג'ל פלואורסצנטי הדמיה והכלאה

  1. לאחר 18-24 שעות, לכבות את מקור הכוח ג'ל אלקטרופורזה. הסר את מגש הליהוק ג'ל עם חיץ מן המאגר אלקטרופורזה. פורסים את הפינה הימנית העליונה של הג'ל לשמש התייחסות לכיוון של הג'ל.
  2. הכינו פיסת נייר סינון על ידי חיתוך הנייר להיות בגודל מעט גדול יותר מאשר ג 'ל. מניחים את נייר הסינון על גבי הג'ל במגש הליהוק ומאפשרים לנייר לספוג פתרון עודף על הג'ל. בזהירות להסיר את בועות אוויר בין נייר הסינון ואת ג'ל באמצעות פיפטה כמו רולר לסחוט את הבועות החוצה דרך הצדדים.
  3. הסר את הג'ל ממגש הליהוק על ידי מרפרף את הג'ל ומסנן נייר מעל כך הנייר מתחת לג'ל. מעבירים את הג'ל עם נייר הסינון למייבש ג'ל ומכסים אתג'ל עם עטיפת פלסטיק. הסר את כל בועות אוויר בין העטיפה פלסטיק ג'ל באמצעות פיפטה כמו רולר.
  4. יבש את הג'ל עבור 2 שעות ב 50 מעלות צלזיוס.
  5. לאחר יבשים, להסיר את העטיפה פלסטיק ולהעביר את הג'ל ומסנן נייר על צלחת זכוכית המכילה 250 מ"ל של מים deionized (מספיק כדי לכסות את הג'ל). בזהירות להסיר את נייר הסינון דגירה ג 'ל בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הג'ל יהיה דק, יציב וקל לתמרן מבלי לקרוע.
  6. הכן פתרון 5x SSC (750 מ"מ NaCl, 75 מ"מ ציטראט ציטראט) במים deionized.
  7. הניחו את הג'ל על גבי רשת ניילון (12 x 12 אינץ '). רול את רשת ניילון וג 'ל יחד לוודא כי הג' ל הוא לא במגע עם עצמו. מניחים את הרשת ואת ג'ל לתוך צינור הכלאה ( למשל , 12 ב צינור עם 1.5 בקוטר).
    הערה: כאשר מגולגל כראוי, הג 'ל יהיה במגע עם רשת ניילון משני הצדדים.
  8. שלב 100 מ"ל של 5x SSC ו 12 μL של גרעיני פלואורסצנטי ירוקCid כתם, ואת המקום לתוך צינור הכלאה. הגן על הפתרון מן האור ו דגירה במשך 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה עם סיבוב.
  9. הסר את רשת ניילון / ג'ל מן צינור הכלאה, לפתוח ולשים שטוח לתוך צלחת זכוכית המכילה 250 מ"ל של מים deionized, בעדינות להסיר רשת ניילון. תמונה ג'ל באמצעות phosphorimager. השתמש בהגדרות פלורסנט: 520 BP, 40 כחול ו 488 ננומטר. הגדרת הצינור מכפיל (PMT) ל 375, את המטוס המוקד ל -3 מ"מ ואת הרגישות לנורמה. שמור את התמונה לקובץ.

6. הכלאה

  1. הכן את בדיקה רדיואקטיבית טלומר.
    1. שלב 2 μL (2 ng) של בדיקה הטלומרים (5- (CCC ת"א) 4 3 '), 2.5 μL של חיץ תגובה polynucleotide kinase 10x, 3 μL של γ 32 P-DATP (6,000 Ci / mmol), 4 μL של T4 Polinucleotide kinase ו DNase חינם, מים סטריליים deionized לנפח הסופי של 20 μL ב micrצינור ocentrifuge.
      זהירות: בצע בטיחות "רדיואקטיבי של מתקני ותקנות בעת שימוש ברדיואקטיביות.
  2. צנטריפוגות בקצרה (10-30 זה ב XG 16,000) ו דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 ח. צנטריפוגה עבור 10-30 s ב XG 16,000 ו דגירה על 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לעצור את התגובה.
  3. באמצעות עמודה כרומטוגרפיה G-25 microspin, לערבב את התוכן של העמודה על ידי vortexing, ואז צנטריפוגה דקות 1 ב 700 xg בטמפרטורת החדר. מחק את תסנין.
  4. טען את הפתרון בדיקה רדיואקטיבית לתוך G-25 טור כרומטוגרפיה צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 700 x גרם. שמור את התסנין.
    הערה: שמרו את התסנין מכיוון שמכיל את בדיקת הטלומרים הרדיואקטיביים. בדיקה רדיואקטיבית ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס במידת הצורך.
  5. הכן 250 מ"ל של פתרון denaturing המורכב 1.5 M NaCl ו 0.5 M NaOH במים סטרילי deionized.
  6. מניחים את הג'ל לתוך צלחת זכוכית המכילה 250 מ"ל של פתרון denaturing ו incubאכל במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הפתרון denaturing ולהחליף עם 250 מ"ל של מים deionized סטרילי. דגירה במשך 10 דקות על שייקר מסלולית (40 - 50 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
  7. הכן 250 מ"ל של תמיסת ניטרול המורכב 1.5 NaCl ו 0.5 M טריס חומצה הידרוכלורית, pH 8.0 במים סטרילי deionized.
  8. הסר את המים deionized ולהחליף פתרון מנטרל 250 מ"ל ו דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. במהלך הדגירה בפתרון ניטרול, להכין 50 מ"ל פתרון הכלאה המורכב 5x SSC, פתרון של 5x Denhardt (0.1% פולימר לא סינתטי יון, 0.1% פוליוויניל pyrrolidine, 0.1% אלבומין בסרום שור), 10 mM פוספט זרחן (Na 2 HPO 4 ) ו 1 מ"מ נתרן pyrophosphate decahydrate tetrabasic (Na 4 P 2 O 7. 10 H 2 O) במים סטרילי deionized.
  10. רול את הג'ל לתוך רשת ניילון ומכניסים לתוך צינור הכלאה (צעד5.7). הוסף 20 מ"ל של הפתרון הכלאה דגירה בתנור הכלאה על 42 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם סיבוב.
  11. הסר את הפתרון הכלאה ולהחליף עם 20 מ"ל של פתרון הכלאה טריים. הוסף את מלוא של בדיקה הטלומרים לדגור בתנור הכלאה על 42 מעלות צלזיוס במשך הלילה עם סיבוב.

7. ג 'ל כביסה, חשיפה מסך זרחן, ורדיו הדמיה

  1. הכן 500 מ"ל של פתרון SSC 2x (300 מ"מ NaCl, 30 מ"ל ציטראט ציטראט) במים סטרילי deionized.
  2. הכן 250 מ"ל של 0.1x SSC (15 מ"ל NaCl, 1.5 מ"מ ציטראט ציטראט) ו 0.1% נתרן Dodecyl סולפט (SDS) במים deionized.
  3. הסר את הג'ל רשת מהצינור הכלאה ומכניסים לתוך צלחת זכוכית המכילה 250 מ"ל של 2x SSC. להתיר ולהסיר את רשת ניילון מן המנה. מניחים את צלחת זכוכית על שייקר מסלולית דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הסר את 2x SSC ולהחליף עם 250 מ"ל של 0.1x SSC ו 01% פתרון SDS, ו דגירה במשך 15 דקות על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר.
  5. במהלך הדגירה, לחשוף את המסך זרחן למחק התמונה במשך 15 דקות.
  6. הסר את 0.1x SSC ו 0.1% פתרון SDS ולהחליף עם 250 מ"ל של 2x SSC. דגירה במשך 15 דקות על שייקר מסלולית.
  7. הסר את הג'ל מ 2x פתרון SSC או לעטוף את הג'ל בניילון נצמד או מקום לתוך שקית חותם sealable. הסר את כל הבועות וכיסי אוויר בין הג'ל לבין העטיפה פלסטיק או שקית פלסטיק. מניחים את הג'ל לתוך קלטת חשיפה עם מסך phopshor. לחשוף את המסך זרחן לג'ל לילה.
  8. תמונה מסך זרחן חשוף באמצעות phosphorimager.

8. Telomere אורך כימות

  1. פתח את הקובץ phosphorimager המכיל את התמונה ניאון של ירוק ניאון חומצה גרעין מוכתם חומצה ( איור 1 ).
  2. בחר 'כלים' ולאחר מכן 'מרחק פיקסל9 ;. באמצעות העכבר, לצייר קו מלמטה של ​​ג 'ל גם באמצע הלהקה סמן הראשון להקליט את המרחק. חזור על הליך זה עבור כל הלהקה סמן ( איור 2 ). מרחקים אלה ישמשו בתכנית הגרפים כמתואר להלן.
  3. פתח את phosphorimage של ג'ל radiolabeled ( איור 3 ). בחר 'מנהל אובייקטים' ולאחר מכן 'רשת'. הגדר את טבלה 1 עד 150 שורות ו -150 שורות. התאם את הרשת כך שהוא מותח מהחלק העליון של הג'ל לתחתית הג'ל. התאם את רוחב הרשת כך שרוחב הנתיב יהיה זהה, לחיצה על קצה הרשת וגרירת רוחב הרשת כך שרוחב הנתיב יהיה זהה.
  4. העתק את הרשת (כך שהגובה והגובה של הקופסאות נותרו ללא שינוי) והזז את הרשת השניה לנתיב ריק (למטרות רקע). המשך להעתיק ולהעביר רשתות נוספות עבור נתיבים לדוגמה נוספים.
    הערה: בסיום, צריך להיותרשתות עבור כל נתיב מדגם רשת אחת של נתיב ריק עבור הרקע ( איור 4 ).
  5. בחר 'ניתוח' ולאחר מכן 'דוח עוצמת קול'. בחר את כל הרשתות עבור הדוח, לאחר הצגת הדוח על עוצמת הקול, לחץ פעמיים על הדוח כדי להפעיל את התוכנית גיליון אלקטרוני שמור את קובץ הגיליון האלקטרוני.הנתונים עבור קובץ זה יהיו תחת הנתיב 'נפח'.
  6. פתח תוכנית גרפים מתאימה וצור נתונים וטבלה חדשים. בחר 'Y: הזן וחתום ערך Y יחיד עבור כל נקודה' ולאחר מכן בחר 'צור'.
  7. תייג את העמודה הראשונה (עמודה X) כ- 'מדידת מרחק' ותווית העמודה השנייה (עמודה Y) כ'משקל מולקולרי '. הזן את משקולות הסמן המולקולרי של כל סמן סמן בעמודה Y. הזן את מרחקי ההעברה שהתקבלו בשלב 8.2 המתאים לכל סמן משקל מולקולרי.
  8. עבור אל 'ניתוח' ובחר 'ניתוח' ולאחר מכן 'regarsi לא לינאריתב (עקומת בכושר) 'ובחר' אישור '. במסך הבא, בחר "מעריכי ולאחר מכן" עששת פאזה אחת ". בחר 'טווח' הכרטיסייה והזן '150' ב 'מספר נקודות להגדיר את עקומת' ולבדוק 'יצירת טבלה של XY קואורדינטות לייצא או להעתיק את עקומה לתוכנית אחרת'.
    הערה: התוצאה, "התאמה לא ליניארית של נתונים 1", מכילה את המשקל המולקולרי עבור כל מרחק בשורה Y.
  9. לניתוח של נתיבי המדגם, בחר אזור ניתוח כי הוא מעל ומתחת להקות הטלומרים בפועל. אל תשתמש בכל אורך הנתיב ( איור 5 ). לקבוע את מיקומי הרשת עבור אזור ניתוח של כל נתיב.
  10. בחר 'קובץ', 'חדש' 'צור טבלה חדשה וגרף'. בחר 'Y: הזן וחתום ערך Y יחיד עבור כל נקודה' ולאחר מכן בחר 'צור'. העתק והדבק את ערכי עוצמת הקול של נתיב הרקע (ערכי עוצמת) מקובץ הגיליון האלקטרונילתוך העמודה הראשונה (X) ואת ערכי עוצמת הקול (ערכי עוצמת) מן הנתיב לדוגמה לתוך העמודה הראשונה Y. אם יש נתיבים מדגם מרובים, להעתיק כל קבוצה של ערכי עוצמת הקול מקובץ גיליון אלקטרוני לתוך עמודות Y נוספים בתוכנית גרפים קוֹבֶץ.
  11. מחק את הערכים מעמוד הרקע (X) וכל נתיב לדוגמה (Y) הנמצאים מחוץ לתחומי הניתוח שנקבעו בשלב 8.8.
    הערה: טבלת הנתונים צריכה להכיל רק ערכים באותם מיקומי רשת המתאימים לתחומי הניתוח.
  12. בחר ניתוח ולאחר מכן 'נתח' ו'שנה '. לחץ על 'אישור'. בחר 'המרה Y ערכים באמצעות Y = YX'. זה יהפוך את הנתונים נתונים 2 (ערך עוצמת המרה (Y) = עוצמת הדגימה (Y) - עוצמת הרקע (X)).
    1. בחר ניתוח ולאחר מכן 'ניתוח', 'ניתוח עמודות' ו'סטטיסטיקות עמודות '. בחר אישור. הכרטיסייה תוצאות 'Col. נתונים סטטיסטיים של המרה של נתונים 2 'מראהתחת השורה 'סכום', Σ (Int i ).
  13. בחר 'קובץ', 'חדש', 'צור טבלה חדשה וגרף'. בחר 'Y: הזן וחתום ערך Y יחיד עבור כל נקודה' ולאחר מכן בחר 'צור'. העתק והדבק את נתוני העמודה Y מתוך דף התוצאות 'nonlin fit of Data 1, Curve' בעמודה X החדשה. העתק והדבק את נתוני העמודה Y מתוך דף התוצאות 'המרה של נתונים 2' בעמודה Y החדשה. בחר ניתוח ואז 'ניתוח' ו 'המרה'. לחץ על 'אישור'. בחר 'המרה ערכים Y באמצעות Y = Y / X'.
    1. בחר ניתוח ולאחר מכן 'ניתוח', 'ניתוח עמודות' ו'סטטיסטיקות עמודות '. בחר אישור. הכרטיסייה תוצאות 'Col. נתונים סטטיסטיים של טרנספורמציה של נתונים 3 'מוצגים תחת השורה' סכום ', Σ (Int i / MW i ). MW = משקל מולקולרי.
  14. כדי לחשב את אורך הטלומרים הממוצע (TL) עבור כל מדגם, השתמשנוסחה TL = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלושה ריכוזים של דנ"א (1, 2 ו -3 מיקרוגרם) מבודדים מקו התא BJ-hTERT (telomerase הנצחית fibroblasts עורית) 22 ו דם אנושיים היקפיים דם monopuclear (PBMCs) נותחו עבור אורך הטלומרים. טבלה 1 מציגה את הקצאות הנתיב עבור כל דגימת DNA. איור 1 מציג חומצה גרעין ניאון פלואורסצנטי של הג'ל. תקני המשקל המולקולרי נראים בבירור. המרחק מהחלק העליון של הג'ל לכל תקן משקל מולקולרי נקבע (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות אלקטרופורזה, כתם ה- DNA הגנומי גבוה מ -800 bp. זה יכול להתרחש אם אנזימים הגבלה הם פגומים או אם אנזימים נוספים (כמתואר לעיל) נדרשים. הסבר אפשרי נוסף הוא שהחלבון עדיין מחובר לדנ"א. בעת קביעת ריכוז ה- DNA על ידי ספקטרופוטומטר, יחס 260/280 צריך להיות סביב 1.8. אם יחס זה הוא <1.5, יש זיהום חלבון אשר יכול להפריע הגבלת אנזים אכול. או דגימת DNA היה צריך להיות מבודדים מחדש, או חלבון יצטרך להסיר עם עיכול proteinase K ופנול: מיצוי כלורופורם ואחריו משקעים אתנול. השימוש בערכת בי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מאשרים את התמיכה של אוניברסיטת פיטסבורג סרטן המכון Biobehavioral אונקולוגיה משותפת במתקן הנתמך בחלקו על ידי פרס P30CA047904.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Biologics
Rsa1, אנזים הגבלהNew England Biolabs, IncR0167S10,000 U/mL, עיכול DNA.  מגיע עם Cutsmart Buffer (מאגר עיכול)
Hinf1, אנזים הגבלהNew England Biolabs, IncR0155S10,000 U/mL, עיכול DNA. מגיע עם Cutsmart Buffer (מאגר עיכול)
Seakem GTG AgaroseLonza50071אלקטרופורזה בדרגת
אגרוז אופטיקינאז affymetrix78334X 500 UNT4 פולינוקלאוטיד קינאז
SYBR כתם חומצת גרעין ירוקה IThermoFisher ScientificS7567Syber Green
exactGene DNA Ladder 24- kBFisher ScientificBP2580100
C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5)טכנולוגיותבהזמנה אישית DNA אוליגונוקלאוטיד
Gamma-ATP-P32Perkin ElmerBLU502Zרדיואיזוטופ
Qiagen תרבית דם ותאים DNA מיני ערכתQiagen13323ערכת מיצוי DNA
GE Illustra Microspin G-25 עמודהGE Healthcare Life Sciences27-5325-01לטיהור בדיקת אוליגו קרידיואקטיבית
Ficoll 400פולימר סינטטי לא יוני
<חזק>ציוד/תוכנה
מערכת אלקטרופורזה ג'ל ינשוף A5 (20 ס"מ x 25 ס"מ)ThermoFisher ScientificA5ג'ל אלקטרופורזה
Horizon 11.4 מערכת אלקטרופורזה ג'ל (11 ס"מ x 14 ס"מ)Corel Life Sciences11068020אלקטרופורזה ג'ל
רשת ניילון, 50, 12 אינץ' x 12 אינץ'Ted Pellam, Inc41-12105
GE Storage מסכי זרחן GEHealthcare מדעי החיים28-9564-75
קלטת חשיפה למסך זרחןGE Healthcare מדעי החיים63-0035-44
חממת הכלאה איזוטמפיתפישר סיינטיפיק13-247-20Q
צינורות הכלאה גלילייםפישר סיינטיפיק13-247-300
שייקר המסלול של רקדנית הבטןסיגמא-אולדריץ'Z768499-1EAשייקר אורביטלי
טייפון 9400ABIלהדמיית ג'לים ומסכי זרחן
GraphPad Prism 6GraphPadגרסה 6.05תוכנית גרפים
Microsoft ExcelMicrosoftOffice 365תוכנית גיליון אלקטרוני
NanodropThermo ScientificNanodrp 2000ספקטרופוטומטר
DNA משולבות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16(2003).
  2. Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
  3. Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
  4. Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
  5. Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
  6. Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
  7. Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. Telomeres-Structure, Function, and Regulation. Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).
  8. MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64(2016).
  9. Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).
  10. Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
  11. Opresko, P. L., Shay, J. W. Telomere-Associated Aging Disorders. Ageing Res Rev. , Epub ahead of print 1568-1637 (2016).
  12. Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
  13. Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
  14. Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
  15. Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. Telomeres in Molecular Epidemiology Studies. Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).
  16. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  17. Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
  18. Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
  19. Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
  20. Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
  21. Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
  22. Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telomere LengthTerminal Restriction FragmentIn Gel HybridizationAgarose Gel ElectrophoresisGenomic DNA DigestionTelomere ProbePhosphor ImagingDNA LadderHybridization OvenPeripheral Blood Mononuclear

Related Articles