הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית

16.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56037

⸱

18 באוגוסט 2017

 , 
1Langone Medical Center, New York University

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור ללא דטרגנט המגון בתרבית תאים בתרבית של מבוסס על חנקן קוויטציה עוקבות הפרדת חלבונים cytosolic ואת קרום מאוגד על-ידי ultracentrifugation. שיטה זו היא אידיאלית עבור ניטור חלוקה למחיצות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין מסיסים ושברים ממברנה.

תקציר

תאים בתרבית שימושיים ללימוד ההתפלגות subcellular של חלבונים, כולל ממברנה פריפריאלי חלבונים. גנטית מקודד fluorescently חלבונים מתויג מהפכה בחקר התפלגות חלבון subcellular. עם זאת, קשה לכמת את ההתפלגות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, במיוחד כאשר חלבונים הם cytosolic חלקית. יתר על כן, חשוב תדירות ללמוד חלבונים אנדוגני. מבחני ביוכימיים כגון immunoblots נשארים תקן הזהב על כימות של חלבון הפצה אחרי subcellular fractionation. למרות שיש קיטים מסחריים שואפים לבודד cytosolic או שברים קרום מסוימים, רוב ערכות אלה מבוססים על חילוץ עם דטרגנטים, אשר עשויים להיות מתאימים ללמוד חלבוני ממברנה פריפריאלי בקלות שחולצו מן ממברנות. כאן אנו מציגים עבור הסלולר המגון פרוטוקול ללא חומרי ניקוי על-ידי חנקן קוויטציה עוקבות הפרדת חלבונים cytosolic ואת קרום מכורך מאת ultracentrifugation. אנחנו לאשר את ההפרדה של organelles subcellular ב מסיסים ושברים גלולה בכל סוגי התאים, והשווה חלבון החילוץ בין מספר שיטות מקובלות שאינן מבוססות על חומרי ניקוי המגון מכני. בין מספר יתרונות של חנקן קוויטציה הוא יעילות מעולה של שיבוש הסלולר עם מינימום נזק פיזי וכימי organelles עדין. בשילוב עם ultracentrifugation, חנקן קוויטציה זו שיטה מצוינת לבחון את השינוי של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין cytosolic ושברים ממברנה.

מבוא

החלבונים ניתן לחלק לשתי קבוצות: אלה המשויכות ממברנות ואלה שאינם. Non-הממברנה חלבונים הקשורים נמצאים ציטוזול, נוקלאופלזמה, לומינה של organelles כגון תוך-פלזמית (ER). ישנם שני סוגים של חלבונים הקשורים ממברנה, נפרד ואת היקפי. חלבוני ממברנלי אינטגרלי מכונים גם חלבונים transmembrane כי אחד או יותר חלקי פוליפפטיד משתרע על הקרום, בדרך כלל בתור מורכב של חומצות אמינו הידרופוביות סליל α. חלבונים transmembrane co-translationally מוכנסים לתוך ממברנות במהלך ביוסינטזה שלהם ולהישאר שתצורתו נקבעה כל כך עד שהם אינם catabolized. חלבוני ממברנה פריפריאלי מונעים בגיחות לממברנות, בדרך כלל בעקבות השינוי post-translational עם מולקולות הידרופוביות כגון שומנים. בניגוד ממברנלי אינטגרלי חלבונים, השיוך של חלבוני ממברנה פריפריאלי ממברנות הסלולר הוא הפיך, יכול להיות מוסדר. פונקציית חלבוני ממברנה פריפריאלי רבים איתות המסלולים וחופש ההתאגדות מוסדר עם ממברנות הוא אחד למנגנון הפעלה או מעכבים שביל. דוגמה אחת של מולקולה איתות הוא חלבון ממברנה פריפריאלי היא GTPase קטן, ראס. לאחר סדרה של שינויים post-translational הכוללות שינוי עם ליפופרוטאין farnesyl, מוסיף ששונה קרבוקסילי של חלבון RAS בוגרת העלעל cytoplasmic של הממברנה התאית. באופן ספציפי, קרום פלזמה היא איפה RAS עוסקת שלה אפקטור במורד הזרם RAF1. כדי למנוע הפעלה המכונן של חלבון מופעל mitogen קינאז (MAPK) מסלול, מספר רמות של שליטה של ראס נמצאים במקום. חוץ עיבוד ראס לא פעיל על-ידי hydrolyzing GTP ל- GDP, ראס הפעיל גם יכול להשתחרר מן קרום פלזמה על-ידי שינויים או אינטראקציות עם solubilizing גורמים כדי לעכב איתות. למרות פלורסנט הדמיה חיה מעניקה תא ביולוגים את ההזדמנות כדי לבחון את ההתאמה subcellular של חלבוני ממברנה פריפריאלי מתויג החלבון הניאון1, נותר צורך קריטי כדי להעריך את קרום התאחדות חלבונים אנדוגני באופן כמותי למחצה עם גישות ביוכימיים פשוטים.

הערכת הביוכימי נאות חלבון מחיצות בין קרום ושברים מסיס הוא ביקורתי תלויה בשני גורמים: המגון הסלולר והפרדה יעיל של קרום ושברים מסיסים. למרות פרוטוקולים מסוימים, כולל ערכות ממוסחר הנפוצה ביותר, תלוי המגון תא מבוססי דטרגנט, שיטות אלה ניתן לערפל ניתוח על-ידי חילוץ קרום חלבונים לתוך מסיסים שלב2. בהתאם לכך, שיטות המבוסס, מכני ללא חומרי לשבירת תאים לספק תוצאות הניקוי. ישנן מספר שיטות של שיבוש מכני של תאים גדלו בתרבות או שנקטפו דם או איברים. אלה כוללים דאונס המגון, הפרעה מחט בסדר, המגון תנודה, sonication קוויטציה חנקן. כאן נוכל להעריך חנקן קוויטציה להשוות אותו בשיטות אחרות. חנקן קוויטציה מסתמך על חנקן אשר התפרקה בציטופלסמה של התאים בלחצים גבוהים. לאחר equilibration, התליה תא חשוף בפתאומיות הלחץ האטמוספרי כך נוצרות בועות חנקן בציטופלסמה זה כשהבנו את התא כתוצאה בתסיסת שלהם. אם הלחץ הוא מספיק גבוה, חנקן בתסיסת יכול לשבש את גרעין3 , ממברנה מאוגדים organelles כמו lysosomes4. עם זאת, אם הלחץ נשמרת נמוכה מספיק, הלחץ ישבש קרום פלזמה ו אר אבל לא organelles אחרים, ובכך לשפוך ציטוזול והן organelles cytoplasmic בשלמותם לתוך homogenate המיועד cavitate5. מסיבה זו, חנקן קוויטציה היא השיטה של בחירה עבור בידוד organelles כמו lysosomes והמיטוכונדריה.

עם זאת, זה גם דרך מצוינת של הכנת homogenate כי ניתן להפריד בקלות לתוך קרום ושברים מסיסים. הספינה לחץ (נקרא מעתה ואילך "הפצצה") ששימש קוויטציה מורכב מעטפת פלדה אל חלד עבה זה עומד בלחץ גבוה, עם מעין שקע בחופו עבור משלוח של הגז חנקן טנק ויציאת שקע עם שסתום פריקה מתכוונן.

חנקן קוויטציה שימש עבור תא המגון מאז שנות ה-606. בשנת 1961, צייד ו Commerfold7 נוסדה קוויטציה חנקן כמו אפשרות מעשית עבור רקמות יונקים השיבוש. מאז, חוקרים יש להתאים את הטכניקה כדי תאים ורקמות שונים עם הצלחה, חנקן קוויטציה הפך למרכיב ביישומים מרובים, כולל ממברנה הכנה8,9, גרעין, אברון הכנה10,11, חילוץ הביוכימי יציב. כעת, ביולוגים תא לעתים קרובות יותר להעסיק בשיטות אחרות של התא המגון כי היתרונות של חנקן המגון יש לא היה נרחב מפורסם, פצצות חנקן יקרים יש תפיסה מוטעית זו מספר גדול יחסית של תאים נדרש. פורסמו הפרוטוקולים עבור חנקן קוויטציה להשגת homogenates נטול תאים עם גרעינים שלמים, הערכות שפורסמו ביותר שימשו כרכים של 20 מ"ל של התא השעיה. להסתגל טכניקה קלאסית זו כדי להתאים לדרישות הנוכחי של עבודה עם דוגמאות בקנה מידה קטן, אנו מציגים פרוטוקול שונה של חנקן קוויטציה שתוכננה במיוחד עבור תאים בתרבית. לאחר קוויטציה חנקן, homogenate מחולק מסיסים (S) ושברים ממברנה (P) על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, תחילה עם ספין במהירות נמוכה כדי להסיר גרעינים ותאים רצופה, ולאחר מכן עם ספין במהירות גבוהה (> g 100,000 x) כדי להפריד בין ממברנות של השבר מסיסים. לנו לנתח את יעילותו של ההפרדה עם immunoblots ולהשוות קוויטציה חנקן עם טכניקות טיפול נוספות שיבושים מכניים. אנחנו גם osmotic חיקרו את השפעת העלאת מאגר המגון במהלך קוויטציה חנקן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1-מאגר וההכנות ציוד

  1. להירגע 45 מ ל תא הפרעה פצצות 15 מ"ל צינורות, צינורות ultracentrifugation ב-4 מעלות צלזיוס
  2. הכן ולהירגע 25 מיליליטר המגון מאגר לכל התאים 7 2 x 10-4 מעלות צלזיוס. הוסף פרוטאז מעכב טבליה אחת רק לפני השימוש.
    הערה: מאגרי המגון מכילים אשלגן כלורי בדרך כלל יותר מאשר NaCl טוב יותר לשקף את הרכב מלח תאיים. מאגר המגון בשימוש פרוטוקול זה מורכב מ 10 מ מ HEPES ב- pH 7.4, 10 מ"מ אשלגן כלורי ו 1.5 מ"מ MgCl 2 (המכונים להלן מאגר המגון היפוטוניק). רוב מאגרי יכול להיות מותאם קוויטציה חנקן (ראה דיון).
  3. הכן ולהירגע 6 מ של 1 x Phosphate-Buffered מלוחים (PBS) מאגר עבור דגימה-4 מעלות צלזיוס. הוסף פרוטאז מעכב טבליות טריים לפני השימוש.
    הערה: מאגר PBS בשימוש פרוטוקול זה מורכב מ 10 מ מ נה 2 HPO 4 ב- pH 7.4, מ מ 1.8 ח' 2 PO 4, 137 מ"מ NaCl ו 2.7 מ"מ אשלגן כלורי.
  4. הכן ולהירגע 4 מ"ל solubilization מאגר עבור דגימה על 4 מעלות צלזיוס. הוסף פרוטאז אחד מעכב לוח רק לפני השימוש.
    הערה: מאגר Solubilization בשימוש פרוטוקול זה הוא 1 מאגר assay (ריפה) x Radioimmunoprecipitation, אשר מורכב של 25 מ מ טריס ב pH 7.4, 150 מ מ NaCl, 0.1% מרחביות, 0.5% נתרן deoxycholate וב 1% NP-40. ראה הערה 4.6.

2. תא קציר

  1. לגדול 2 x 10 7-10 x 10 תרביות רקמה 9 תאים עם המומלץ תרבות המדיה עבור סוג התא. בדרך כלל, צלחת 15 ס מ אחת מניבה 2 x 10 7 תאים HEK-293 תרבותי ב- DMEM ב- 90% confluency ( איור 1).
  2. להסיר את מדיום הגידול על ידי ואקום.
  3. עבור תאים חסיד, למקם את הכלים תרבות על קרח, לשטוף את התאים ישירות על המנות תרבות בעדינות עם המגון צוננת מאגר פעמיים (10 מ ל מאגר לכל צלחת 15 ס מ לכל לשטוף), לקצור את התאים עם במגרדת תא גדול בתוך אמצעי אחסון המתאים של המגון המאגר; עבור תאים ההשעיה, לאסוף לשטוף בגדר תא במאגר המגון צוננת פעמיים (10 מ ל מאגר לכל 50-mL תרבות לכל לשטוף) עם ספין 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואתה resuspend בגדר תא שטף של אמצעי אחסון המתאים המגון מאגר על קרח.
    הערה: אמצעי האחסון צריך להיות מבוסס על הדרישות עבור ריכוז חלבון הניסויים המיועד, כמו גם את אמצעי האחסון מינימלי/מקסימלי מורשה להיכנס הפצצה הפרעה תא. קו מנחה כללי 2-10 x 10 7 תאים למ"ל, או גלולה בערך 10 כרכים של התא. פרוטוקול זה ממוטב עבור שלוש מנות 15 ס מ של תאים HEK-293 ב- 2 מ של מאגר המגון.

3. קוויטציה חנקן

  1. העברת התליה תא לפצצה צונן ונקי באמבט קרח למהומה צלחת-
    התראה: הפצצה יש בלחץ גבוה, טמפרטורה נמוכה, גז חנקן – לענוד הגנה אישית המתאימה .
  2. מקום בר מיקרו מערבבים מגנטי בתוך הפצצה והפעל את הצלחת מערבבים כדי לשמור על הומוגניות ההשעיה.
  3. להוסיף טבליה אחת של מעכבי פרוטאז ההשעיה ולסגור את הפצצה לכל יצרן ' הוראה s.
  4. בהדרגה לדחוס את הפצצה עם מיכל גז חנקן לכל יצרן ' s הוראה עד מד הלחץ פצצה קורא psi 300 עד 600. סגור שסתומים ונתק את מיכל החנקן.
    הערה: הלחץ הנדרש עשוי להשתנות עם סוג התא. כאן ביצענו קוויטציה בבית 350-400 psi עבור תאים HEK-293, NIH-3T3, Jurkat.
  5. לחכות 20 דקות לאפשר את החנקן להמיס ולהגיע שיווי משקל בתוך התאים.
  6. להסיר את עודף המים בסביבת שסתום פריקה באמצעות מגבת בד. פתח את שסתום פריקה בעדינות כדי להשיג פרסום dropwise של homogenate לאסוף צינור טרום מקורר 15 מ"ל.
    הערה: לקראת סוף אוסף יהיו כמה טיפות שם של homogenate, גז להגיח עם צליל השריקה. ודא כי הגז אינה סיבה שנאספו בעבר cavitate לירות מתוך הצינור (ומכאן השימוש 15 מ"ל צינורות במקום 1.5 mL צינורות). ברגע פרץ מתחיל, סגור את השסתום השחרור ופתח את שסתום כניסת חנקן בפתאומיות כדי להפחית לחץ הפצצה ולהשיג קוויטציה של התאים הנותרים הפצצה. פתח הפצצה על cavitate ניקוי יסודי ושחזור.
    הערה: cavitate הסופי צריך להיות מראה חלבי עם קצף על העליונה. מערבבים בעדינות עם טיפ פיפטה כדי לאפשר את הקצף תתארך לפני צנטריפוגה.
    הערה: לבחון את cavitate על ידי ניגודיות שלב מיקרוסקופ כדי לקבוע את היעילות המגון. להוסיף טיפה 15 µL של cavitate על פני השטח של שקופיות מיקרוסקופ וכן כיסוי עם coverslip. וחזור על שלב מספר תאים רצופה 3.4-3.6 רק אם רבים מדי מזוהים עם יעד X 20-
    הערה: אם מאגר המגון אינה מכילה EDTA או EGTA, להוסיף את שנאספו cavitate-ריכוז סופי של 1 מ מ בתוך 5 דקות אחרי השחרור.

4. הפרדת ממברנה שברים Cytosolic

  1. צנטריפוגה cavitate-500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר תאים רצופה ואת הגרעינים.
    הערה: חזור על השלב צנטריפוגה עד אין גלולה גלוי מופק ולאסוף את הפוסט גרעיני Supernatant (מערכת העצבים ההיקפית) תוך הימנעות הקצף שצף מעל. Centrifuge מחדש את הקצף נוספות לאסוף, לשלב מערכת העצבים ההיקפית, במידת הצורך ( איור 1).
  2. לעבד את מערכת העצבים ההיקפית לפי הצורך כדי לקבל שברים של עניין. לצורך הפרדת cytosolic ממברנה שברים, להעביר את מערכת העצבים ההיקפית צינור ultracentrifuge ולבצע ultracentrifugation לפי הצורך. פרוטוקול זה מיטבית < מ ל 3.5 מדגם צינור ultracentrifuge פוליקרבונט ועבור ultracentrifugation-350,000 g x עבור h 1-4 מעלות צלזיוס
  3. לאסוף את תגובת שיקוע (השבר S) באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
  4. לשטוף היטב את גלולה עם 3 מ"ל של PBS קר מבלי להפריע זה. הסר את PBS על ידי ואקום.
    הערה: אם זיהום של השבר הממברנה על ידי חלבונים cytosolic היא דאגה גדולה יותר מאשר אובדן הדגימה, resuspend בגדר ב- 3 מ"ל של PBS, re-ultracentrifuge כמו שלב 4.2 קר. הסר את PBS על ידי ואקום.
  5. Resuspend בגדר מלאה של אמצעי אחסון מתאים המכילים חומרי ניקוי solubilization מאגר של בחירה. כדי להשיג שקילות תא, להשתמש באותו אמצעי אחסון של מאגר solubilization השבר cytosolic.
    הערה: אנו מציעים באמצעות מאגר x RIPA 1 כמו מאגר solubilization להפקת חלבון ממברנה יעיל. אם אין assay במורד הזרם נדרשת עבור ממברנה שבר, השתמש מאגר מדגם x laemmli 1 לחילוץ חלבון ממברנה מקסימלי.
    הערה: אנו מציעים הם מוציאים והעברת בגדר במאגר solubilization על צינור נקי על שפופרת מסובב ב 4 ° C לחילוץ חלבון ממברנה מקסימלי.
    הערה: אם בגדר הוא דביק מדי (מדי שומנים) ביעילות יוסרו מ- thהרכבת התחתית במאגר solubilization e ultracentrifuge, אנו מציעים snap קפוא בגדר חנקן נוזלי, במהירות מוציאים בגדר מהצינור ultracentrifuge עם מרית מתכת מיני לפני בגדר מפשירה.
    הערה: לחלופין, ממברנה כדורי יכול להיות רק resuspended, לא solubilized במאגר המכילה אבקת לייצר חלקיק P קרום שלפוחית ההשעיה, שבו במקרה צנטריפוגה מקומו 4.6 אינה נדרשת. שברים כאלה P שימושיים בחקירת פונקציות כגון פעילות האנזים התלויות ממברנה האגודה-
  6. Centrifuge התליה גלולה באופן מלא solubilized מהשלב 4.5 ב g 20,000 x ומפרידה שולחן 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאסוף את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה של 1 מ"ל (השבר P) ולמחוק בגדר (ליפידים קשי תמס).
  7. לבצע מבחני הרצוי כגון סופג המערבי עם שברים cytosolic ו/או קרום, או לשמור אותם ב- 80 ° C לשימוש עתידי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 2 מציג את חלוקת החלבונים של מערכת העצבים ההיקפית לתוך שבר cytosolic מסיסים (S) או שבר צניפה ממברנה (P). בדקנו שלוש שורות תאים נציג מכל סוגי תאים שונים: HEK-293 (אפיתל) NIH-3T3 (פיברובלסט), Jurkat (לימפוציטים). רו גואנין דיסוציאציה מעכב (RhoGDI), ללא תלות הקטיון מנוז-6-פוספט קולטן (CIMPR) שימשו בקרים חיוביים ל cytosolic ושברים ממברנה, בהתאמה. אישרנו את ההפרדה יעיל של ציטוזול ואת קרום לאחר חנקן קוויטציה ב ~ 350 psi במאגר היפוטוניק ואחריו ultracentrifugatio...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היתרונות של חנקן קוויטציה על פני שיטות אחרות של שיבוש מכני הן מגוונות. אולי היתרון המשמעותי ביותר הוא היכולת שלה בעדינות אך ביעילות homogenize דגימות. העקרונות הפיזי של דגימות מתקרר הלחץ במקום ביצירת הנזק חימום מקומי כמו אולטרה סאונד, חיכוך/הטיה המבוסס על טכניקות. קוויטציה הוא גם יעיל מאוד-שיבוש קרום פלזמה. מכיוון חנקן נוצרות בועות בתוך כל תא בודד על ביטול דחיסה, תהליך קוויטציה מוגבל פחות לפי גודל התא, לטעום גודל או לטעום ריכוז. לכן הוא מציע יתרונות נוספים על פני דאונס מבוסס-אישור או מחט מעבר המגון. חנקן קוויטציה מציע גם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

עבודה זו מומן על ידי GM055279, CA116034 ו- CA163489.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כלי שיבוש תאים (45 מ"ל)מכשיר Parr4639הומוגנייזר פצצת קוויטציה חנקן
(2 מ"ל)קונטס885300-0002עלי וצינור Dounce
U-100 מזרק אינסולין 28G½Becton Dickinson329461 Needle
Atg12 נוגדןSanta Cruz271688נוגדן עכבר, השתמש ב-1:1000 דילול
ובטא;-נוגדן אקטיןSanta Cruz47778נוגדן עכבר, השתמש ב-1:1000 דילול
ובטא;-נוגדן טובוליןDSHBE7-sנוגדן עכבר, השתמש ב-1:5000 דילול
נוגדן CalnexinSanta Cruz23954נוגדן לעכבר, שימוש בדילול 1:1000
נוגדן CalregulinSanta Cruz373863נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000
דילול נוגדן קטלאזSanta Cruz271803נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000 דילול
נוגדן CIMPRAbcam124767נוגדן ארנב, שימוש ב-1:1000 דילול
EEA1 נוגדןSanta Cruz137130נוגדן לעכבר, שימוש בדילול 1:1000
נוגדן EGFRSanta Cruz373746נוגדן עכבר, שימוש בדילול 1:1000
F0-ATPase נוגדןSanta Cruz514419נוגדן עכבר, שימוש בדילול 1:1000
F1-ATPase נוגדןSanta Cruz55597נוגדן עכבר, שימוש בדילול 1:1000
נוגדןפיברילריןנוגדן עכבר סנטה קרוז374022שימוש ב-1:200 דילול
גולג'ין 97 נוגדןסנטה קרוז59820נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000
דילול נוגדן HDAC1סנטה קרוז81598נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000
דילול Hexokinase 1 נוגדןאיתות תאים2024Sנוגדן ארנב, שימוש ב-1:1000
דילול Lamin A/C נוגדןנוגדן עכבר סנטה קרוז376248השתמש בדילול 1:1000
נוגדן LAMP1DSHBH4A3-cנוגדן עכבר, השתמש בדילול 1:1000
Na+/K+ נוגדן ATPaseSanta Cruz48345נוגדן עכבר, השתמש בדילול 1:1000
נוגדן Rab7Abcam137029Rabbit, השתמש בדילול 1:1000
Rab9 נוגדןThermoMA3-067נוגדן לעכבר, שימוש ב-1:1000 דילול
RCAS1 נוגדןSanta Cruz398052נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000
דילול נוגדן RhoGDISanta Cruz360נוגדן ארנב, שימוש ב-1:3000
דילול חלבון ריבוזומלי S6 נוגדןSanta Cruz74459נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000 דילול
נוגדן Sec61aSanta Cruz12322נוגדן עיזים, שימוש ב-1:1000 דילול
אולטרה-צנטריפוגה פוליקרבונט עבה דופןבקמן קולטר349622צינור לדוגמא לאולטרה-צנטריפוגה
רוטור TLK-100.3רוטור 349481 בקמן קולטרלאולטרה-צנטריפוגה
אופטימה MAX אולטרה-צנטריפוגה אישית בעלת קיבולת גבוההבקמן קולטר364300אולטרה-צנטריפוגה
cOmplete מעכב פרוטאז טבליות קוקטיילמעכבי פרוטאזRoche11697498001
מגרדי תאים עם ידית 25 ס"מ ולהב 3.0 ס"מקורנינג353089מגרד תאים גדול
מגנטי Stir BarFisher Scientific14-513-57SIXמיקרו ערבוב בר
קרמיקה-למעלה בוחש מגנטיפישר S504501ASמערבל מגנטי
, , צינור

מקורות

  1. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
  2. Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
  3. Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
  4. Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
  5. Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
  6. Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
  7. Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
  8. Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
  9. Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
  10. Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
  11. Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
  12. Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
  13. Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
  14. Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
  15. Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
  16. Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
  17. Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
  18. Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

שבירה לסכרוני תאייםאולטרה-צנטריפוגציהפראקציה ציטוזוליתפראקציה ממברנליתחלוקת חלבוניםהומוגניזציה של תאיםאנליזת Western Blot
קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.