מאמר שיטה

התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

DOI:

10.3791/56003

⸱

27 בנובמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama, 2College of Medicine, University of South Alabama, 3Institute for Regenerative Medicine, University of Zurich, 4Department of Dermatology, University Hospital Zurich, 5Center for Applied Biotechnology and Molecular Medicine (CABMM), University of Zurich - Irchel Campus

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את התכנות של ראשי מי השפיר נוזל לבין הממברנה בתאי גזע mesenchymal לתוך תאי גזע pluripotent המושרה באמצעות גישה episomal-שילוב בתנאים מוגדרים לחלוטין מבחינה כימית. תהליכי מיצוי, תרבות, התכנות, ואפיון של תאי גזע pluripotent המושרה הנוצרת על ידי שיטות מחמירים מפורטים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפולים מבוססי תאים עצמיים יש צעד אחד קדימה למציאות עם כניסתה של גזע pluripotent המושרה. תאי גזע עובריים, כגון מי שפיר והממברנה בתאי גזע mesenchymal, מייצגים סוג ייחודי של תאים מובחן עם הבטחה הנדסת רקמות, עבור התכנות לתוך iPSC התערבויות רפואת העתיד, תאי גזע, בנקאות. פרוטוקול המובאת כאן מתאר הליך בלתי אופטימליים עבור חילוץ ו culturing ראשי מי השפיר נוזל לבין הממברנה בתאי גזע mesenchymal, הפקת episomal המושרה בתאי גזע pluripotent של תאים אלה בתרבות מוגדרים לחלוטין מבחינה כימית תנאים ניצול אנושי vitronectin רקומביננטי והמדיום E8. אפיון של הקווים החדשים על-ידי החלת שיטות מחמירים – cytometry זרימה, הדמיה קונאפוקלית, טרטומה היווצרות ו פרופיל תעתיק – גם מתואר. הקווים החדש שנוצר אקספרס סמנים של תאי גזע עובריים – Oct3/4A, Nanog, Sox2, טרה-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – בעת היותו שלילי עבור דה מרקר SSEA-1. הקווים תאי גזע טופס teratomas בעכברים scid-בז ' ב- 6-8 שבועות ומכילים teratomas רקמות נציג של כל שלוש שכבות הנבט. פרופיל תעתיק של הקווים על ידי הגשת נתונים microarray ביטוי הכללית באלגוריתם הערכה pluripotency bioinformatic ייחשב כל קווי pluripotent, לכן, גישה זו היא חלופה אטרקטיבית לניסויים בבעלי חיים. הקווים iPSC החדש יכול לשמש בקלות בניסויים במורד הזרם מעורבים אופטימיזציה של בידול והנדסת רקמות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכנולוגיה של תאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) מביא על פוטנציאל התא החלפת טיפולים, מחלות, מודלים התפתחותיים, ואת סמים ההקרנה רעילות1,2,3. החלפת טיפולים מושגית יכולה להיות מושגת על ידי הזרקת תא, הפריה הבדיל השרשה רקמות (כגון תיקוני הלב), או מודרכת התחדשות של הנדסת רקמות. מי שפיר (AFSC), קרום תאי גזע (AMSC) הם מקור מצוין של תאים עבור התערבויות אלה גם ישירות4,5,6,7 או כאוכלוסייה התא ההתחלתי עבור התכנות לתוך pluripotency8,9,10,11,12.

גישות מוקדם בשימוש מערכות התרבות לא מוגדר או התכנות בפעולות שירות הדורשות אינטגרציה הגנומי קשור בתזמון של בונה9,10,11,12. מחקר עדכני יותר מועסקים מדיום קסנו-חופשית, אף-על-פי מטריצה מצורף קרום המרתף פחות מוגדר (BMM) שימש, כדי ליצור iPSC מתאי אפיתל נוזל מי השפיר. עם זאת, וזמינותו היווצרות טרטומה שאינו נכלל את המחקר יחד עם שפע של הפריה הנתונים המולקולריים. נמצאו תאים אפיתל נוזל מי השפיר יש בערך 8-fold יעילות גבוהה יותר התיכנות בהשוואה neonatal fibroblasts13. במחקר אחר, גזע mesenchymal של נוזל מי השפיר נמצאו גם כדי לתכנת לתוך iPSC עם הרבה יותר יעילות12.

גזע pluripotent יכול להיות מובחן רקמות נציגם של כל שכבות הנבט 3, ולכן יש את הפוטנציאל הרחב ביותר. ילדים יכולים להרוויח מן קציר, התכנות, הנדסת רקמות של שלהם תאי גזע של נוזל מי השפיר עצמיים prenatally, קרום מי השפיר גזע תאים perinatally. יתר על כן, הנמוכות יחסית של ההתמיינות של תאי גזע עובריים (נמוך יותר מאשר14,תאי גזע בוגרים15) יכול לסייע באופן תיאורטי בהתייחסות השמירה שנצפו של epigenetic הטיה מתאי המקור iPSC16.

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור התכנות השפיר, קרום תאי גזע כדי pluripotency ב מוגדרים כימי בינוני E8 קסנו-חופשית vitronectin רקומביננטי17 . עולמיים בנויים (. לצרכיך המדויקים) בעזרת פלסמידים episomal18. היתרון העיקרי של נוזל מי השפיר ותאי ממברנה כמקור של תאים עבור התכנות טמון זמינותם מראש, perinatally ובכך גישה זו בעיקר ירוויחו מחקר לתוך הנדסת רקמות לילדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מנחים המוסדי של ועדת האתיקה למחקר אנושי. הסכמה בכתב של המטופל הושג באמצעות השפיר למחקר.

פרוטוקול זה מלווה את מדיניות ראש הוועדה אכפת לי חיה מוסדיים שימוש של אוניברסיטת דרום אלבמה.

1. בידוד והתרבות של ראשי מי השפיר בתאי גזע Mesenchymal

  1. ציפוי של תאים נוזל מי השפיר
    1. להשיג מינימום של 2.5 מ של נוזל מי השפיר שנקטפו בתהליך בדיקת מי שפיר על ידי רופא.
      הערה: כל טיפול של תאים חיים ורקמות חייב להתבצע ב- cabinet רקמות סטריליים-תרבות, ציוד מגן אישי מתאים צריך לשמש. היכרות עם התרבות התא הבסיסי סטרילי טכניקה זו נדרשת.
    2. להכין מי השפיר נוזל לבין קרום התא (AFMC) תרבות המדיום: בינוני הבזליים EBM-2, 15% סרום שור עוברית (FBS), 20 ng/mL של bFGF, 25 ננוגרם למ"ל של EGF, 10 ננוגרם למ"ל של IGF. תרבות של תאי גזע ראשי קרום מי השפיר נוזלים, כמו גם מי השפיר, המדיום להשלימה בעזרת פתרון אנטיביוטיקה-antimycotic.
    3. ביום 0, מערבבים 2.5 מ של נוזל מי השפיר עם 3.5 מ של AFMC תרבות בינוני וצלחת לתוך בקבוקון T25. דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור הפרעה לפני בדיקת נוכחות של מושבות לפחות 48 שעות.
    4. יום 5, מושבות תאים חסיד צריך להיות נוכח. רוק בעדינות את הבקבוק מכך שהתאים לא לגמרי לדבוק התחתון ופסולת, ואקום-לשאוב התערובת בילה נוזל מי השפיר/בינונית בעזרת פיפטה של פסטר. החלף 5 מ של טרי AFMC בינונית.
    5. תרבות עוד 5 ימים. לשנות בינוני בכל יום כפי שמתואר בשלב 1.1.4.
  2. בידוד של גזע mesenchymal העיקרי של האדם השפיר
    1. להשיג מאחד לשני במהירות האפשרית לאחר הלידה, תוך 24 שעות לכל המאוחר, כדי למקסם את תקינות הסלולר. לחתוך קטע2 9 ס מ השפיר, להסיר קרישי דם ולשטוף בשפופרת צנטרפוגה 50 מ עם 30 מ של PBS בתוספת אנטיביוטיקה-antimycotic פתרון.
    2. מינצ הממברנות בעזרת זוג ואזמלי מנתחים משובח חתיכות בצלחת תרביות רקמה סטרילי 10 ס מ. העיכול של הממברנות, החילוץ של התאים תושג באמצעות מערכת דיסוציאציה רקמות. פעלתי לפי הנהלים של היצרן
      הערה: עדינה את החתיכות של הרקמה לאחר לקמץ, גבוה יותר מספרי הטלפון הנייד התאוששה לאחר עיכול.
    3. העברת המסה רקמת קרום טחון באמצעות את להבים ומהדקים לתוך צינור דיסוציאציה רקמה אחת ומערבבים עם 4.7 mL RPMI 1640 בינוני. מערבבים את האנזים דיסוציאציה (ראה טבלה של חומרים).
    4. הר הצינורות אל dissociator רקמת ולהפעיל תוכנית "h_tumor_01". דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה נדנדה למשך 30 דקות.
    5. בהמשך לדלל את המתלים 35 מ של RPMI 1640 ולהחיל על מסננת מיקרומטר 70 הניח על שפופרת צנטרפוגה אוסף 50 מ.
    6. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב g 200 x בטמפרטורת החדר, להשליך תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 5 מ של RPMI 1640, לספור את התאים באמצעות hemacytometer ואת צלחת על צפיפות של תאים/ס מ 10,0002 לתוך כלי שטופלו תרביות רקמה עם טרי מוכן AFMC בינוני בתוספת אנטיביוטיקה-antimycotic פתרון.
      הערה: במקרה של עיכול לא שלם, חתיכות קטנות של רקמות יהיה נוכח, תאים בודדים יהיה מצומצם. ספין למטה שוב, צלחת בגדר כולו לתוך הבקבוק T75 אחד.
  3. תרבות של ראשי AFSC, AMSC
    1. מושבות מעבר של AFSC/AMSC מאת כ רפה-בעברית ואקום בילה בינונית בעזרת פיפטה פסטר והוספת 2 מ ל אנזים ניתוק התא לתוך הבקבוק. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-8 דקות.
    2. הקש על הבקבוק כדי לעזור לסלק את התאים ומערבבים את המתלים עם אמצעי אחסון שווה AFMC בינוני (תוספת אנטיביוטיקה-antimycotic לא צריך להיות הכרחי מנקודה זו ואילך). צנטריפוגה-200 גרם 4-5 דקות להסיר תגובת שיקוע באמצעות זכוכית או פיפטה פסטר או פשוט על-ידי היפוך הצינור וריקון זה לתוך מיכל פסולת.
    3. גלול לתחתית הצינור צנטריפוגה להיפרד בגדר להשעיה תא בודד בתיבה הנפתחת הנותרים של נוזל ולערבב עם AFMC בינוני עבור ציפוי. הצלחת לתוך T-מבחנות צפיפות בין 2,500 ל- 5,000 תאים/ס מ2.
    4. שינוי בינוני בכל יום אחר. לא תרבות הקווים תא מעבר פסקה 6. עבור התכנות למטרות, להשתמש בתור נמוכה מעבר ככל האפשר.
    5. התכונן מניות קפוא של AFSC ושל AMSC גיבויים באמצעות הקפאה בינוני. הקציר תרבויות באמצעות אנזים ניתוק התא, צנטריפוגה-200 גרם עבור 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    6. הסר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה פסטר וחבוט התחתון של צינור כדי singularize התאים בגדר. Resuspend במדיום הקפאה מוחלטת על צפיפות של 1 × 106/mL ו aliquot לתוך cryovials. לאחסן במיכל ההקפאה ללון ב- 80 מעלות צלזיוס. ולאחר מכן להעביר חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

2. התכנות לתוך Pluripotency

  1. להשיג את התיכנות פלסמידים
    1. לרכוש את פלסמידים התיכנות דרך מאגר פלסמיד ללא כוונת רווח. הסכם העברת חומר נדרש.
    2. להפוך את פלסמידים לתאים המוסמכת e. Coli ו לבודד את פלסמידים באמצעות ערכת חילוץ פלסמיד מסחרי. בצע הוראות היצרן.
    3. מודדים את ריכוז פלסמיד הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים. המטרה עבור ריכוז גבוה פלסמיד וכתוצאה מכך, באופן אידיאלי בסביבות 1 µg µL כדי למנוע דילול של המדגם במהלך תרביות תאים.
    4. למדוד את ריכוזי פלסמידים בודדים באמצעות UV-ספקטרופוטומטרים aliquot אותם בנפרד.
    5. מערבבים יחד 3 µg 3 µg, 2 µg של פלסמידים EN2K, ET2K ו- M2L, בהתאמה. זהו הפתרון פלסמיד התיכנות. הכמות של פלסמיד הפתרון הוא מספיק כדי transfect עונה 1 פרק 106 תאים. הכן מספר aliquots כזה.
    6. לאחסן כל aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת לוחות תרבות היעד
    1. מעיל לוח 6-ובכן אחד עם vitronectin – מוסיפים 1 מ"ל vitronectin דילול מאגר לבאר כל ומערבבים ב 40 µL של פתרון מניות עולמיים בנויים לצרכיך המדויקים (1 µg/cm2). להשאיר בטמפרטורת החדר (RT) או בחממה ב 37 ° C עבור 1 h.
    2. ואקום-לשאוב הפתרון בעזרת פיפטה פסטר והחלף 2 מ של AFMC במדיום מכל קידוח. לאחסן ב 37 ° C עד התאים הם כדי להיות מצופה.
      הערה: חשוב: AFMC אופן השימוש בשלב זה אינו אמור להכיל את כל פתרונות לאנטיביוטיקה או antimycotic.
  3. קציר תרבותי AFSC ראשי/AMSC
    הערה: הרחב AFSC/AMSC בתרבות מספיק כדי להפוך את מניות הקפוא במספר נמוך מעבר ולהקדיש את הבקבוק T-75 אחד עבור התכנות. מאז מעטים כמו תאים 100,000 מספיקים ניסוי, לכוון קציר בסביבות 500,000 תאים כדי לפצות על ההפסדים ואם אופטימיזציה של תרביות תאים פרמטרים או תרבות אחרת תנאים הם להיבדק.
    1. בזמן שנוחהמוקדם-קטע נמוך, לקצור את AFSC/AMSC באמצעות תא ניתוק אנזים מיקס כפי שמתואר בשלב 1.3.1 כדי 1.3.2. אחרי שיש כבר centrifuged את התאים, המשך לשלב הבא.
    2. Resuspend בגדר ב 1 מ"ל של PBS, לערבב היטב כדי לשטוף את הנסיוב רכיבים. לספור את התאים באמצעות hemacytometer. להתאים את צפיפות התאים עד 100,000/מ"ל של PBS ו aliquot לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL. פעולה זו מבטיחה זמן קשר מינימלי בלבד בין התאים המאגר המשמש עבור תרביות תאים.
    3. למקם את הצינור microcentrifuge על גבי צינורות פוליסטירן 5 מ"ל (כמו מתאמים, יאפשר צנטריפוגה ברוטור הנדנדה רגיל), צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר. היפוך הצינורות ולמחוק את תגובת שיקוע לתוך מיכל פסולת. אל תשתמש רוטור קבוע-זווית.
    4. לבצע צעד צנטריפוגה נוספים ב 200 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. זה יאפשר הנותרים נוזלי מהקירות של הצינור כדי לאסוף בתחתית. בזהירות תשאף כל זה בעזרת פיפטה 200 µL.
  4. תרביות תאים עם התכנות פלסמידים
    1. עבור התכנות ניסויים, מערכת תקנים (ראה טבלה של חומרים) ישמש כדי לספק פלסמידים התיכנות לתוך התאים. הצב טיפים תרביות תאים, צינורות תרביות תאים, מאגר resuspension, מאגר electrolytic אל הארון תרביות רקמה. ריאגנטים ערכת נשמרים RT עד שהם נפתחים, ואז הם מאוחסנים ב 4 º C.
      הערה: אנו משתמשים הגירסה µL 10 של הערכה.
    2. להעביר ההתקן תרביות תאים סגור כך ניתן להציב את תחנת הרכבת התחתית שלה ישירות לתוך הקבינט. מילוי שפופרת אחת תרביות תאים עם 3 מ"ל של מאגר electrolytic והר הצינור לתחנה על-ידי דחיפתו כל הדרך בתוך החריץ.
    3. לקחת פלסמיד התיכנות aliquots פתרון מוכן בשלב 2.1.5 מהאחסון-80 ° C ולאפשר להם להפשיר ב RT בתרבות הקבינט.
    4. על המכשיר תרביות תאים, בחר את הפרמטרים הבאים של תרביות תאים: 950 V, 40 ms, ודופק 1.
    5. Resuspend בגדר המכיל תאים 100,000 במאגר resuspension µL 10. עובדים במהירות מהנקודה הזו מאז resuspension מאגר רעיל במקצת ותוצאות זמן חשיפה מוגברת של הכדאיות נמוכה באופן ניכר התא.
    6. מערבבים 1/10 של הפתרון פלסמיד התיכנות (הפתרון aliquot הוכן עבור סכום כולל של עונה 1 פרק 106 תאים).
    7. הר טיפ תרביות תאים על פיפטה תרביות תאים.
    8. האחות התליה תא לתוך קצה תרביות תאים בקפידה, הימנעות היווצרות בועות אוויר. אם בועות. מובחנות, לגרש את המתלים וחזור על השאיפה. בועות אוויר לעכב תרביות תאים.
    9. להוסיף את פיפטה תרביות תאים לתוך הצינור תרביות תאים, לחץ על לחצן "התחל" על המסך של המכשיר תרביות תאים. נחכה להודעה מסך להודיע על ההצלחה של תרביות תאים ולהסיר את פיפטה מהצינור מיד.
    10. לגרש את המתלים 1 טוב של 6-ובכן המטרה צלחת מוכן בסעיף 2.2. מערבבים את האמצעי השכנה טוב ולהפיץ ההשעיה באופן שווה לתוך שתי בארות (צפיפות התא שיתקבל יהיה 50,000/טוב).
    11. חזור על תרביות של תאים עבור כל צינורות microcentrifuge המכיל AFSC/AMSC בנפרד. מקם את הצלחת לתוך החממה-CO 37 ° C ו-5%2.
  5. תרבות של transfected AFSC/AMSC
    1. התרבות התאים transfected 2-5 ימים. ואז לעבור בינוני התיכנות המורכב E8 בתוספת 100 מיקרומטר של נתרן butyrate ביום השלישי.
      הערה: ניתן לבצע מעבר משני כדי למנוע צמיחת יתר של המקור AFSC/AMSC. עם זאת, passaging תגרום להשבתת האפשרות לחשב את יעילות התיכנות כראוי אם הפרמטר זה עניין.
    2. לשנות את המדיום התיכנות כל יום כל יום אחר במשך 10 ימים. מחליף המדיום כל יום מיום 10
  6. איסוף ידני של המושבות reprogramed באופן מלא עבור משובט הרחבה
    1. המושבות היו מלא מופיעים סביב היום ה-14. לאפשר מושבות להרחיב במידה ולהיות קומפקטיים. הם יכולים להיות ידנית בחרה והעבירו ללוחות טריים מוקדם ככל יום 15-16.
    2. h 1 לפני ההליך האיסוף, מעיל טוב 24 צלחות עם µL 8 של עולמיים בנויים לצרכיך המדויקים ב- 300 µL vitronectin מאגר דילול לכל טוב (1 µg/cm2), דגירה RT או 37 מעלות צלזיוס. החלף את הפתרון E8 בינונית ללא סודיום butyrate.
    3. בחר מושבות במידה מספקת (אידיאלי מעל 400 מיקרומטר בקוטר) בתרבות סטרילי בארון. ניתן להשתמש במיקרוסקופ ניגוד שלב או של stereomicroscope.
    4. עבור איסוף, מיקרוסקופ הדמיה LCD להציב בתוך הארון ישמש מאז שלה צג מבטל את הצורך oculars. לחטא את הבמה מיקרוסקופ עם 70% אתנול.
    5. באמצעות מיקרוסקופ תרבות תא רגיל ניגודיות שלב, בחר, לסמן ורשום את מספר מושבות לאסוף אותם. זה חשוב לוודא זמן לא מבוזבז עבור תהליך זה במהלך האיסוף בפועל.
    6. למלא מספר המבחנות זה שווה או גדול יותר ממספר מושבות לאסוף אותם עם 30 µL של חומצה ethylenediaminetetraacetic 0.5 מ מ (EDTA) ב- PBS. מושבות יוצב לתוך הצינורות האלה על דיסוציאציה חלקית לפני ציפוי.
    7. מתכנן לאסוף 5 מושבות בכל פעם מן הלוחות בעזרת פיפטה של 10 µL מוגדר µL 2. להחזיק את הקצה פיפטה בזווית בקצה המושבה, בזהירות ובהדרגה לגרד כל המושבה מעל פני השטח. מיד תשאף כל המושבה לתוך קצה פיפטה ולהעביר אותו לאחת המבחנות מוכן עם EDTA.
    8. חזור עם המושבות 4 הנותרים. תקופת דגירה-RT של 4-6 דקות.
    9. Pipet התליה למעלה ולמטה בעדינות באמצעות טיפ פיפטה גדול יותר כדי לשבור את המושבה לתוך גושים קטנים יותר. הימנע מיצירת השעיה תא בודד.
    10. צלחת ההשעיה ישירות לתוך יעד טוב של צלחת 24-ובכן מוכן בשלב 2.6.2. חזור עם המושבות הנותרים.
    11. חזור על שלבים 2.6.6 דרך 2.6.10 אם המושבות יותר מ-5 להיבחר אך לא לקחת יותר מ-5 מושבות בכל פעם. דגירה-CO 37 ° C ו-5%2.
  7. משובט הרחבה, ההבשלה של iPSC
    1. לאפשר מושבות לגדול ולהיות קומפקטיים. 3-6 ימים מספיקים. לשנות את המדיום תרבות מדי יום. השתמש בין µL 400 מ ל 1 בינוני E8 בהתבסס על צפיפות התאים.
    2. הבארות של צלחת 24-ובכן עם צפיפות המושבה מספקת תורחב לוחות 6-. טוב. h 1 לפני passaging, מעיל טוב 6 הצלחות עם עולמיים בנויים לצרכיך המדויקים (כמו שלב 2.2.1). לאחר מכן להחליף את הפתרון בבאר עם 2 מיליליטר E8 בינוני לכל טוב.
    3. האחות המדיום בילה מן הבארות המקור באמצעות פיפטה 1 מ"ל והחלף 300 µL של 0.5 מ מ EDTA לשטוף. האחות מיידי באמצעות הטיפ פיפטה באותו להחליף µL 300 של 0.5 מ מ EDTA שוב ואז דגירה-RT עבור 5 דק תשאף כל נוזל באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
    4. הגדר את פיפטה 1 מ"ל קיבולת, הר טיפ נשא רחב 1 מ"ל על זה ולאחר תשאף והמדיום E8 מן המטרה היטב לתוך הקצה. לשטוף את התרבות iPSC מקור עם זרם של המדיום.
    5. להעביר את המתלים לתוך יעד טוב ו pipet לאורך מספר פעמים כדי לשבור את המושבות לתוך גושים של תאים 20-50. ודא כי הם לקבל מופץ באופן שווה בתוך הבאר על ידי עדין נדנדה וניער את הצלחת, דגירה-CO 37 ° C ו-5%2.
    6. לשנות את בינוני מדי יום ואת המעבר כל 3-4 ימים. כל המושבות המבדילים ניתן לסמן במיקרוסקופ ניגוד שלב והוציאו באמצעות טיפ פיפטה בתרבות בארון. דבר זה מאפשר הפצה סלקטיבית של תרבות iPSC טהור באיכות גבוהה.
    7. h 1 לפני passaging, מעיל הבארות של צלחת 6-ובכן עם עולמיים בנויים לצרכיך המדויקים כמו שלב 2.2.1. לאחר מכן להחליף את הפתרון עם 2 מיליליטר E8 בינוני לכל טוב.
    8. Passaging שגרתית דומה ראשוני passaging נעשה שימוש 0.5 מ מ EDTA (שלבים 2.7.2 כדי 2.7.5). החלף בילה במדיום אחד טוב של צלחת 6-ובכן 1 מ"ל של EDTA כדי לשטוף ולמחוק.
    9. להוסיף 1 מ"ל של EDTA, דגירה-RT למשך 5-7 דקות על דיסוציאציה חלקית. למטב את זמן הדגירה אם יש צורך, מוודא השעיה של סביב 20-50-לתא גושים מופק. הימנע דיסוציאציה לתוך תאים בודדים.
    10. לבטל את הפתרון EDTA, תשאף 1 מ"ל של המדיום E8 באמצעות פיפטה של 1 מ"ל מן המטרה גם לתוך טיפ רחב נשא פיפטה.
    11. לשטוף את התרבות iPSC מקור עם זרם של המדיום E8 שוב ושוב עד חלקו הרצוי שוחרר מפני השטח ולהעביר לתוך היעד טוב. חלק זה מייצג את יחס פיצול (למשל, 1/8 של התרבות ניתן להעביר על יחס של 1:8.)
    12. מעבר כל 3-4 ימים. לאפשר iPSC קווים להבשיל מאת culturing אותם לפחות 15 קטעים לפני השימוש בניסויים במורד הזרם

3. אפיון ואישור Pluripotency

הערה: עיין הקבצים המשלימים לפרטים על cytometry זרימה, מיקרוסקופיה קונפוקלית.

  1. טרטומה היווצרות assay
    1. כדי לקבוע את הקיבולת של iPSC להבדיל לרקמות נציג של כל שלוש שכבות נבט על ידי טרטומה היווצרות assay, בצע את מדיניות מוסדית בנושא טיפול בבעלי חיים ושימוש, בתכנון מראש לאפשר זמן הגשת הפרוטוקול המתאים מסמכים. היווצרות טרטומה בעכברים ייקח בין 6-10 שבועות.
    2. תרבות 4 בארות של צלחת 6-ובכן לשורה iPSC במשך 4 ימים. המספר המשוער של תאים מוזרק לתוך אגף אחד של עכבר הוא 0.5-1 x 106 תאים. אופציונלי: נוסף טוב יכול להיות מוקדש לקביעת מספר תא נציג בבאר של דיסוציאציה תא בודד עם אנזים ניתוק התא וסופר.
    3. חישוב הנפח של התערובת E8/BMM כגיהנום iPSC יושעו ב: משני האגפים של עכבר מוזרקים, כל אחד עם 150 µL של סבך השעיה. שלושה עכברים מספיקים לבדוק טרטומה היווצרות iPSC שורה אחת. כוללים של µL תוספת 150 לכל מחט באמצעי האחסון שנוצר כדי לפצות על אובדן נפח מת. מחט 1 לכל העכבר נמצא בשימוש. לנפח הכללי ולכן היא 3 * (150 µL * 2 + 150 µL) = 1350 µL
    4. חלקית מביצועם המושבות iPSC עם EDTA כאילו היו כדי להיות passaged, כמתואר בצעדים 2.7.8 כדי 2.7.10. חשוב כי המושבות להיות חלופה מועדפת לתוך גושים, מופרדים לתוך תאים בודדים.
    5. לשטוף את המושבות iPSC עם µL 675 E8 בינוני (מחצית האחסון מחושבים. משלב 3.3.3), באמצעות טיפ נשא רחב. להעביר את המתלים סבך לתוך צינור פוליסטירן מ. מניחים על קרח.
    6. לשלב עם µL 675 של BMM. לשמור התליה המתקבלת על הקרח עד הזריקה.
    7. עזים ומתנגד העכברים כדי לשתק אותם באמצעות איזופלוריין. זה צריך לבצע או מונחה על ידי הצוות המיומן של ביבר.
    8. מערבולת פוליסטירן מ ל צינור בקצרה, וארוקן את סבך הבולם (450 µL לכל עכבר) לתוך מזרק אינסולין אחת מצויד עם מחט 22 גרם. להזריק 150 µL של התליה תא subcutaneously. כרך זה מכיל כ עונה 1 פרק 106 תאים (ראה שלב 3.1.2).
    9. להזריק 3 עכברים לשורה iPSC. בצע תרגול טיפול בבעלי חיים עבור כל שגרות.
    10. לפקח על הבריאות של העכברים מדי יום.
    11. כאשר teratomas מגיעים עם קצה בקוטר של 1.5-2 ס מ, המתת חסד העכברים, explant את teratomas, לאחסן אותם פורמלין פתרון עבור קיבוע הרקמה במשך 24 שעות ביממה.
    12. להביא את teratomas קבוע מתקן הליבה היסטולוגיה עבור hematoxylin אאוזין (H & E) מכתים. פתולוג אתן ציון הנוכחות של רקמות של כל שלוש שכבות הנבט.
      הערה עבור Karyotyping: חיה iPSC תרבויות צריכה להישלח התמחה cytogenetic מעבדות בדיקה של שלמות קריוטיפ. מומלץ כי בדיקה זו ניתן לבצע כל הקטעים 5.
  2. פרופיל תעתיק
    1. תרבות בארות 2 של צלחת 6-ובכן 3-4 ימים לקבל דוגמא אחת של RNA. רק להשתמש תרבויות באיכות גבוהה, ניתן לטפל בזיהום קטין המבדילים תאים על ידי גירוד אותם באמצעות טיפ pipet.
    2. לבודד RNA מתרבויות iPSC באמצעות ערכת זמינים מסחרית ע פ הפרוטוקול של היצרן. הספינה דגימות למתקן הליבה גנומית מיוחדים.
    3. להשיג את הפרופילים תעתיק הכללית של הקווים iPSC באמצעות מיקרו-מערכים (ראה טבלה של חומרים עבור האפשרויות נתמך) או רצפי RNA.
    4. שלח קבצים "*.idat" עבור הערכה bioinformatic של pluripotency באמצעות ממשק מקוון במכון Coriell. לחילופין, להגיש "* .cel" קבצים עבור bioinformatic זיהוי של סוג התא, לרבות תאי גזע pluripotent, באמצעות ממשק מקוון ב אוניברסיטת ג'ונס הופקינס. לפרטים על סוגי נתונים לקבל מבחני bioinformatic בודדים, ראה טבלה של חומרים .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסכמה בכתב מושכלת הושג מחולים לפני הקציר השפיר למטרות בדיקה גנטית, מקדיש aliquot קטן של נוזל למחקר. אין הסכמה נדרש לשימוש של קרום מי השפיר במחקר כפי השליה מייצג פסולת רפואית. נוזל מי השפיר ותאי גזע ממברנה להציג מאפייני mesenchymal טיפוסי, מורפולוגית התאים שלהם הם בצורת כישור, שלב-בהיר. על התכנות, התאים עוברים mesenchymal-כדי-אפיתל המעבר (MET), רוכשים ריצוף דמוי ומורפולוגיה הארגון המרחבי של המושבות, המציינת את מאפייני האפיתל. תהליך זה מתחיל מוקדם ככל 48-72 שעות לאחר כניסתה של התכנות פלסמיד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלב הראשוני של דור iPSC של תאי גזע עובריים מצריכה הפקת תאי המקור של רקמות העובר שלהם, הרחבה, ותרבות הקדמה של פלסמידים התיכנות episomal. שלב זה ואחריו תקופת תרבות בסביבות 14-18 ימים לפני ניתן להרחיב את המושבות מלא reprogrammed הראשון. השלב האחרון הוא התבגרותם של שיבוטים iPSC. החילוץ הראשוני של תאי גזע קרום מי השפיר מושגת באמצעות העיכול בשילוב מכני, אנזימטי של השפיר. . מצאנו זמן הדגירה של 30 דקות הביא המספר הגבוה ביותר של תאים חילוץ עם הכדאיות הגבוהה ביותר. ההליך העיכול יכול לייצר חתיכות קטנות של הרקמה והתא גושים. אם חלקם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי Medizinische Forschung Fonds באוניברסיטת ציריך, Forschungskredit של אוניברסיטת ציריך, NMS SCIEX שלCh תחת מלגות 10.216 ו- 12.176, שוויצרי החברה לקרדיולוגיה, את המדע הלאומית השוויצרית קרן תחת גרנט [320030-122273] ו- [310030-143992], לתכנית המסגרת השביעית, שסתום החיים, הנציבות האירופית תחת גרנט [242008], קרן Mayenfisch אולגה, קרן EMDO, המענק סטארט-אפ 2012 של בית החולים האוניברסיטאי בציריך, ו מימון פנימי של מכון הסרטן מיטשל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת דיסוציאציה של גידולים,רקמות Miltenyi Biotec130-095-929, ערכת ריאגנטים, כוללת צינורות דיסוציאציה של רקמות ואנזימי דיסוציאציה של רקמות
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235מערכת דיסוציאציה של רקמות, דיסוציאטור
Thermo Scientific™ שנדון וסחר; אזמל חד פעמי מס' 10, סטרילי, עטוף בנפרד, 5.75 (14.6 ס"מ)תרמו-פישר3120032
70 ומיקרו; מסנני תאים mקורנינג10054-456
RPMI 1640 בינוניתרמו-פישר32404014 
פלטפורמת נדנדהVWR40000-300
צינורות צנטריפוגה 50 מ"לThermo-Fisher339652
צינורות צנטריפוגה 15 מ"לThermo-Fisher339650
EBM-2 מדיום בסיסיLonzaCC-3156מדיום בסיסי עבור AFMC בינוני
FGF 2 אנושי (מבוטא ב-E. coli, לא מסוכרר)Prospec BioCYT-218bFGFתוסף עבור AFMC בינוני
EGF אנושי, PichiaProspec BioCYT-332 EGF, תוסף למדיום AFMC
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human RecombinantProspec BioCYT-022IGF, תוסף
Thermo-Fisherמוסמך לתאי גזע עובריים10439024FBS
אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית (100X)Thermo-Fisher15240062 עבור AFSC/AMSC ראשוני, עבור AFSC/AMSC שגרתי זה לא צריך להיות נחוץ, אין להשתמש במדיום עבור תאים שעברו טרנספטציה!
תמיסת ניתוק תאים AccutaseStemCell Technologies07920אנזים ניתוק תאים
CryoStor™ CS10StemCell Technologies07930מדיום הקפאה מלא
PBS, pH 7.4Thermo-Fisher Scientific10010023 
ערכת מקסי EndoFree Plasmid (10)Qiagen12362לבידוד פלסמיד
pEP4 E02S EN2KAddgene20925EN2K, גורמי תכנות מחדש Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2KAddgene20927ET2K, גורמי תכנות מחדש Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2LAddgene20926M2L, גורמי תכנות מחדש c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis ספקטרופוטומטרתרמו-פישרND-2000Cספקטרופוטומטר
ניאון® מערכת טרנספקציהThermo-FisherMPK5000מערכת טרנספקציה, רכיבים:
פיפטה ניאון - פיפטה טרנספקציה
מכשיר ניאון - מכשיר טרנספקציה
Neon® מערכת טרנספקציה 10 ומיקרו; ערכת LThermo-FisherMPK1025חומרים מתכלים למערכת העברת הניאון, היא מכילה:
קצה ניאון - קצה טרנספקציה
צינור ניאון - צינור טרנספקציה
מאגר R - מאגר השעיה מחדש
מאגר E - מאגר אלקטרוליטי
Stemolecule™ נתרן בוטיראטStemGent04-0005משפר מולקולות קטנות של תכנות מחדש
TeSR-E8StemCell Technologies05940E8 בינוני
ויטרונקטין XF ומסחר;StemCell Technologies07180VTN, ריכוז מלאי 250 ומיקרו; גרם/מ"ל, משמש לציפוי ב-1 ומיקרו; g/cm2 במאגר דילול ויטרונקטין (CellAdhere)
CellAdhere™ מאגר דילולStemCell Technologies07183מאגר דילול ויטרונקטין
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo-Fisher15575020 לדלל עם PBS ל-0.5 מ"מ לפני השימוש
EVOS® מערכת הדמיה FLThermo-Fisher ScientificAMF4300מערכת מיקרוסקופ הדמיה LCD
CKX53 מיקרוסקופ הפוךמיקרוסקופ תרבית תאים ניגודיות שלבאולימפוס
Pierce™ 16% פורמלדהיד (w/v), ללא מתנולThermo-Fisher28908לדלל ל-4% עם PBS לפני השימוש, ניתן לדלל בטמפרטורה של 2-8 מעלות; C למשך שבוע
אחד Perm Buffer IIIBD Biosciences558050מאגר חדירה, מצנן ל-20 מעלות; C לפני השימוש
בעכבר IgG1, κ בקרת איזוטיפ, Alexa Fluor® 488BD Biosciences557782בקרת איזוטיפ עבור Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1 ו-kappa; בקרת איזוטיפ, Alexa Fluor® 647BD Biosciences557783בקרת איזוטיפ עבור Sox2
Mouse אנטי-אנושי Oct3/4 (איזופורם אנושי A), Alexa Fluor® 488BD Biosciences561628
Mouse אנטי-אנושי Nanog, Alexa Fluor® 488BD Biosciences560791
Mouse אנטי-אנושי Sox-2, Alexa Fluor® 647BD Biosciences562139
עכבר IgGM, κ בקרת איזוטיפ, Alexa Fluor® 488BD Biosciences401617בקרת איזוטיפ עבור TRA-1-60
IgGM של עכבר, κ בקרת איזוטיפ, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401618בקרת איזוטיפים עבור TRA-1-81
עכבר אנטי-אנושי TRA-1-60, Alexa Fluor® 488BD Biosciences330613
Mouse אנטי-אנושי TRA-1-81, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330705
Mouse IgG1, κ בקרת איזוטיפ, Alexa Fluor® 488BD Biosciences400129בקרת איזוטיפ עבור עכבר SSEA-1
IgG3, κ בקרת איזוטיפ, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401321 בקרת איזוטיפ עבור SSEA-4
עכבר אנטי-אנושי SSEA-1, Alexa Fluor® 488BD Biosciences323010
עכבר אנטי-אנושי SSEA-4, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330407
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488Jackson Immunoresearch115-606-068השתמש בדילול של 1:600 או בצע אופטימיזציה נוספת
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647Jackson Immunoresearch115-546-068שימוש בדילול של 1:600 או אופטימיזציה נוספת
DAPIThermo-Fisher ScientificD2149010 מ"מ, דילול נוסף ל-1:12.000 לפתרון עבודה
Corning® Matrigel® גורם גדילה מופחת, פנול נטול אדום356231מטריצת קרום הבסיס (BMM)
עכברים בז'-scid, נקבהTaconicCBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50)ערכת בידוד RNAQiagen74134
צלוחיות T-25,Thermo-Fisher156367-T-75
תרמו-פישרשטופלו בתרבית רקמות
Nunc™ צלחת תרמו-פישר12-567-650 צלחת תרבית רקמות 10 ס"מ
צלחות 6 בארות,תרמו-פישר140675
תא ספירה של נויבאואר (המציטומטר)VWR15170-173
מר פרוסטי וסחר; מיכל הקפאהתרמו-פישר5100-0001 מיכל הקפאה
שפופרות FACS, מבחנה מפוליסטירן תחתון עגול, צינורות פוליסטירן 5 מ"ל3520585 מ"ל
צינורות אפנדורף, 1.5 מ"לתרמו-פישר05-402-96צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל
צינורות PCR, 200 ומיקרו; lThermo-Fisher14-222-262
קצות פיפטה, 100 עד 1250 ומיקרו; lThermo-Fisher02-707-407קצות פיפטה צרות 1 מ"ל קצות
, 5 עד 300 ומיקרו; lThermo-Fisher02-707-410
קצות פיפטה, 0.1 עד 10 ומיקרו; lThermo-Fisher02-707-437
קצות פיפטה רחבות קידוח, 1000 ומיקרו; lVWR89049-166רחב קדח 1 מ"ל קצות
זכוכית פיפטות פסטורתרמו-פישר13-678-20A
אתנול, 200 הוכחהתרמו-פישר04-355-451
מערבל מערבולתVWR10153-842
כיסוי תא, 8 בארות, 1.5 מ"מ זכוכית בורוסיליקטתרמו-פישר155409כלי תרבית בדרגת קונפוקל עם תחתית זכוכית
מחטי 22GVWR82002-366
מזרקי אינסוליןThermo-Fisher22-253-260
תמיסת פורמלין, חוצץ ניטרלי, קיבוע 10%Sigma-AldrichHT501128-4Lשל טרטומות שתולות
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChipIlluminaBD-103-0204מיקרו-מערך ביטוי, נתמך על ידי PluriTest, הופסק על ידי היצרן
PrimeView Human Genome U219 Array PlateThermo-Fisher901605 ביטוי מיקרו-מערך (לשעבר המותג Affymetrix), בקרוב ייתמך על ידי PluriTest
GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 ArrayThermo-Fisher902482ביטוי מיקרו-מערך (לשעבר המותג Affymetrix), הנתמך על ידי CellNet, בקרוב יתמוך על ידי PluriTest
PluriTest®www.pluritest.org מכוןקוריאל, שירות חינמי להערכה ביואינפורמטית של פלוריפוטנטיות, מקבל נתוני מיקרו-מערך - *.idat מפלטפורמת HT-12 v4, בקרוב יתמוך בנתוני ריצוף U133, U219 microarray ו-RNA
CellNetג'ונס הופקינסcellnet.hms.harvard.edu, שירות חינם לזיהוי ביואינפורמטי של סוג התא, כולל תאי גזע פלוטיפוטנטיים, המבוסס על נתוני מיקרו-מערך U133 - קבצי *.cel, בקרוב יתמכו ב-RNA רצף נתונים
מערכת דיסוציאציה של אנושית,לסרום בקר עוברי בינוני AFMC, של של תמיסת מלאי צלוחיות שטופלו בתרבית רקמות, 156499 אוניברסיטת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
  4. Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
  5. Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
  6. Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
  7. Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
  8. Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
  9. Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  10. Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
  11. Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
  12. Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
  13. Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
  14. Kang, N. -H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
  15. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  16. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  20. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  21. Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  22. Müller, F. -J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
  23. Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
  24. Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
  25. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  26. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
  27. Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
  28. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

E8

מאמרים קשורים