כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור ללא דטרגנט המגון בתרבית תאים בתרבית של מבוסס על חנקן קוויטציה עוקבות הפרדת חלבונים cytosolic ואת קרום מאוגד על-ידי ultracentrifugation. שיטה זו היא אידיאלית עבור ניטור חלוקה למחיצות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין מסיסים ושברים ממברנה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים בתרבית שימושיים ללימוד ההתפלגות subcellular של חלבונים, כולל ממברנה פריפריאלי חלבונים. גנטית מקודד fluorescently חלבונים מתויג מהפכה בחקר התפלגות חלבון subcellular. עם זאת, קשה לכמת את ההתפלגות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, במיוחד כאשר חלבונים הם cytosolic חלקית. יתר על כן, חשוב תדירות ללמוד חלבונים אנדוגני. מבחני ביוכימיים כגון immunoblots נשארים תקן הזהב על כימות של חלבון הפצה אחרי subcellular fractionation. למרות שיש קיטים מסחריים שואפים לבודד cytosolic או שברים קרום מסוימים, רוב ערכות אלה מבוססים על חילוץ עם דטרגנטים, אשר עשויים להיות מתאימים ללמוד חלבוני ממברנה פריפריאלי בקלות שחולצו מן ממברנות. כאן אנו מציגים עבור הסלולר המגון פרוטוקול ללא חומרי ניקוי על-ידי חנקן קוויטציה עוקבות הפרדת חלבונים cytosolic ואת קרום מכורך מאת ultracentrifugation. אנחנו לאשר את ההפרדה של organelles subcellular ב מסיסים ושברים גלולה בכל סוגי התאים, והשווה חלבון החילוץ בין מספר שיטות מקובלות שאינן מבוססות על חומרי ניקוי המגון מכני. בין מספר יתרונות של חנקן קוויטציה הוא יעילות מעולה של שיבוש הסלולר עם מינימום נזק פיזי וכימי organelles עדין. בשילוב עם ultracentrifugation, חנקן קוויטציה זו שיטה מצוינת לבחון את השינוי של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין cytosolic ושברים ממברנה.
מבוא
החלבונים ניתן לחלק לשתי קבוצות: אלה המשויכות ממברנות ואלה שאינם. Non-הממברנה חלבונים הקשורים נמצאים ציטוזול, נוקלאופלזמה, לומינה של organelles כגון תוך-פלזמית (ER). ישנם שני סוגים של חלבונים הקשורים ממברנה, נפרד ואת היקפי. חלבוני ממברנלי אינטגרלי מכונים גם חלבונים transmembrane כי אחד או יותר חלקי פוליפפטיד משתרע על הקרום, בדרך כלל בתור מורכב של חומצות אמינו הידרופוביות סליל α. חלבונים transmembrane co-translationally מוכנסים לתוך ממברנות במהלך ביוסינטזה שלהם ולהישאר שתצורתו נקבעה כל כך עד שהם אינם catabolized. חלבוני ממברנה פריפריאלי מונעים בגיחות לממברנות, בדרך כלל בעקבות השינוי post-translational עם מולקולות הידרופוביות כגון שומנים. בניגוד ממברנלי אינטגרלי חלבונים,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1-מאגר וההכנות ציוד
- להירגע 45 מ ל תא הפרעה פצצות 15 מ"ל צינורות, צינורות ultracentrifugation ב-4 מעלות צלזיוס
- הכן ולהירגע 25 מיליליטר המגון מאגר לכל התאים 7 2 x 10-4 מעלות צלזיוס. הוסף פרוטאז מעכב טבליה אחת רק לפני השימוש.
הערה: מאגרי המגון מכילים אשלגן כלורי בדרך כלל יותר מאשר NaCl טוב יותר לשקף את הרכב מלח תאיים. מאגר המגון בשימוש פרוטוקול זה מורכב מ 10 מ מ HEPES ב- pH 7.4, 10 מ"מ אשלגן כלורי ו 1.5 מ"מ MgCl 2 (המכונים להלן מאגר המגון היפוטוניק). רוב מאגרי יכול להיות מותאם קוויטציה חנקן (ראה דיון). - הכן ולהירגע 6 מ של 1 x Phosphate-Buffered מלוחים (PBS) מאגר עבור דגימה-4 מעלות צלזיוס. הוסף פר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2 מציג את חלוקת החלבונים של מערכת העצבים ההיקפית לתוך שבר cytosolic מסיסים (S) או שבר צניפה ממברנה (P). בדקנו שלוש שורות תאים נציג מכל סוגי תאים שונים: HEK-293 (אפיתל) NIH-3T3 (פיברובלסט), Jurkat (לימפוציטים). רו גואנין דיסוציאציה מעכב (RhoGDI), ללא תלות הקטיון מנוז-6-פוספט קולטן (CIMPR) שימשו בקרים חיוביים ל cytosolic ושברים ממברנה, בהתאמה. אישרנו את ההפרדה יעיל של ציטוזול ואת קרום לאחר חנקן קוויטציה ב ~ 350 psi במאגר היפוטוניק ואחריו ultracentrifugatio.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היתרונות של חנקן קוויטציה על פני שיטות אחרות של שיבוש מכני הן מגוונות. אולי היתרון המשמעותי ביותר הוא היכולת שלה בעדינות אך ביעילות homogenize דגימות. העקרונות הפיזי של דגימות מתקרר הלחץ במקום ביצירת הנזק חימום מקומי כמו אולטרה סאונד, חיכוך/הטיה המבוסס על טכניקות. קוויטציה הוא גם יעיל מאוד-שיבוש קרום פלזמה. מכיוון חנקן נוצרות בועות בתוך כל תא בודד על ביטול דחיסה, תהליך קוויטציה מוגבל פחות לפי גודל התא, לטעום גודל או לטעום ריכוז. לכן הוא מציע יתרונות נוספים על פני דאונס מבוסס-אישור או מחט מעבר המגון. חנקן קוויטציה מציע גם.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
עבודה זו מומן על ידי GM055279, CA116034 ו- CA163489.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| כלי שיבוש תאים (45 מ"ל) | מכשיר Parr | 4639 | הומוגנייזר פצצת קוויטציה חנקן |
| (2 מ"ל) | קונטס | 885300-0002 | עלי וצינור Dounce |
| U-100 מזרק אינסולין 28G½ | Becton Dickinson | 329461 Needle | |
| Atg12 נוגדן | Santa Cruz | 271688 | נוגדן עכבר, השתמש ב-1:1000 דילול |
| ובטא;-נוגדן אקטין | Santa Cruz | 47778 | נוגדן עכבר, השתמש ב-1:1000 דילול |
| ובטא;-נוגדן טובולין | DSHB | E7-s | נוגדן עכבר, השתמש ב-1:5000 דילול |
| נוגדן Calnexin | Santa Cruz | 23954 | נוגדן לעכבר, שימוש בדילול 1:1000 |
| נוגדן Calregulin | Santa Cruz | 373863 | נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000 |
| דילול נוגדן קטלאז | Santa Cruz | 271803 | נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000 דילול |
| נוגדן CIMPR | Abcam | 124767 | נוגדן ארנב, שימוש ב-1:1000 דילול |
| EEA1 נוגדן | Santa Cruz | 137130 | נוגדן לעכבר, שימוש בדילול 1:1000 |
| נוגדן EGFR | Santa Cruz | 373746 | נוגדן עכבר, שימוש בדילול 1:1000 |
| F0-ATPase נוגדן | Santa Cruz | 514419 | נוגדן עכבר, שימוש בדילול 1:1000 |
| F1-ATPase נוגדן | Santa Cruz | 55597 | נוגדן עכבר, שימוש בדילול 1:1000 |
| נוגדן | פיברילריןנוגדן עכבר סנטה קרוז | 374022 | שימוש ב-1:200 דילול |
| גולג'ין 97 נוגדן | סנטה קרוז | 59820 | נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000 |
| דילול נוגדן HDAC1 | סנטה קרוז | 81598 | נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000 |
| דילול Hexokinase 1 נוגדן | איתות תאים | 2024S | נוגדן ארנב, שימוש ב-1:1000 |
| דילול Lamin A/C נוגדן | נוגדן עכבר סנטה קרוז | 376248 | השתמש בדילול 1:1000 |
| נוגדן LAMP1 | DSHB | H4A3-c | נוגדן עכבר, השתמש בדילול 1:1000 |
| Na+/K+ נוגדן ATPase | Santa Cruz | 48345 | נוגדן עכבר, השתמש בדילול 1:1000 |
| נוגדן Rab7 | Abcam | 137029 | Rabbit, השתמש בדילול 1:1000 |
| Rab9 נוגדן | Thermo | MA3-067 | נוגדן לעכבר, שימוש ב-1:1000 דילול |
| RCAS1 נוגדן | Santa Cruz | 398052 | נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000 |
| דילול נוגדן RhoGDI | Santa Cruz | 360 | נוגדן ארנב, שימוש ב-1:3000 |
| דילול חלבון ריבוזומלי S6 נוגדן | Santa Cruz | 74459 | נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000 דילול |
| נוגדן Sec61a | Santa Cruz | 12322 | נוגדן עיזים, שימוש ב-1:1000 דילול |
| אולטרה-צנטריפוגה פוליקרבונט עבה דופן | בקמן קולטר | 349622 | צינור לדוגמא לאולטרה-צנטריפוגה |
| רוטור TLK-100.3 | רוטור 349481 בקמן קולטר | לאולטרה-צנטריפוגה | |
| אופטימה MAX אולטרה-צנטריפוגה אישית בעלת קיבולת גבוהה | בקמן קולטר | 364300 | אולטרה-צנטריפוגה |
| cOmplete מעכב פרוטאז טבליות קוקטייל | מעכבי פרוטאז | Roche | 11697498001 |
| מגרדי תאים עם ידית 25 ס"מ ולהב 3.0 ס"מ | קורנינג | 353089 | מגרד תאים גדול |
| מגנטי Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | מיקרו ערבוב בר |
| קרמיקה-למעלה בוחש מגנטי | פישר S504501AS | מערבל מגנטי |
מקורות
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
- Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequen....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
