Method Article

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

DOI:

10.3791/56010

⸱

July 31st, 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע אוטומטית תמונה מודרך תיקון ניסויים מהדק באמצעות מערכת שפותחה לאחרונה עבור תקן במבחנה electrophysiology ציוד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מהדק תיקון של כל התא הוא שיטה סטנדרטית זהב למדוד את המאפיינים החשמליים של תאים בודדים. עם זאת, במבחנה תיקון מהדק נשאר מאתגר נמוך התפוקה הטכניקה בשל המורכבות שלה ואת ההסתמכות הגבוהה על פעולת המשתמש ושליטה. כתב יד זה מדגים תמונה מודרכת אוטומטית תיקון מערכת מהדק עבור במבחנה כולו תא תיקון ניסויים מהדק פרוסות המוח חריפה. המערכת שלנו מיישמת מחשב מבוסס חזון אלגוריתם כדי לזהות תאים שכותרתו fluorescently ו למקד אותם עבור תיקון אוטומטי מלא באמצעות micromanipulator ואת השליטה הפנימית פיפטה הלחץ. התהליך כולו הוא אוטומטי מאוד, עם דרישות מינימליות להתערבות אנושית. מידע ניסיוני בזמן אמת, כולל התנגדות חשמלית ולחץ פיפטה פנימי, מתועדים בצורה אלקטרונית לניתוח עתידי ולאופטימיזציה לסוגים שונים של תאים. למרות שהמערכת שלנו מתוארת בהקשר של בריאה חריפהN הקלטות פרוסה, זה יכול גם להיות מיושם על התמונה אוטומטית מודרך תיקון מהדק של נוירונים מנותקים, תרבויות פרוסות organotypic, וסוגים אחרים של תאים שאינם נוירונים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה מהדק תיקון פותחה לראשונה על ידי Neher ו Sakmann בשנות ה -70 ללמוד את הערוצים היוניים של ממברנות נרגש 1 . מאז, תיקון clamping הוחל על המחקר של נושאים שונים רבים ברמה התאית, הסינפטית והמעגלית - הן במבחנה והן ב- vivo - בסוגי תאים שונים, כולל נוירונים, קרדיומיוציטים, ביציות Xenopus וליפוזומים מלאכותיים 2 . תהליך זה כרוך זיהוי נכון ומיקוד של תא של עניין, שליטה micromanipulator מורכבים להעביר את פיפטה תיקון בקרבה לתא, היישום של לחץ חיובי ושלילי פיפטה בזמן הנכון להקים תיקון gigaseal הדוק, ואת הפריצה להקים תצורה שלמה תיקון התאים. תיקון clamping מתבצעת בדרך כלל ידני דורש הכשרה מקיפה כדי לשלוט. אפילו עבור חוקר מנוסה עם התיקוןמהדק, שיעור ההצלחה נמוך יחסית. לאחרונה, כמה ניסיונות נעשו כדי להפוך את הניסויים תיקון clamp. שתי אסטרטגיות עיקריות התפתחו כדי להשיג אוטומציה: הגדלת תקן מתקן מהדק תיקון לספק בקרה אוטומטית של תהליך התיקון ואת העיצוב של ציוד וטכניקות חדשות מהיסוד. האסטרטגיה לשעבר היא הסתגלות החומרה הקיימת ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים מהדק תיקון, כולל vivo עיוור תיקון מהדק 3 , 4 , 5 , מהדק תיקון במבחנה של פרוסות מוח חריפה, תרבויות פרוסה organotypic, נוירונים מנותקים תרבותית 6 . זה מאפשר חקירה של מעגלים מקומיים מורכבים באמצעות micromanipulators מרובים בו זמנית 7 . שיטת התיקון המישורית היא דוגמה לאסטרטגיית הפיתוח החדשה, אשר יכולה להשיג את התפוקה הגבוהה בו-זמניתאטך מהדק של תאים ההשעיה למטרות הסריקה תרופה 8 . עם זאת, שיטת תיקון מישורי אינו מתאים לכל סוגי התאים, במיוחד נוירונים עם תהליכים ארוכים או מעגלים שלמים המכילים חיבורים נרחבים. זה מגביל את היישום שלה כדי מיפוי מעגלים מורכבים של מערכת העצבים, המהווה יתרון מרכזי של הטכנולוגיה המסורתית תיקון מהדק.

פיתחנו מערכת אשר ממכן את תהליך הידוק תיקון הידן במבחנה על- ידי הגדלת חומרה סטנדרטי תיקון מהדק. המערכת שלנו, Autopatcher IG, מספק כיול פיפטה אוטומטי, זיהוי תא פלואורסצנטי זיהוי, שליטה אוטומטית של תנועת פיפטה, תיקון אוטומטי כל התא, ואת נתוני רישום. המערכת יכולה באופן אוטומטי לרכוש תמונות מרובות של פרוסות המוח בעומקים שונים; לנתח אותם באמצעות ראיית מחשב; ו לחלץ מידע, כולל את הקואורדינטות של תאים שכותרתו fluorescently. מידע זה יכול להיותהמשמש לכוון תאים תיקון אוטומטי של עניין. התוכנה נכתבת בפייתון - שפת תכנות חופשית וקוד פתוח - באמצעות מספר ספריות קוד פתוח. זה מבטיח נגישות שלה חוקרים אחרים ומשפר את reproducibility וקשיחות של ניסויים electrophysiology. המערכת יש עיצוב מודולרי, כך חומרה נוספת יכולה בקלות להיות interfaced עם המערכת הנוכחית הפגינו כאן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

.1 הגדרת מערכת

  1. לבנות את יחידת בקרת הלחץ.
    1. הרכב את יחידת בקרת הלחץ על פי מפת המעגל ( איור 1 ). הלחמה את החלקים הדרושים על לוח מעגלים מודפסים (PCB) המיוצרים על פי שרטוטים המעגל החשמלי ( איור 1 ב ). השתמש נגדים סטנדרטיים, נוריות, מתכת אוקסיד מוליכים למחצה שדה טרנזיסטורים EEffect (MOSFETs), קבלים, ומחברים (ראה טבלה של חומרים ). שסתומים סולנואידים הלחמה על PCB. חבר את משאבת האוויר ואת חיישן לחץ האוויר אל PCB עם חוט חשמל.
      הערה: יידרשו כ- 2 שעות כדי לבנות את יחידת בקרת הלחץ, כאשר כל החלקים הדרושים יהיו זמינים.
  2. חבר את רכישת הנתונים המשניים (DAQ) לוח.
    1. חבר את נתוני הפלט מהמעגל המודפס ללוח DAQ, לאחר טבלה 1 .
      הערה: לוח ה- DAQ wilאני פועל במצב "מצב יחיד". מפת הנמל ניתן למצוא במדריך למשתמש (ראה טבלה של חומרים ).
    2. חבר את "A PR S" לאחת מערוצי הקלט האנלוגי (AI) ו- "R-GR" לאחת מהתחומים האנלוגיים בלוח ה- DAQ המשני.
    3. חבר את הפלט העיקרי מהמגבר לאחד מערוצי AI ואת הקרקע לאדמה האנלוגית של לוח DAQ המשני.
      הערה: ניתן להשתמש בכבל BNC סטנדרטי לחיבור הפלט הראשי מהמגבר.
    4. הפרד את הקצה השני ולחבר את האות החיובי ( כלומר הליבה נחושת) לערוץ AI ואת הקרקע ( כלומר חוט דק סביב הליבה) לאנלוגי הקרקע. חזור על שלב זה לערוץ השני אם נעשה שימוש ביותר מערוץ תיקון אחד.
      הערה: הקלט האנלוגי ללוח DAQ יוגדר בשלבים מאוחרים יותר.
    5. חבר חשמל ליציאת הכוח של לוח ה- DAQ המשני. השתמש כוח נפרד 12 V כךלכווץ את המשאבה.
  3. חבר את הצינור.
    1. חבר את משאבת האוויר ואת שני השסתומים לפי טבלה 2 . השתמש במחבר תלת-כיווני לחיבור הצינור הרך מהשקע העליון של השסתום, לחיישן הלחץ ולבעל פיפטה בשלב האחרון.
    2. הוסף עוד מחבר 3-way לצינור מחובר בעל פיפטה אם שתי טפטפות משמשים. החלף ידנית בין השסתומים לבין טפטפות בשימוש בעת תיקון.
  4. התקן Autopatcher IG.
    הערה: דרישות המערכת: Autopatcher IG נבדק רק במחשב שבו פועל Windows 7. הוא לא אומת עבור מערכות הפעלה אחרות. ההליך המתואר חל באופן ספציפי על החומרה המפורטת בטבלה של חומרים.
    1. הורד Autopatcher- IG מ GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
    2. התקן Python (עיין בטבלה של חומרים עבור הגרסה וכתובת ההורדה).
    3. הסר את PyQt4על ידי הקלדת "pip להסיר את PyQt4" במסוף שורת הפקודה.
      הערה: המערכת משתמשת בגירסה ישנה יותר של ספריית PyQt4 כדי להשיג תאימות עם הספריות Qwt ו- Opencv.
    4. התקן ספריות Python מקבצי גלגל היסטוריים (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). מצא את הקבצים הבאים: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl), ו Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. כדי להתקין את קבצי הגלגל, עבור לספרייה שבה הקבצים נשמרים והקלד "pip install *** weelfilename *** whl." תחליף "*** wheelfilename ***" עם השם האמיתי של הקובץ.
        הערה: "cp27" שם הקובץ גלגל מציין פייתון 2.7 ו "win32" ציינו Windows 32-bit. אם "win32" לא עובד, נסה "win64".
    5. כדי לשלוט במצלמת CCD, הורד והתקן את תוכנית ההתקנהעבור 64 סיביות (https://www.qimaging.com/support/software/). ואז להוריד MicroManager עבור 64 סיביות (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) כדי לשלוט על המצלמה Python.
    6. כדי לשלוט על המניפולטורים ואת הבמה מיקרוסקופ, להתקין את תוכנת הבקרה המסופקים על ידי היצרן.
      הערה: על ידי כך, הנהג הדרוש כדי לשלוט על מניפולטורים מותקן גם. חבילת ההתקנה מסופקת בדרך כלל בתקליטור.
    7. כדי לשלוט בלוח ה- DAQ המשני, התקן את הספרייה האוניברסלית מתקליטור, המסופק עם רכישת לוח DAQ.
  5. הגדר את החומרה עבור Autopatcher IG.
    1. חבר את הבמה מיקרוסקופ בקרי מניפולטור למחשב באמצעות יציאות USB.
    2. הקצאת מספרי יציאות COM ליחידה 0: שלב מיקרוסקופ, יחידה 1: מניפולטור שמאלי ויחידה 2: מניפולטור ימני, בסדר זה, בקובץ ההגדרות ports.csv בתיקייה "Configuration". LEave את הפרמטרים האחרים בקובץ ports.csv ( כלומר "SCI" ​​ו - "1") ללא שינוי.
      הערה: ניתן למצוא את מידע מספר היציאה של COM על - ידי הפעלת תוכנת תצורת מניפולטור המסופקת על - ידי היצרן. עבור אל הכרטיסייה "הגדרות", בחר "הגדרות" ואת "Motion" הדף, ולקרוא את התוויות עבור כל כרטיסייה בחלק העליון. לחלופין, מידע זה ניתן למצוא ב- PC Device Manager.
    3. הקצה מספרי ערוץ קלט אנלוגי בלוח DAQ לחיישן לחץ וערוץ תיקון 1 ו -2 (המקביל ליחידה 1 ו -2). הזן את מספר הערוץ בקובץ "DAQchannels.csv" בתיקייה "תצורה".
      הערה: מומלץ לפתוח את קובצי .csv ביישום 'פנקס רשימות' במקום בגיליון אלקטרוני, שכן הוא עשוי לשנות את המידע בעת שמירת שינויים.
  6. הפעל Autopatcher IG.
    1. הפעל את המגבר, בקר מיקרוסקופ, בקר מניפולטור. להנפיקכי תוכנת מגבר פועל.
    2. הפעל Autopatcher IG עם Python ממסוף שורת פקודה כדלקמן: ראשית, שנה את הספרייה (הפקודה "cd" עבור מסופים נפוצים ביותר) כאשר Autopatcher IG מותקן, הקלד "python Autopatcher_IG.pyw" במסוף שורת הפקודה, ולחץ על "Enter".
      הערה: אל תפעיל את תוכנת הבקרה מניפולטור לפני הפעלת Autopatcher IG כי זה יהיה לכבוש את הבמה מיקרוסקופ מניפולטור, גורם Autopatcher IG כדי להיות מסוגל למצוא את החומרה. תוכנת מניפולטור ניתן להפעיל לאחר Autopatcher IG הוא יזם באופן מלא אם יש מודולים נוספים להיות נשלט ( למשל, תנור inline).
  7. לכייל את פיפטה העיקרית.
    1. משוך טפיחות תיקון כפי שתואר לעיל 9 . מלאו פיפטה זכוכית משוך עם פתרון פנימי לטעון אותו על הבמה הראש.
      הערה: ריפודים זכוכית ריקים יש ניגודים שונים תחתהמיקרוסקופ ועשוי להוביל לכיול לא מדויק.
    2. להזיז את קצה פיפטה לשדה הראייה מיקרוסקופ ולהביא אותו להתמקד. אם לוח החיוג משמש להעברת המניפולטורים ו / או לשלב המיקרוסקופ, עדכן את הקואורדינטות על ידי לחיצה על "z" במקלדת.
      הערה: פעולה זו אינה נחוצה אם המקלדת (שלב המיקרוסקופ: A / D - x-axis, W / S - ציר y, R / F - z- ציר, מניפולטורים: H / K - x- ציר, U / ציר ה- Y, ​​ציר ה- O / L - z, 1/2 - מספר היחידה) משמש לשליטה בתנועה, שכן הקואורדינטות יעודכנו בזמן אמת.
    3. לחץ על "התחל כיול" כפתור בממשק המשתמש הגרפי הראשי (GUI) עבור היחידה המתאימה שבה פיפטה נטען ( איור 2 ).
      הערה: חלון מוקפץ יופיע עם השלמת הכיול.
      הערה: הכיול יתבצע באופן אוטומטי, אשר ייקח כ 3.5 דקות. לחיצה על אותו כפתור (עובר עכשיו "לבטל כיול" afכיול כיול) יבטל את ניסיון הכיול.
    4. שמור את הכיול על ידי לחיצה על "שמור כיול" בתחתית GUI הראשי (זה חוסך את הכיול הנוכחי עבור שני מניפולטורים ניתן לטעון בעתיד).
      הערה: שדה הראייה תחת הגדלה נמוכה (4 או 10X) וגבוה (40X) חייב להיות מיושר כדי כיול משני יפעל כהלכה. עיין במדריך למשתמש של המערכת האופטית הנמצאת בשימוש עבור הליכי היישור.

2. תיקון תיקון אוטומטי נוהל

  1. הכן פרוסות מוח חריפה, כפי שתואר לעיל 10 .
  2. הכן פיפטות זכוכית עבור מהדק תיקון.
  3. מקום אחד פרוסת המוח במרכז החדר ההקלטה. לייצב את הפרוסה עם פרוסה להחזיק למטה, או "נבל".
  4. זיהוי תא פלואורסצנטי.
    1. מצא את השטח של עניין תחת עדשה 4X. להזיז את הבמה מיקרוסקופ ידי הפעלת cliCk-to-Move ("CTM") ולחץ על מרכז אזור העניין. לחלופין, השתמש בלוח המקשים כדי להזיז את הבמה מיקרוסקופ (A / D - x- ציר, W / S - ציר Y, ​​R / F - Z- ציר).
    2. עבור עדשה הגדלה גבוהה ולהתאים את המיקוד על ידי הזזת המיקרוסקופ בציר z, באמצעות R / F על המקלדת.
      הערה: מומלץ להתאים את מפלס האמבט למים כך שמישור הפוקוס מתחת לעדשות הנמוכות והגדולות יהיה זהה או דומה בציר ה- z.
    3. לחץ על "זיהוי תא" כפתור בעמודה GUI הראשי, "יחידה 0." אם LED או מקור אור לייזר של ההתקנה לא יכול להיות נשלט על ידי אות TTL, להפעיל ידנית את LED / לייזר; חלון מוקפץ יופיע עם סיום זיהוי התא.
      1. כבה את LED / לייזר במידת הצורך; רשימה של קואורדינטות תא יופיע "זיכרון עמדות" GUI. הסר תאים לא רצויים מהרשימה על ידי לחיצה על הלחצן "X" ליד הקואורדינטות.
      2. לחלופין, אם תאים היעד אינם שכותרתו fluorescently, לחץ על "מצב עכבר" על GUI הראשי. לחץ על התא של עניין; נקודה צהובה עם מספר יופיע על התא, ואת הקואורדינטות של התא יופיעו "זיכרון עמדות" GUI.
  5. לכייל את פיפטה משנית.
    1. ממלאים 1/3 של פיפטה זכוכית עם פתרון פנימי. טען את פיפטה על בעל פיפטה המצורפת לשלב הראש.
    2. השתמש בעדשה בהגדלה נמוכה. להביא את פיפטה לשדה החזותי ולהתאים את המיקוד באמצעות לוח המקשים (H / K - x-axis, U / J- ציר Y, ​​O / L - Z- ציר). השתמשו ב- "1" ו- "2" כדי לעבור בין יחידה 1 ליחידה 2.
    3. טען את הכיול הראשי על ידי לחיצה על "טען כיול". לחץ על הלחצן "כיול משני" ב- GUI הראשי מתחת ליחידה הנמצאת בשימוש. לדוגמה, אם יחידה 2 נמצאת בשימוש, לחץ על הלחצן "כיול משני" ביחידה "Unit 2"לום. בצע את הוראות החלון המוקפץ כדי לעבור לעדשה בהגדלה גבוהה.
  6. תיקון תא מטרה.
    1. ודא כי "MultiClamp" ( כלומר מגבר) התוכנה פועלת. לחץ על כפתור "בקרת תיקון" כדי לפתוח את "בקרת תיקון" GUI; זה עלול לקחת עד כמה דקות כדי לפתוח את GUI.
    2. השתמש בעדשה הגדלה 40X על ידי סימון "40X" בעמודה GUI "יחידה 0" הראשי. לחץ על "עבור" כפתור ליד התא עניין על רשימת קואורדינטות ב "מיקום זיכרון" GUI; המיקרוסקופ יעבור לתא.
    3. לחץ על כפתור CTM של היחידה בשימוש ב- GUI הראשי כדי לאפשר תנועה לאחר לחיצה על העכבר. לחץ על התא של עניין; קצה פיפטה יעבור לתא.
    4. לחץ על כפתור "תיקון" על "בקרת תיקון" GUI.
      הערה: יתבצע תיקון אוטומטי, וניתן לפקח על הלחץ וההתנגדותאת "בקרת תיקון" GUI.
      1. השתמש בלחצן "יחידה 1 שנבחרה" כדי להחליף את אות הכניסה בין שתי היחידות.
        הערה: המערכת תתקרב לתא המטרה, תפעיל לחץ שלילי, תתאים לפוטנציאל הממברנה של התא ותזהה את היווצרות הגיגסאל על בסיס סדרה של לחץ וסף התנגדות והיגיון.
      2. לתפעל את התהליך האוטומטי בכל נקודה על ידי לחיצה על הכפתורים המתאימים על "בקרת תיקון" GUI. לדוגמה, לחץ על כפתור "תיקון" שוב כדי לבטל את תיקון התיקון ולחץ על "השלב הבא" כדי לקדם את תהליך התיקון לשלב הבא, ללא קשר לסף.
        הערה: חלון מוקפץ יודיע למשתמש כאשר נוצר gigaseal, ואת האפשרות להחיל zap יחד עם לחץ שלילי גדול יוצגו.
    5. בחר "כן" כדי לפרוץ עם zap בשילוב יניקה. לחלופין, בחר "לא" כדי לפרוץ עם יניקה בלבד.
      הערה: כאשר תיקון שלם של תאים מוצלחים הושלם, חלון מוקפץ יזכיר למשתמש לשמור את יומן התיקון לניסוי.
    6. שמור את יומן התיקון לניסוי.
      הערה: אם ניסיון תיקון אינו מצליח, חלון מוקפץ יודיע למשתמש ותהליך האיפוס יאופס.
    7. חזור לשלב 2.4 וחזור על השלבים בתא אחר.
  7. צמצם את סף התיקון (אופציונלי).
    הערה: סף עבור טווח התנגדות פיפטה הראשונית, לחץ חיובי ושלילי, התנגדות gigaseal, וכו ' . ניתן לשנות מקובץ תצורה.
    1. פתח את הקובץ "PatchControlConfiguration.csv" בתיקייה "תצורה" ביעד שבו המערכת מותקנת. שנה את המספרים המתאימים לכל ערך סף. אל תשנה את שמות הערכים; פעולה זו תביא לרשומות בלתי מזוהות במערכת.
    2. ליישם את ערכי הסף החדש מיד על ידי לחיצה על "CtRl + L "ללא הפעלה מחדש של התוכנית, הפעלה מחדש של התוכנית תיישם את ערך הסף החדש מהקובץ.

3. ביצוע הקלטות

הערה: מצב מגבר microelectrode נשלט על ידי המחשב ייקבע באופן אוטומטי ל - Clamp Current ("IC") על ידי תוכנת autopatcher לאחר תיקון מוצלח הושגה. כל תא תיקון קליפות הקלטות יכול להיעשות באמצעות תוכנת הקלטה של ​​בחירה (מערכת זו אינה כוללת פונקציית הקלטה). אם זיהו מספר תאי מטרה, לאחר סיום ההקלטה, חזרו לשלב 2.4 ונסו תא אחר.

  1. בצע ניסויים אוטומטיים של התרופה המקומית באמצעות picospritzer (אופציונלי).
    הערה: כאן, ניסוי מקומי יישום סמים משמש כדוגמה כדי לתאר כיצד להשתמש בפונקציה "רצף פקודה" נוספת כדי לשלוט בחומרה חיצונית באמצעות אותות TTL.
    1. התחבר יציאה ChaNel 0 והאדמה בלוח ה - DAQ המשני לקלט ההתחלה של ה - digitizer באמצעות כבל BNC חשוף (כמתואר בשלב 1.2.3). חיבור אחד ערוץ הפלט הדיגיטלי על digitizer ההדק חיצוני על picospritzer.
    2. הכן את picospritzer בהתאם להוראות השימוש. חבר את יציאת האוויר picospritzer לבעלים פיפטה סם התרופה המצורפת micromanipulator.
    3. טען פיפטה מלא סמים של בחירה. צרף אותו מחזיק פיפטה. לכייל את פיפטה, כמתואר בשלב 1.7.
    4. לאחר תיקון של תא כמתואר בשלב 2.6, בחר את המיקום הרצוי עבור משלוח סמים על ידי לחיצה על העכבר בתצוגה המצלמה GUI תחת "מצב העכבר" (מנותק מן GUI הראשי). לחלופין, השתמש "רשת" GUI לעיצוב רשת, עם כל פיקסל ברשת כאחד המיקומים היעד.
      הערה: הרשת יכולה להיות מניפולציה במצלמה להציג GUI על ידי גרירת עם העכבר.
    5. ב "פקודה Sequ, בחר את יחידת מניפולטור כי פיפטה סמים הוא רכוב על לחץ "לטעון נקודות העכבר" או "נקודות לטעון רשת" לייבא את כל הקואורדינטות עבור משלוח סמים.
      1. לחץ על כל ערך קואורדינטות כדי לערוך את הפקודה הספציפית TTL הפקודה בעמודה הימנית. בפקודה הראשונה, לחץ על הספרה הימנית ביותר כדי להפוך אותה מ "0" ל "1," שליחת אות 5 + V TTL. הגדר את הזמן (T) למשך האות הרצוי של TTL, ב- ms.
      2. בפקודת הפקודה השנייה, הגדר את כל הספרות ל - "0" והגדר את T למשך משך ההקלטה של ​​הניסוי. עריכת פקודות עבור כל ערכי הקואורדינטות. הוספת ערכי פקודה על ידי לחיצה על "+" אם יש צורך במספר אותות TTL.
        הערה: הספרות של 8 הספרות מייצגות יציאת ערוצים 0-7 על ה - DAQ המשני (יציאות 1 - 3 נמצאות על ידי המשאבה ושני שסתומים) ניתנות לשינוי, אם יש צורך.
    6. יצירת פרוטוקול ההקלטה במודול רכישת נתונים כךכי ההתחלה של מטאטא מופעלת על ידי מפעיל מפעיל חיצוני. ערוך את הפרוטוקול כדי לספק את התרופה בזמן הרצוי.
    7. ב "רצף פקודות" GUI, לחץ על "הפעלה" בצד שמאל כדי להפעיל את כל הקואורדינטות. לחלופין, לחץ על "הפעלה" בצד שמאל כדי להפעיל רק את הרצף שנבחר.
      הערה: פיפטה יעבור לכל קואורדינטה ולבצע את אות TTL כהגדרתו כדי להתחיל את ההקלטה להקליט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המערכת שלנו נבדקה על היכולת שלה תיקון תאים פרוסות מוח חריפה, עכבר המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) מובחנת לנוירונים, ו HEK 293 תאים באופן מלאכותי להביע ערוצים של עניין. איור 3 מראה ניסוי באמצעות Thy1-ChR2-YFP עכברים מהונדסים (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) מיקוד fluorescently שכותרתו שכבת 5 נוירונים פירמידליים בקליפה החזותית. תא המטרה היה אחד זיהו אוטומטית תאים ירוקים חיובי ניאון ( איור ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטה אוטומטית התמונה מונחה תיקון קלימפ הקלטות במבחנה . השלבים העיקריים בתהליך זה מסוכמים כדלקמן. ראשית, ראיית מחשב משמש באופן אוטומטי לזהות את קצה פיפטה באמצעות סדרה של תמונות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ. מידע זה משמש לאחר מכן לחשב את הפונקציה שינוי הקואורדינטות בין המיקרוסקופ לבין מערכות לתאם מניפולטור. ראיית מחשב משמש באופן אוטומטי לזהות תאים שכותרתו fluorescently כדי לזהות את הקואורדינטות שלהם. שלבים אלה משולבים עם מיקוד פיפטה ואלגוריתם תיקון אוטומטי באמצע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בקשה לפטנט לא זמני "מערכות ושיטות לאוטומציה ממוחשבת של תיקון אלקטרומגנטי אוטומטי ב- VITRO," מס 'קטלוגי: 15 / 353,719 בארה"ב, הוגש ב -16 בנובמבר 2016, Ref. לא. PRF 67270-02.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה על התמיכה הכספית של קרן וייטהול. ברצוננו להודות לסמואל ט 'קיסינג'ר על ההערות החשובות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מצלמת CCDQImagingRolera Bolt
Electrophysiology RigScientificaSliceScope Pro 2000כולל מיקרוסקופ ומניפולטורים. תוכנת בקרת המניפולטור שסיפק היצרן המודגמת בכתב יד זה היא " לינלאב 2".
מגברמכשירים מולקולרייםMultiClamp 700Bמגבר מיקרואלקטרודה מבוקר מחשב
Digitizerהתקנים מולקולרייםAxon Digidata 1550
מקור אור LEDמגניבpE-100אורך גל 488 ננומטר
לוח רכישת נתוניםמחשוב מדידהUSB1208-FSמשני DAQ.
ראה מדריך בכתובת: http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
שסתומי סולנואידThe Lee Co.
LHDA0531115H משאבת אווירתעשייה וירטואליתVMP1625MX-12-90-CH
חיישן לחץ אווירמוליכים למחצה בקנה מידה חופשיMPXV7025G
החזקתפרוסה מכשירי וורנר64-1415 (SHD-40/2)ערכת עוגן פרוסה, שטוחה לתא RC-40, 2.0 מ"מ, 19.7 מ"מ
PythonAnacondaגרסה 2.7 (32 סיביות לחלונות)https://www.continuum.io/downloads
מסופי בורגSparkfunPRT - 08084מסופי בורג 3.5 מ"מ פסיעה (2 פינים
) (2 פינים)
תעלת N MOSFET 60 V 30 ASparkfunCOM - 10213
שקעי DIP זנב הלחמה - 8 פיניםSparkfunPRT-07937
LED - אדום בסיסי 5 מ"מSparkfunCOM-09590
LED - ירוק בסיסי 5 מ"מSparkfunCOM-09592
שקע חשמל/מחבר חבית DC (SMD)SparkfunPRT-12748
ספק כוח מתאם קיר - 12 V DC 600 mASparkfunTOL-09442
חוט חיבור - מבחר (ליבה מוצקה, 22 AWG)SparkfunPRT-11367
נעילת זכר x נקבה x נקבה StopcockARK-PLASRCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 צינורות גמישיםFisher Scientific14-171-129קוטר חיצוני: 1/8 אינץ'
קוטר פנימי: 1/16 אינץ'.
BNC זכר ל BNC זכר כבל קואקסיאליBelkin ComponentsF3K101-06-E
560 Ohm נגד (5% סובלנות)Radioshack2711116
PicospritzerGeneral ValvePicospritzer II

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  2. Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
  3. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
  4. Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
  5. Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
  6. Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
  7. Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630(2013).
  8. Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
  10. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
  11. Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
  12. Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Automated Patch ClampImage Guided Patch ClampWhole Cell Patch ClampAcute Brain SlicesComputer Vision AlgorithmFluorescent Cell DetectionMicromanipulator ControlInternal Pipette PressureElectrical Resistance MonitoringGigaseal Formation

Related Articles