הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חשמל התקפים חולדות ו Fractionation של Hippocampi שלהם כדי לבחון תפיסה-induced שינויים בחלבונים Postsynaptic צפיפות

12K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56016

⸱

15 באוגוסט 2017

 ,  , 
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign

במאמר זה

סיכום

חשמל התקף (ECS) הוא מודל חיה ניסיוני של נזעי חשמל עבור דיכאון חמור. ECS מעוררת באופן גלובלי פעילות ההיפוקמפוס, המוביל synaptogenesis פלסטיות סינפטית. כאן, אנו מתארים שיטות עבור ה-ECS אינדוקציה בחולדות, fractionation subcellular של hippocampi שלהם כדי לבחון שינויים התקף-induced חלבונים סינפטיים.

תקציר

חשמל התקף (ECS) הוא מודל חיה ניסיוני של נזעי חשמל, הטיפול היעיל ביותר לטיפול בדיכאון חמור. ECS המניע מוכללת ויהיו clonic טוניקה עם התמותה נמוכה ומוות עצביים, הוא מודל נפוץ לתרופות אנטי-אפילפטי מסך. כאן, אנו מתארים שיטה אינדוקציה ECS ב אשר מועבר זרם 55-mA קצרה עבור 0.5 s כדי זכר חולדות 200-250 גר' במשקל באמצעות אלקטרודות האוזן-קליפ. גירוי דו צדדיים כאלה המיוצרים שלב 4-5 ויהיו clonic שנמשכה בערך 10 s. לאחר הפסקת ECS אקוטי או כרוני, שאם רוב חולדות משוחזרים בהתנהגותו לבין "אין תפיסה" חולדות. כי ECS מתרוממת באופן גלובלי פעילות מוחית, זה גם שימש כדי לבחון שינויים תלויי-פעילות של חלבונים סינפטיים והשפעתם על כוח סינפטית באמצעות מספר שיטות. בפרט, fractionation subcellular של צפיפות postsynaptic (PSD) בשילוב עם סופג המערבי מאפשר הקביעה כמותית של השפע של חלבונים סינפטיים-מבנה סינפטית מיוחד זה. בניגוד שיטה fractionation הקודם דורש כמות גדולה של המוח מכרסמים, נתאר כאן שיטה fractionation בקנה מידה קטן כדי לבודד את PSD מ hippocampi של עכברוש בודד, ללא סוכרוז צנטריפוגה הדרגתיות. באמצעות שיטה זו, אנו מראים כי השבר PSD מבודד מכיל חלבונים postsynaptic ממברנה, כולל PSD95, GluN2B ו- GluA2. סמן presynaptic synaptophysin, חלבון מסיס cytoplasmic α-טובולין נכללו השבר PSD, הוכחת בידוד PSD מוצלחת. יתר על כן, ECS כרונית ירד GluN2B ביטוי PSD, המציין כי שיטת fractionation שלנו PSD בקנה מידה קטן יכול להיות מיושם כדי לזהות את השינויים בחלבונים PSD בהיפוקמפוס מעכברוש יחיד לאחר טיפולים גנטיים, תרופתי או מכני .

מבוא

נזעי חשמל שימש לטיפול בחולים עם הפרעות דיכאון, כולל דיכאון עמיד לתרופות, דיכאון ביפולרי, פרקינסון מחלות של סכיזופרניה1,2. בטיפול זה, התקף נוצר על ידי גירוי חשמלי מועברים לראש המטופלים ומורדמת באמצעות epicranial אלקטרודות1,2,3. ניהול חוזרות של ECS כבר תועלת קלינית הפרעות דיכאון עמיד לתרופות-1,2,3. עם זאת, המכניזם המדויק שבבסיס יעילותם לטווח ארוך של האפקט נוגדות דיכאון אצל בני אדם נותר חמקמק. ECS במודל חיה של נזעי חשמל ומשמש באופן נרחב כדי לחקור את המנגנון הטיפולי. בחולדות, ECS אקוטי והן טיפול כרוני ECS לקדם נוירוג'נסיס למבוגרים ב hippocampi ולארגן מחדש את4,רשת עצבית5, שזה סביר לתרום לשיפור איכות על גמישות קוגניטיבית. יתר על כן, הרמה הכללית של פעילות מוחית על ידי ה-ECS הפיצולים השפע של תעתיקים, כגון מוח נגזר פקטור neurotropic6וחלבונים מרובות, כולל metabotropic גלוטמט קולטן 17 ו את N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) סוג גלוטמט קולטן subunits7. שינויים אלה מעורבים תיווכה שינוי לטווח ארוך של מספר סינפסה, מבנה והעוצמה ב8,7,9ההיפוקמפוס.

ECS דגמים, גירוי חשמלי מועבר מכרסמים באמצעות אלקטרודות stereotaxically מושתל, אלקטרודות הקרנית או אלקטרודות האוזן לעורר מוכללת ויהיו clonic טוניקה10,11. Stereotaxic השרשת אלקטרודות כרוך ניתוח מוח ודורש זמן ניכר לשיפור מיומנויות ניתוח של הנסיין כדי למזער את הפגיעה. אלקטרודות הקרנית פולשני פחות יכול לגרום שחיקה הקרנית ויובש, דורש הרדמה. השימוש של האוזן-קליפ אלקטרודות עוקף מגבלות אלה כי הם יכולים לשמש על מכרסמים ללא ניתוח או הרדמה, לגרום פגיעה מינימלית. אכן, אנחנו נמצא כי חולדות נמסור ער הנוכחי באמצעות אלקטרודות האוזן-קליפ אמינה גורם ויהיו clonic טוניקה שלב 4-5, הפיצולים חלבונים סינפטיים שלהם hippocampi10.

כדי לבחון את השפע ECS-induced של חלבונים סינפטיים באזורי מוח מסוימים המכרסמים, חשוב לבחור את שיטות נסיוניות המתאימים ביותר שלהם זיהוי, כימות. Fractionation subcellular של המוח מאפשר הבידוד גולמי של חלבונים מסיסים cytosolic; קרום חלבונים; אברון-גבולות חלבונים; ואפילו חלבונים קונסטרוקציות subcellular מיוחדים, כגון PSD12,13,14. PSD הוא תחום subcellular צפוף ומאורגן היטב בנוירונים שבו חלבונים סינפטיים הם מרוכז בבית, ליד ה13,12,ממברנה postsynaptic15. בידודו של PSD שימושית לצורך המחקר של חלבונים סינפטיים מועשר ב PSD, מאז שינויים דינמיים שפע ומתפקדים של רצפטורים גלוטמט postsynaptic פיגומים חלבונים, חלבונים התמרה חושית אות ב ה PSD12 , 15 , 16 , 17 נמצאים בקורלציה עם פלסטיות סינפטית, את synaptopathy נצפו הפרעות נוירולוגיות מספר17,18. בשיטת subcellular fractionation הקודם כדי לטהר את PSD מעורב הבידוד של השבר דטרגנט-לא מסיס מן השבר ממברנה גולמי של המוח על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית סוכרוז מעברי צבע14, 19. האתגר העיקרי בשיטה מסורתית זו הוא כי זה דורש כמויות גדולות של מכרסם המוח14,19. הכנה של 10-20 מכרסמים כדי לבודד את השבר PSD לכל טיפול דורש השקעה זמן ועלות נרחב, והוא לא ממש ריאלי. אם ישנם טיפולים רבים.

כדי להתגבר על האתגר הזה, לנו יש להתאים שיטה פשוטה יותר ישירות מבודד השבר PSD, ללא סוכרוז צנטריפוגה הדרגתיות20,21, ומתוקנים שזה יהיה ישים PSD בידוד מ hippocampi של עכברוש בודד המוח. שיטת fractionation בקנה מידה קטן שלנו PSD התשואות על 30-50 µg של החלבונים PSD של hippocampi 2, מספיק לשימוש מספר מבחני הביוכימי, כולל immunoprecipitation, סופג המערבי. סופג המערבי מדגים את ההצלחה של השיטה שלנו עבור בידוד של PSD חושף את העשרת של צפיפות postsynaptic חלבון 95 (PSD-95) להדרה של סמן presynaptic synaptophysin, חלבון מסיס cytoplasmic α-טובולין. שלנו ECS אינדוקציה ושיטות בקנה מידה קטן PSD fractionation בקלות לצורכי אזורים במוח מכרסמים אחרים ומספקים דרך יחסית פשוטה ואמינה כדי להעריך את ההשפעות של ECS על הביטוי של חלבונים PSD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים ניסיוני כולל נושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אוניברסיטת אילינוי באורבנה-שמפיין.

1. שמירה על מושבה עכברוש

  1. מתרבים חולדות ספראג-Dawley (ראה טבלה של חומרים) ולתחזק אותם בתנאים סטנדרטיים עם 12-h בהירה-כהה מחזור וגישה ad libitum מזון ומים.
  2. לגמול את הגורים עכברוש ביום כמחנכת (P) 28, אותם בקבוצות של 2-4 הארנבונים מאותה זכר או נקבה.
  3. סמן את הזנב של חולדות זכרים עם סמן קבוע רעיל שחור עבור זיהוי.
  4. שוקל לעכברושים הזכר 3 פעמים בשבוע ולהקליט את bodyweights שלהם.

2. הכנת מכונת ECS

  1. ב- 7:30 בבוקר, לחטא את הספסל בחדר הכנת בעלי חיים ולמקם מכונת ECS (מחולל הפעימה) על הספסל.
  2. המקום עכברוש גברים בודדים במשקל של 200-250 גרם בתוך כלוב נקי, ריק עם מכסה. חזור על זה עבור כל זכר העכברושים שיתייחסו אליו ECS אינדוקציה. תן את החולדות habituate למשך 30 דקות.
  3. בעת החולדות הם habituating בכלובים שלהם, להגדיר גנרטור הדופק עבור ה-ECS אינדוקציה על תדירות פולסים בשנייה 100, רוחב הדופק של 0.5 ms, משך הלם של 0.5 s, זרם של 55 mA (איור 1א').
  4. הכן את הגנרטור דופק על ידי ללחוץ על הכפתור "RESET" ולהבטיח כי לחצן "מוכן" מואר. ודא כי הקליפים האוזן לא צורפו גנרטור דופק ולאחר מכן הקש על כפתור "הלם" לכמה שניות.
    הערה: בשלב זה, הגנרטור הדופק הוא מוכן ECS אינדוקציה.
  5. חבר את הקליפים האוזן הגנרטור דופק.

3. אינדוקציה של ECS חריפה

הערה: ראה איור 1ב', בראש החלונית.

  1. להרטיב את הקליפים האוזן עם סליין סטרילי ולהבטיח כי הם רוויים.
  2. רטוב האוזניים של חולדה עם סליין סטרילי על ידי ליפוף אותם בתוך תמיסת מלח ספוג גזה. פעם אחת הם רטובים, להסיר את הגזה.
  3. לצרף קליפ אחד לכל אוזן, עמדה מעבר הלהקה הסחוס המרכזי.
  4. לאשר על המכונה ECS לולאה נכון מוקמת. אם לא, הודעת שגיאה או קריאה של "1" יופיע על המכונה.
  5. לובש כפפה עבה, -מטאל בעוד אתה מחזיק את החולדה בעדינות ביד בכפפה, לחץ על לחצן "הלם" לכמה שניות ולשחרר לאט האחיזה על החולדה לבחון את ההתקף. עבור המזויף "אין תפיסה" (NS) לשלוט, להתמודד עם החולדה באופן זהה אך אינם מספקים הנוכחי.
  6. נתק את הקליפים האוזן כמו קלונוס מתחיל ולהקליט את התנהגות פרכוס בהתאם מידה של ראסין המתוקן22 הכולל "הפה ותנועות פנים" (שלב 1), "ראש מהנהן" (שלב 2), "forelimb קלונוס" (שלב 3), "לגידול עם קלונוס forelimb" (שלב 4), ו "לגידול ונופל עם קלונוס forelimb" (שלב 5). ההתקף אמור להספיק כ 10 s; להקליט את משך ההתקף באמצעות שעון עצר.
  7. בעקבות סיום ההתקף, להחזיר את החולדה בכלוב בבית. לפקח על העכברוש עבור עוד 5 דקות לוודא על החלמתו של העכברוש של ההתקפים. לשמור את זה שוכן ביחידים בכלוב ולחזור הכלוב לחדר ההתאוששות.
  8. חזור על אינדוקציה ECS על החולדה הבא.
  9. לפקח על החולדות ברחבי השארית של היום, לפחות פעם אחת בבוקר, פעם אחת בצהריים למחרת עד שהם מורדמים לניסויים.
    הערה: השיטה אינדוקציה ECS עלול להוביל סימנים קליניים כמו אפקט לוואי נלווים, אשר דורש תשומת לב. לדוגמה, פרוטוקול אינדוקציה ECS יכול לגרום התקפים יותר 15 s ולגרום מיותרים מצוקה לעכברושים. במקרה זה, לסיים את ההתקף באמצעות דיאזפם (10 מ"ג/ק"ג, i.p.) או פנטוברביטל (25-30 מ"ג/ק"ג, i.p.). אם החולדות לפתח מצוקה נשימתית או חריגות התנהגותית חמורה בעקבות תפיסה הפסקת, המתת חסד אותם על ידי שאיפת פחמן דו-חמצני ואחריו עריפת ראש.

4. אינדוקציה של ECS כרונית

הערה: ראה איור 1B, החלונית התחתונה.

  1. זירוז ECS אחת ליום במקביל בבוקר כפי שתואר בשלבים 1-3 לעיל, במשך שבעה ימים רצופים.
  2. צג העכברושים פעמיים ביום לאחר קבלתן לבית שלהם בכלובים.

5. המגון ו- Fractionation של עכברוש Hippocampi

הערה: ראה באיור 2.

  1. הכנת מאגר המגון טריים (פתרון A) המכיל סוכרוז 320 מ"מ, 5 מ"מ נתרן רב-תכליתי, 1 מ"מ EDTA, 10 מ מ HEPES pH 7.4, 200 ננומטר okadaic חומצה, מעכבי פרוטאז. מסנן-לעקר את המאגר באמצעות מסננים עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.22 עבור סינון ואקום ומניחים אותו על קרח.
  2. בזמן נתון הצבע בעקבות ECS חריפה או כרונית ECS (איור 1), המתת חסד העכברוש באמצעות אינהלציה2 CO למשך 5-10 דקות, ואחריו עריפה באמצעות גיליוטינה.
  3. מסירים את המוח ומנתחים את hippocampi בצלחת מתכת המוטלות על קרח, כפי שתואר לעיל23,24.
  4. מקום שני hippocampi של עכבר אחד על תרביות רקמה 30 מ מ צלחת, מינצ אותם לחתיכות קטנות בעזרת מספריים.
  5. להעביר את hippocampi טחון מהמגן זכוכית ידני באמצעות פיפטה של 1 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל המאגר הקר המגון (פתרון A, שלב 5.1). הכנס כבעלי עגול מהמגן זכוכית. בעוד מהמגן זכוכית על קרח, בעדינות ובזהירות קו למעלה ולמטה על איחדו 10 - 15 פעמים עבור 1 דקות, עד חתיכות קטנות של רקמות בהיפוקמפוס להיעלם.
  6. להעביר את homogenate צינור microcentrifuge 1.7 mL באמצעות פיפטה של 1-mL, centrifuge את homogenate ב g 800 x 10 דקות ב 4 ° C כדי להפריד את תגובת שיקוע postnuclear (S1 שבר) מ גלולה המכילה רקמות לא מסיסים, גרעינים (P1 שבר). להעביר שני צינורות microcentrifuge של mL 1.7 נפרדים, חדש, באמצעות פיפטה 1 מ"ל 50 µL ו µL 950 של השבר S1 ולאחסן הצינורות האלה על קרח. שמור בגדר שבר P1 על קרח.
  7. Centrifuge השבר S1 (950 µL) למשך 10 דקות-13,800 x g ו- 4 ° C כדי להפריד את תגובת שיקוע (S2 שבר), מועשר חלבונים cytosolic מסיסים, ולא בגדר (שבר P2), מועשר מאוגד-קרום חלבונים, כולל חלבונים synaptosomal. להעביר את השבר S2 microcentrifuge 1.7 mL החדש באמצעות פיפטה 1-mL ואחסן אותו בקרח.
  8. Resuspend בגדר (שבר P2) ב- 498 µL של קרח מים מטוהרים באמצעות פיפטה של 1-mL. להוסיף 2 µL של מ' 1 HEPES (pH 7.4) באמצעות פיפטה 20 µL כדי להשיג ריכוז סופי של 4 מ מ HEPES (pH 7.4). דגירה ב 4 ° C עם עצבנות 30 דקות לחנות השבר P2 resuspended על הקרח.
  9. לקבוע את ריכוז חלבון ו- S1, S2, ואת וזמינותו P2 שברים בעזרת של BCA. להוסיף 50 מ מ HEPES (pH 7.4) כל שבר להשיג ריכוז 1 מ"ג/מ"ל ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש, או לעבד את השבר P2 כדי לבודד את PSD.

6. בידוד של PSD של השבר חלבון (P2) ממברנה גולמי

  1. Centrifuge השבר P2 (500 µL) במשך 20 דקות ב- 25,000 x g ו- 4 ° C כדי להפריד את תגובת שיקוע lysed (LS2 שבר) ולא בגדר lysed (LP1 שבר). להעביר את השבר LS2 1.7 mL microcentrifuge צינור באמצעות פיפטה 1 מ"ל ואחסן אותו בקרח.
  2. Resuspend בגדר LP1 ב 250 µL של 50 מ מ HEPES (pH 7.4) מעורבב עם 250 µL של 1% סבון 1 x PBS המאגר באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. דגירה ב 4 ° C עם עצבנות עדין למשך 15 דקות.
  3. Centrifuge בגדר LP1 resuspended עבור 3 h ב- 25,000 x g ו- 4 ° C כדי להפריד את תגובת שיקוע (שבר שאינו-PSD) בגדר (PSD שבר). הסר את תגובת שיקוע לרכבת התחתית microcentrifuge 1.7-mL, resuspend בגדר PSD ב 100 µL של 50 מ מ HEPES (pH 7.4) באמצעות פיפטה 200 µL.
  4. לקבוע ריכוז חלבון של LS2, הלא-PSD, שברים PSD באמצעות וזמינותו של BCA. להוסיף 50 מ מ HEPES (pH 7.4) כל שבר להשיג ריכוז 1 מ"ג/מ"ל ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
    הערה: כל הפתרונות בשימוש שלבים 5-6 (קרי, פתרון A מאגר HEPES, מאגר PBS) צריכה להיעשות עם מים מורתחים ללא מזהמים יוניים ואורגניים וחלקיקים.

7. המערבי סופג

  1. הפשרת כל שבר חלבון על קרח. העברת µL 12 של כל שבר (S2, P2 ו PSD של 1 מ"ג/מ"ל) מ ל 1.7 microcentrifuge צינור באמצעות פיפטה 20-µL.
  2. הוסף µL 3 5 x מרחביות דוגמת המאגר, דגירה ב 75 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמבט מים. מגניב הדגימה עד לטמפרטורת החדר (RT).
  3. לטעון µL 10 המדגם החלבון לתוך כל טוב של 4-20% מסרק 15-ובכן הדרגתיות מרחביות-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) ג'ל באמצעות פיפטה 20 µL. להפעיל את הג'ל במנגנון מרחביות-דף ו- 80-100 V פועל מאגר (25 מ מ טריס, 190 מילימטר גליצין ו- 0.1% מרחביות; pH 8.3).
    הערה: כל הג'ל צריך להכיל חלבון דגימות NS עכברים וחולדות ECS בנקודות זמן שונות בעקבות ECS אקוטי או כרוני.
  4. העברת החלבונים מהעמוד מרחביות ג'ל קרום פוליוויניל difluoride (PVDF) במנגנון העברה-25-30 V (60 mA) עבור 9-12 h במאגר העברה (25 מ מ טריס, 190 מילימטר גליצין ו- 20% מתנול; pH 8.3).
  5. הסרת קרום PVDF מנגנון העברה ולשטוף אותו בתוך באגירה טריס תמיסת מלח (TBS) למשך 5 דקות על מסובב רב תכליתי-RT.
  6. לחסום את הקרום בחלב 5% ו- 0.1% Tween-20 ב- TBS עבור ה 1 דגירה זה ב ראשי נוגדנים (טבלה 1) במאגר כביסה (חלב 1% ו- 0.1% Tween-20 ב- TBS) לילה על מסובב רב-תכליתי ב 4 ° C (ראה את הטבלה של חומרים דילולים).
  7. לשטוף את הקרום 4 פעמים למשך 10 דקות כל במאגר לשטוף, ואז דגירה זה עם חזרת peroxidase (HRP)-מצומדת נוגדנים משניים של כביסה מאגר מאובטח על מסובב רב תכליתי-RT.
  8. לשטוף את הקרום 4 פעמים למשך 10 דקות כל במאגר לשטוף, ואז עם TBS במשך 5 דקות.
  9. דגירה הקרום עם סובסטרט chemifluorescence משופרת עבור 1 דקות, לחשוף אותם בפני לסרטי רנטגן. לפתח את הסרט חשוף עם מעבד הסרט.

8. כימות שהכלים המערבי

  1. סריקה המערבי כתם כקובץ TIFF, שמור את הקובץ במחשב.
  2. פתח בקובץ תספיג בתוכנית ImageJ כמו תמונה בגווני אפור, תחת "קובץ," 'פתח תמונה,' חץ ימינה 'גווני אפור'.
  3. בחרו בכלי בחירה מלבנית מסרגל הכלים ImageJ, צייר מלבן שמכסה להקת יחיד תספיג חלבון עניין.
  4. תחת "נתח," מכה "מדידה" כדי להשיג את האזור ואת הצפיפות אכזרי של להקה שנבחרה.
  5. להעביר את המלבן על אזור רקע מבלי לשנות את הגודל והצורה שלה. חזור על שלב 8.4 לאזור ואת הצפיפות אכזרי של רקע.
  6. להחסיר את ערך הדחיסות אכזרי של להקת הרקע של להקת תספיג, נותן את צפיפות הלהקה המופחת-רקע של החלבון עניין.
  7. חזור על שלבים 8.2-8.6 ללהקות תספיג כל עניין.
  8. לחלק את הצפיפות הלהקה המופחת-רקע של החלבון עניין על ידי צפיפות הלהקה המופחת-רקע של מוצר ג'ין משק בית, כגון α-טובולין; שלב זה מניב הערך המנורמל של החלבון עניין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות ההליך מפורט המובאים כאן, אחד מכת חשמל (55 אמא, 100 פולסים בשנייה עבור 0.5 s) מועברת באמצעות האוזן-קליפ אלקטרודות המושרה הבמה ובקשה ויהיו clonic טוניקה 4-5 בחולדות (איור 1א-ב). 8 סה של חולדות התקבל אינדוקציה ECS חריפה ומוצגים ויהיו clonic טוניקה שלב 4-5. ההתקפים נמשך בערך 10 s, ואת כל העכברושים התאושש תוך 1-2 דקות של תפיסה הפסקת. דמה "אין תפיסה" חולדות לא קיבלה הלם חשמלי, לכן מציג התקפים. סכום כולל של 4 עכברי דמה שימשו. עבור אינדוקציה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מתארים בשיטת אינדוקציה ECS בחולדות מעורר גירוי כללי של הפעילות העצבית שלהם hippocampi. ECS הוא במודל חיה של נזעי חשמל, אשר נמצא בשימוש קליני לטיפול הפרעות דיכאון עקשן בסמים אצל בני אדם1,2,3. למרות השימוש נזעי חשמל לטיפול בדיכאון חמור, המנגנון הבסיסי המדויק עדיין לא ברור. כי ה-ECS גורם אנטי-depressant-כמו בהתנהגויות של מכרסמים ומעוררת נוירוג'נסיס בהיפוקמפוס4,32, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

המחברים תודה ומאפשר לנו להשתמש צנטריפוגה שלו fractionation, ד ר גראהם ה Diering במעבדה של ד ר ריצ'רד ל' Huganir באוניברסיטת ג'ון הופקינס סיפק לנו הפרוטוקול בקנה מידה קטן עבור fractionation PSD ד ר אריק ג בולטון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חולדת Spargue-Dawleyצ'ארלס ריברECS מספקת
מחולל דופקUgo Bsile, קומריו, איטליה57800ECS מספקת
מערכת טיהור מים MilliQEMD MilliporeZ00Q0VWWאספקת פיצול תת-תאית
סוכרוזEm scienceSX 1075-3אספקה
תת-תאיתNa4O7P2SIGMA-ALDRICH221368 אספקת פיצול תת-תאי
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SIGMA-ALDRICHE9884אספקת פיצול תת-תאי
HEPESSIGMA-ALDRICHH0527אספקת פיצול תת-תאי
חומצה אוקדאיתTOCRIS1136אספקה תת-תאית
מעכב עצירת פרוטאזThermo Scientific78429אספקת פיצול תת-תאי
NaVO3>SIGMA-ALDRICH72060אספקת פיצול תת-תאי
EMD Millipore Sterito מסנני בקבוק ואקום סטרילייםפישר סיינטיפיקSCGPS05REציוד פיצול תת-תאי
מספרייםאיריס WPI (דיוק עולמי מכשירים)500216-Gאספקת פיצול תת-תאי
צלחת תרבית רקמות 30 מ"מפישר סיינטיפיק08-772Bאספקת פיצול תת-תאי
הומוגנייזר זכוכית ועלי טפלוןVWR89026-384אספקת פיצול תת-תאי
1.7 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגהDENVILLE SCIENTIFIC, INC. C2170 (1001002)ספקי פיצול תת-תאיים
צנטריפוגה Sorvall Legend XT/XF Thermo Fisher75004521אספקת פיצול תת-תאי
מגיב בדיקת חלבון Pierce BCA מגיב A, 500 מ"לThermo Fisher#23228אספקת כתם מערבי
מגיב לבדיקת חלבון Pierce BCA B, 25 מ"לThermo Fisher#1859078אספקת כתם מערבי
SDS-פוליאקרילאמיד ג'ל (SDS-PAGE)BIO-RADאספקת כתם מערבי
פועלת בופרתוצרת המעבדהאספקת כתמים מערביים. 
תא אלקטרופורזה אנכי Mini-PROTEAN Tetra עבור ג'לים MiniPrecast, 4 ג'לBIO-RAD#1658004כתם מערבי מספק
ממברנת פוליוויניל דיפלואוריד (PVDF) MiliporeIPVH00010Western blot Supplies
Transfer Bufferתוצרת המעבדהWestern blot Supplies. 
Tris-baseFisher ScientificBP152-1Western blot supplies
GlycineFisher ScientificBP381-5Western blot supplies
נתרן דודציל סולפטSIGMA-ALDRICH436143Western blot מספק
מתנול פישר סיינטיפיקA454-4כתם מערבי מספק
טריטון X-100פישר סיינטיפיקBP151-500חומר ניקוי לבידוד PSD
מודול מיני טרנס-בלום BIO-RAD#1703935אספקת כתמים מערביים חלב
יבש מיידי ללא שומןערךאספקה לכתמים מערביים
מסובב רב תכליתי Thermo ScientificModel-2314Western blot blot
מספק Hyblot CL אוטורדיוגרפיה סרטDENVILLE SCIENTIFIC, INC. E3018 (1001365)חומרים מתכלים לכתמים מערביים
מצע כימיפלואורסצנטי משופר Thermo Scientific32106Western blot מספק
מעבד סרטים Konica SRX-101AKONICA MINOLTASRX-101AWestern blot מספק
שם של נוגדן
PSD-95איתות תאים#2507דילול נוגדנים = 1:500 - 1,000, זמן = 9 - 12 שעות, טמפרטורת תגובה = 4 & מעלות; C, מין מארח =
איתות תאיסינפטופיזין#4329דילול נוגדנים = 1:500 - 1,000, זמן = 9 - 12 שעות, טמפרטורת תגובה = 4 & מעלות; C, מין מארח = ארנב
אלפא-טובוליןSantacruzSC-5286דילול נוגדנים = 1:500 - 1,000, זמן = 9 - 12 שעות, טמפרטורת תגובה = 4 & מעלות; C, מין מארח = עכבר
GluN2BNeuromab75-097דילול נוגדנים = 1:500 - 1,000, זמן = 9 - 12 שעות, טמפרטורת תגובה = 4 & מעלות; C, מין מארח = עכבר
GluA2Sigma-aldrichSab 4501295דילול נוגדנים = 1:500 - 1,000, זמן = 9 - 12 שעות, טמפרטורת תגובה = 4 & מעלות; C, מין מארח = ארנב
STEPSantacruzSC-23892דילול נוגדנים = 1:200 - 500, זמן = 9 - 12 שעות, טמפרטורת תגובה = 4 & מעלות; C, מין מארח = עכבר
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory715-035-150דילול נוגדנים = 1:2,000-5,000, זמן = 1 שעה, טמפרטורת תגובה = RT, מין מארח = חמור
פרוקסידס AffiniPure חמור אנטי-ארנב IgG (H+L)מעבדת Jackson ImmunoReserch711-035-152דילול נוגדנים = 1:2,000-5,000, זמן = שעה אחת, טמפרטורת תגובה = RT, מין מארח = חמור
מעבדות #4561086S בעלת רב של ארנב

מקורות

  1. Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
  2. McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
  3. Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
  4. Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869(2013).
  5. Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
  6. Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
  7. Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
  8. Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
  9. Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
  10. Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
  11. Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230(2016).
  12. Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
  13. Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
  14. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
  15. Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
  16. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  17. Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
  18. Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
  19. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896(2014).
  20. Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
  21. Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
  22. Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
  23. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269(2007).
  24. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
  25. Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
  26. Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
  27. Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
  28. Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
  29. Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
  30. Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
  31. Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
  32. Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
  33. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  34. Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
  35. Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
  36. Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
  37. Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
  38. Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
  39. Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
  40. Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
  41. Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
  42. Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
  43. Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
  44. Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
  45. Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
  46. Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

פרכוסים חשמלייםפרקציונציה של ההיפוקמפוסWestern Blottingניתוח חלבונים סינפטייםביטוי של GluN2Bזיהוי PSD95פרקציונציה בקנה מידה קטןבידוד ההיפוקמפוסהשראת פרכוסים
חשמל התקפים חולדות ו Fractionation של Hippocampi שלהם כדי לבחון תפיסה-induced שינויים בחלבונים Postsynaptic צפיפות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.