Method Article

שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין

DOI:

10.3791/56013

⸱

July 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas Health Science Center at Houston

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול מבוסס סינון לבודד גרעינים באיכות גבוהה מן הצלב המקושרים שריר השלד העכבר שבו הסרנו את הצורך ultracentrifugation, מה שהופך אותו ישים בקלות. אנו מראים כי הכרומטין מוכן מן הגרעינים מתאים immunoprecipitation הכרומטין וסביר הכרומטין immunoprecipitation רצף מחקרים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chromatin immunoprecipitation (שבב) היא שיטה רבת עוצמה כדי לקבוע מחייב חלבון ל- DNA הכרומטין. שריר השלד עשיר, עם זאת, כבר אתגר עבור שבב עקב קושי טכני בבידוד של גרעינים באיכות גבוהה עם זיהום מינימלי של myofibrils. פרוטוקולים קודמים ניסו לטהר גרעינים לפני הצלב המקשר, אשר נוטל את הסיכון של אינטראקציה DNA- חלבון השתנה במהלך תהליך הכנת גרעינים ממושכים. בפרוטוקול הנוכחי, אנחנו הראשונים לחצות את רקמת שריר השלד שנאספו עכברים, ואת הרקמות היו minced ו sonicated. מאז מצאנו כי ultracentrifugation לא היה מסוגל להפריד בין גרעינים מ myofibrils באמצעות צולבות צלב רקמות, אנו המציא הליך סינון רציף כדי להשיג גרעינים באיכות גבוהה ללא נטילת myofibril משמעותי. לאחר מכן הכינו הכרומטין באמצעות ultrasonicator, מבחני שבב עם נוגדן אנטי BMAL1 חשף מחייב היממה חזקדפוס של BMAL1 למקדמי הגן. פרוטוקול סינון זה מהווה שיטה הניתנת להחלה בקלות על מנת לבודד גרעינים באיכות גבוהה מרקמת שריר השלד הצולבת, ומאפשר עיבוד דגימה עקבי ללימודים היומיים והרגישים לזמן. בשילוב עם הדור הבא רצף (NGS), השיטה שלנו ניתן לפרוס למחקרים מכניסטיים גנומי שונים התמקדות תפקוד שרירי השלד.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שריר השלד משחק תפקידים חשובים בפיזיולוגיה והתנהגות. סיבי השריר רב נוקלאציה מורכבת myofibrils שבו אקטין ו מיוסין טופס יחידות פונקציונליות קרא sarcomeres לייצר כוח התכווצות. שריר השלד הוא גם האיבר המטבולי הגדול ביותר בגוף, חשבונאות עבור 80% לאחר גלוקוז הכנסה הכנסה ותגובה התגובה אינסולין הומאוסטזיס מטבולית 1 , 2 . פיזיולוגיה של שרירים ומטבוליזם מוסדרים היטב על ידי השעון היממה, שעון ביולוגי פנימי 3 , 4 , 5 , 6 . לדוגמה, המחיקה הספציפית של שריר השל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בבעלי חיים בוצע תחת טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת הוועדה (IACUC) הנחיות, והנהלים נערכו על פי פרוטוקול בעלי חיים שאושרו על ידי אוניברסיטת טקסס הבריאות המרכז ביוסטון.

1. בידוד גרעיני מן שרירי השלד הצלב

  1. לשקול ולכפות את שרירי הגפיים מאחורי שריר השלד, מבודדים מן כ 20 שבועות בשבוע C57BL / 6 עכברים זכר, ב פוספט קר כקרח שנאגרו מלוחים (PBS) כמתואר בפירוט בעבר 22 .
    הערה: בדרך כלל אנו מקבלים 1.0 - 1.5 גרם של שריר השלד מעכבר אחד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן ביצענו פורמלדהיד cross-linking מיד לאחר איסוף רקמה כדי לשמר בזמן אמת אינטראקציה DNA חלבון. עם זאת, מצאנו כי שיפוע סוכרוז או colloidal, נפוץ לבידוד גרעיני 23 , 24 , לא היה יעיל בהפרדת גרעינים מ myofibrils (נתונים לא מוצג). הסיבה עשויה להיות כי cross-linking העניק הכבידה דומה עבור גרעינים ו myofibrils. לכן, פיתחנו תהליך סינון סדרתי כדי להסיר ביעילות myofibrils גדול ופסולת אחרת חלק הגרעיני.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים שיטה חזקה שבה צולבות רקמות שריר השלד שימשו לבודד גרעינים באיכות גבוהה. סינון רציף בוצע על מנת להפריד באופן יעיל גרעינים מן פסולת, ואנרגיה אקוסטית קולי מן מתכון בצורת צלחת גזז את הכרומטין לניתוח CHIP. התוצאות הראו מחייב זמן ספציפי היממה של BMAL1 למקדמים היזמים.

שבב ניתן להשתמש כדי ללכוד תפוסה חלבון בזמן אמת על DNA גנומי כאשר cross-linking מתרחש. כדי לנצל את הפוטנציאל הזה, אנו נועדו לפתח שיטה כדי לאפ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים Karyn אסר, נובויה Koike ו Noheon פארק עצה מועילה. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי NIH / NIGMS (R01GM114424) ל- S.-HY, ו- Robert A. Welch Foundation (AU-1731) ו- NIH / NIA (R01AG045828) ל- ZC

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<תמיסת חזק>חומרים
פורמלדהידסיגמא אולדריץ'F8775 
גליציןפישר סיינטיפיקBP381-5
תמיסת טריפן כחולה (0.4%)Fisher Scientific15250061
RNase ASigma Aldrich10109142001
פרוטאז KSigma Aldrich
נוגדןנגד BMAL1נוצר בעוף (Cocalico Biologicals) כנגד אנטיגן aa 318 - 579, ו-IgY טוהר בזיקה באמצעות אותו אנטיגן. 
עוף IgY משקע שרףGenScriptL00405
<חזק>ציוד
KINEMATICA  פוליטרון PT2100 הומוגנייזר ספסלפישר סיינטיפיק08-451-178
15 מ"ל מטחנת רקמות DounceWhearton357544
מסנני תאי פלקון 100 ומיקרו; מפישר סיינטיפיק08-771-19
מסנני תאי פלקון 70 ומיקרו; מפישר סיינטיפיק08-771-1
מסנני תאי פלקון 40 ומיקרו; מפישר סיינטיפיק08-771-2
פלורימסננת 30 ומיקרו; mPluriSelect43-50030-03
pluriStrainer 20 ומיקרו; mPluriSelect43-50020-03
pluriמסננת 10 ומיקרו; mPluriSelect43-50010-03
Covaris S2 Covaris ממוקד-אולטראסוניקטורדגם S2
Labquake תרמו סיינטיפיקל
  Leica MicrosystemsDFC3000 G
Reagent Kit
DNA ערכת מיצוי DNAThermo ScientificK0691
Buffers
כל רכיבי המאגר מתוארים בפרוטוקול. כל רכיב נרכש מסיגמא אולדריץ'
עוף 3115887001 מצלמת מיקרוסקופ CCD C415110

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
  2. Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nuclei IsolationChromatin ImmunoprecipitationSkeletal MuscleCross linked TissueFiltration MethodChromatin PreparationSonication SettingsQPCR AnalysisCircadian BindingNGS Application

Related Articles