כתב יד זה מתאר את התועלת של שבוצעה על חולדות נקבות לעצב ניסיוניות לחקירה הרבייה, הגינקולוגית. הסבר צעד אחר צעד כיצד לבצע הערכה ultrasonographic מוצג.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בדיקת אולטרה סאונד בחקירות הרבייה ניסויים על חולדות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
עם התפתחות הטכנולוגיה סייעה הרבייה, המגבלות האתית של מחקר על בני אדם, חייתיים חולדה היה בשימוש נרחב ברפואה הרבייה. בעבר, חקר התפתחות מערכת הרבייה אצל מכרסמים מבוסס על בחינה היסטולוגית חד פעמית של רקמות נכרת. לאחרונה, עם ההתפתחות של אולטראסאונד transabdominal ברזולוציה גבוהה, sonography באיכות גבוהה ניתן כעת לבצע כדי להעריך את אברי הרבייה של חולדות, ומאפשר שיטה חדשה ללימוד במערכת הרבייה. תמונות התקבלו באמצעות מערכת ultrasonographic ברזולוציה גבוהה. בדיקת אולטרה סאונד הגינקולוגית בוצעה על חולדות שאינה בהריון 28 בת שבוע 8 ו-5 עכברושים ספראג-Dawley בהריון. אנו נסביר כיצד לזהות את האיברים של מערכת הרבייה, מבנים המשויכים בתצוגות טיפוסי במהלך השלבים השונים של ייחום מחזור. צבע זרימת שדופלר שימש למדידת זרימת הדם עורק הרחם ולהעריך שינויים תבנית זרימת דם הרחם בשלבים שונים של ההריון. הראו כי חקר אולטרסאונד היא שיטה שימושית עבור הערכת שינויים באברי הרבייה הפנימיים. השימוש מעלה את האפשרות של ניסויים נוספים, לרבות נהלי רפואית או כירורגית, והוא מספק את היכולת לעקוב אחר השינויים sonographic לאיברים פנימיים מבלי להתפשר על בעלי חיים.
מבוא
מודלים בעלי חיים חולדה היה בשימוש נרחב ברפואה הרבייה, לרבות העובר השתלת השחלות1,2. עם זאת, בעבר, חקר התפתחות מערכת הרבייה אצל מכרסמים מבוסס על בחינה היסטולוגית חד פעמית של רקמות נכרת, המחקר האורך של איבר הרבייה היומיומית שינויים שלא היה אפשרי חולדות3. אולטרסאונד כבר בשימוש נרחב בהטכנולוגיה סייעה הרבייה אצל בני אדם במשך 30 שנה, אך זו טכנולוגיה יקר רק הוחלה על חולדות לאחרונה.
המטרה שלנו היתה ליצור גישה ultrasonographic להערכת אברי הרבייה של חולדות ספראג-Dawley לעיצוב ניסיוניות לחקירה רבייה וגניקולוגיה, כדי להדגים את הפרוצדורה כי לידע שלנו, ישנם פרסומים לא דמיינו הנוכחית לגבי הליך זה. אנו מתארים את ההליך של בחינה ultrasonographic של מערכת הרבייה הנשית של החולדה, נוכח הממצאים ultrasonographic על האנטומיה ואת זרימת הדם עורק הרחם באמצעות אולטרסאונד בהבחנה גבוהה. אנחנו במעקב המאפיינים של רירית הרחם, השחלות עורק הרחם זרימת הדם בבעלי חיים שאינה בהריון בשלבים שונים של מחזור ייחום כדי להעריך את הבדלים משמעותיים עובי רירית הרחם, השחלות מורפולוגיה, זרימת הדם ברחם בשלבים שונים של מחזור ייחום, בדומה לנשים. השתמשנו ציוד סאונד באיכות גבוהה עם תדר 70 מגה-הרץ, רמת הרזולוציה של 30 מיקרומטר. מטרתנו אחרים היה להעריך את השינויים בהתנגדות של זרימת הדם ברחם בחולדות בהריון. טכניקה זו מאפשרת לימוד יומי לשינויים איברי הרבייה מבלי להתפשר על בעלי חיים.
ישנם מספר קשיים טכניים ניצול אולטרסאונד על חולדות. קשיים אלה כוללים: רירית הרחם עכברוש הוא רזה הרבה יותר נקבה אנושית4. הקושי הדמיה השחלות של חולדות יוחסה עור עבה, מערכת השרירים של דופן הבטן אצל חולדות, אשר הביא כמעט מוחלטת הנחתה של אולטרסאונד5, ו. עורק הרחם היא הרבה יותר קשה למצוא שאינה בהריון חולדות. פתרנו הרבה בעיות טכניות עם ההליך, עבור אלה בעיות שנותרו, אנו מציגים כיצד למזער אותם.
ניטור מוצלחת של שינויים sonographic אברי הרבייה של חולדות ללא צורך להקריב חיות תיפתח האפשרות של בניית מודלים בבעלי חיים עתידיים ברפואה הרבייה, ניתוחים אחרים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה בוצע בהתאמה קפדנית עם ההמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים ועל פי את יגיעו (חיה מחקר: דיווח ב- Vivo ניסויים) הנחיות. הפרוטוקול קיבל רשיון עבור ניסויים בבעלי חיים, ציות הוראה 2010/63/האיחוד האירופי עם אישור מספר A13170404 (Anexo 1). כל הניסויים בוצעו בתוך מעבדה מוסמך האיחוד האירופי בעקבות הנחיות הלאומית לטיפול האתית של חיות (RD 53/2013, להנחיית האיחוד האירופי 63/2010). הפרוטוקול אושרה על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת מורסיה.
1. הכנה בעלי חיים
הערה: כל הניסויים היו נתמך על ידי בעלי חיים לניסויים סעיף של מורסיה האוניברסיטה ואת יולדות מחלקת גינקולוגיה מורסיה האוניברסיטה.
- השתמש 8 בת שבוע ספראג-Dawley חולדות (חולדות נקבות 28) במשקל 200-250 גר' כל הניסויים.
הערה: כאן, וגם השתמשנו-5 עכברושים בהריון. - כדי לקבל חולדות בהריון, כלוב בת שבוע-שמונה חולדות זכר נקבה ופורה and חבר החל מהשעה 17:00-23: 00 ה זיהוי של פקק הנרתיק למחרת בבוקר היה להתפרש ההזדווגות הצלחה. שקול יום 1 של ההיריון, למחרת אחרי הם היו הזדווגו.
- לבצע את הניסויים ב- 9, 15 עד 18 ימי ההיריון.
- חולדות House בקבוצות של שתיים עם חינם גישה למזון ולמים ולשמור על 12 שעות רגילות/כהה מחזורים.
- לאחר הסתגלות לתנאים המתקן למשך תקופה מינימלית של שבועיים, השתמש ציטולוגיה הנרתיק בהליכת הבוקר כדי להעריך את תדירות ייחום, סדירות.
הערה: עשרים ושמונה חולדות עם שלב ייחום יום רגיל של 4 עד 5 נבחרו להכללה במחקר.
2. הכנה של חולדות הדמיה
הערה: התמונות התקבלו באמצעות בדיקת אולטרה סאונד transabdominal ברזולוציה גבוהה. ייחום שלבים נקבעו על ידי השמצות הנרתיק ציטולוגיה.
- לפני המחקר הדמיה, עזים ומתנגד הסכר בבית הבליעה אינדוקציה עם 2-3% איזופלוריין גז.
- להסיר את החיה, מיד למקם את האף בתוך קונוס האף מחובר למערכת הרדמה ולקיים החיה ב- 1.5-2% איזופלוריין במהלך הבדיקה ultrasonographic.
- הסר את הפרווה של השוליים costal בבטן סימטרית עם קוצץ, קרם depilatory.
- מקם את העכברוש anesthetized במצב פרקדן בשולחן מחומם כדי לאבטח את החולדה ולהבטיח נוחות אופטימלית ותחזוקה של פרמטרים פיזיולוגיים משך זמן ההפעלה הדמיה. כל הפרמטרים פיזיולוגיים צריך להיות משולב עם התמונות, הנתונים בשבי בזמן אמת באמצעות היישום של אולטרסאונד.
- הכנס בעדינות בדיקה רקטלית (לאחר שימון) כדי לפקח על טמפרטורת הגוף (37.5 ° C ± 0.5 ° C).
- הכנס המתמר (30 Hz) בעל נייח והעברתו לאורך הציר האנכי, ציר אופקי (קדימה-אל-גב, צד אל צד) משתמש במוט היגוי המופעלים באופן ידני או באופן ידני.
- Balm אופטלמולוגיות מבוססי נפט חלות על העיניים של העכברוש כדי למנוע ייבוש במהלך ההליך.
3. בחינת הליך
הערה: האנטומיה של איברי הרבייה rats´: הנרתיק נמצא הגבי שלפוחית השתן ומחלק שני קרניים הרחם המרחיבים לכיוון הכליות. השחלות מחוברים הקרניים הרחם דרך oviducts (איור 1). הרחם הינו ממוקם באזור האחורי לכליות.
-
זיהוי של הרחם
- באמצעות שלפוחית השתן כנקודת ציון כדי למצוא את צוואר הרחם, בצע את צוואר הרחם כדי למצוא את הסניף של הקרניים הרחם ישר ושמאלה.
- לעבור צפייה דו-ממדית/וידאו על-ידי בחירה "B-מצב". למדוד את הקוטר גישה antero-אחוריים של כל קרן הרחם באזור אמצע-isthmic על תמונת קו האמצע הווריד. לזהות מדידות באמצעות התוכנה ultrasonographic.
- למדוד את עובי רירית הרחם מגבול echogenic echogenic הגבול לרוחב חלל הרחם על תמונת קו האמצע הסאגיטלי ב "B-מצב".
- לשנות מצב דופלר צבע על-ידי בחירה "דופלר צבע". השתמש בצבע דופלר כדי לזהות את אספקת הדם של רירית הרחם ולמדוד את זרימת הדם של רירית הרחם. בחר את הפרמטרים הבאים במצב דופלר צבע: מסנן גבוהה לעבור להגדיר ב- 4 הרץ, קבע תדירות החזרה פעמו בין 4 ו- 48 kHz, ושער פעמו דופלר הממוקם בין 0.2 עד 0.5 מ מ.
-
זיהוי של זרימת הדם עורק הרחם
- להשיג דופלר ואת ב. עורק הרחם ליד השוליים לרוחב-נחות של הצומת צוואר-הרחם קרוב עורק iliac בכל צד.
- השתמש בפרמטרים הבאים במצב דופלר: מסנן גבוהה לעבור להגדיר ב- 6 הרץ, קבע תדירות החזרה פעמו בין 4 ו- 48 kHz, ושער פעמו דופלר הממוקם בין 0.2 עד 0.5 מ מ.
- לטפל כדי ליישר את זרימת הדם ואת קרן דופלר כדי למזער את הזווית דופלר. לתעד את הזווית בין הקרן דופלר הכלי. ערכים מעבר זווית של 60 מעלות אינם מדויקים, נמנעה6.
- למדוד את מהירות שיא סיסטולית (PSV) והמהירות דיאסטולי (EDV) של שלושה מחזורים רצופים. לאחר מכן לחשב סיסטולית (S/D) הדיאסטולי יחס (PSV/EDV), ההתנגדות אינדקס (RI) ([PSV-EDV] / PSV) ערכים עבור כל קרן הרחם.
- למדוד את זרימת הדם עורק הרחם של חולדות בהריון 5 במהלך של 9th, 15th, היוםה 18 של ההיריון.
-
זיהוי של השחלה ואת זרימת הדם בעורק השחלות
הערה: עכברוש הנשי השחלות ממוקמים לרוחב לכליות משני הצדדים של בעל החיים והם שוכנים באזור רפידות השמן בקצה של ' קרן ' הרחם (איור 1).- תמונה השחלה, להתחיל עם החללית במטוס רוחבי ולמקם אותו על הפן הלטראלי של החיה מעט מתחת לצלעות. הכליה ואת משטח שמן יש מראה hyperechoic בהשוואה השחלה.
- למדוד את הגבול החיצוני של השחלה, זקיקי. המספרים על המשקל לכל תמונה הם מילימטרים, עם גידול של 0.1 מ מ.
הערה: הדמיה מצב דופלר צבע ומצב דופלר כוח מסייע עם זיהוי של עוצמת השחלות זרימה כיוונית.
4. עיצוב של המחקר
- בדוק את מחזור ייחום על ידי השמצות הנרתיק ציטולוגיה.
- מחלקים כל העכברושים בשתי קבוצות. קבוצה 1 או פורייה מראש (או periovulatory), כוללים את החולדות שהיו proestrus, ייחום שלבי מחזור. עבור קבוצה 2 או פוסט-פורייה, כוללים את החולדות שהיו diestrus מוקדם, מאחר diestrus שלבי מחזור.
- לפקח ולהשוות את הקוטר גישה antero-אחוריים של כל קרן הרחם באזור אמצע-isthmic קבוצות 1 ו- 2.
- לפקח ולהשוות את עובי רירית הרחם ואת המאפיינים של רירית הרחם קבוצות 1 ו- 2.
- לפקח להשוות את גודל (קטרים המרבי) ואת המאפיינים של השחלות ו לשפה כלשהי זקיקים periovulatory השחלות הן קבוצות 1 ו- 2.
- לפקח ולהשוות את זרימת הדם עורק הרחם קבוצות 1 ו- 2.
- לפקח ולהשוות את זרימת הדם עורק הרחם של חולדות בהריון בשלבים שונים של ההריון (ימים 9, 15 ו- 18 של ההיריון).
- לבצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות SPSS. הצגת נתונים הממוצע ± סטיית התקן (SD) או חציון לטווחים בין רבעוני. לנתח את התוצאות באמצעות מבחן t של הסטודנט בין הקבוצות השונות. ערך-P של 0.05 פחות נחשב הבדל משמעותי סטטיסטית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
היו אין הבדלים משמעותיים קטרים קרן הרחם גישה antero-אחוריים או בכל עובי רירית הרחם בין שני הצדדים של ' קרן ' הרחם (טבלה 1). לעומת הקבוצה 2, עובי רירית הרחם רשע בקבוצה 1 היה הבדלים עבה יותר, אבל לא משמעותי (P > 0.05) נמצאו בין שתי הקבוצות (איור 3). עם זאת, מצאנו נוזל בתוך הרחם (בחולדות 8 מתוך 28) ליד מחזור ייחום המשויך לשינויים רירית הרחם מורפולוגיה (איור 2).
דופלר מחקרים הראו גם ללא שינויים משמעותיים בזרם דפוסי wavefo...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עקב השינויים פרוצדורלי ופתרון שנדרשה במחקר זה, למרות מטרתנו לזיהוי כל השלבים של ייחום מחזור אצל חולדות באמצעות אולטרסאונד, היינו מסוגלים למצוא הבדלים משמעותיים כלשהם. אנו משערים כי קשיים אלה יכול להיות בגלל מחזור ייחום נמשך רק כמה ימים אצל חולדות, בניגוד המחזור אצל נשים. אנו בטוחים כי כל המדידות נעשו בדיוק בזמן הנכון כדי לקבוע כל ההבדלים. לכן, אנו אשר כללה ייחום את שלבי מחזור לשלבים רק שני להעריך עבור כל ההבדלים, אך לא נצפו. כצפוי, נמצא הבדל משמעותי בין המידות של כל קרן הרחם, אשר יאפשר לנו לבחור את קרן או לבצע מדידות בעת...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי בעלי חיים לניסויים סעיף של מורסיה אוניברסיטת ואת יולדות מחלקת גינקולוגיה מורסיה האוניברסיטה. אנו מודים לכל הטכנאים בעבודה CEIB (en ניסיוני Centro Investigaciones Biomédicas), החלק של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת מורסיה, ששיתפו יש את הפרויקט הזה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מערכת מיקרו-הדמיה ברזולוציה גבוהה של Vevo3100 | Visual Sonics, inc. | ||
| www.visualsonics.com/products מערכת מסילות משולבת Vevo כולל יחידת ניטור פיזיולוגית. | ויז'ואל סוניקס, בע"מ | www.visualsonics.com/products | |
| MX400 Transducter | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Vevo Lab Software | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| HSD: Sprague Dawley SD | Envigo, inc. | ||
| ג'ל סיכה לזן חולדות | אספקה | ||
| CIBERTEC CA-EAC20 מערכת עגלות הרדמה | Cibertec S.A | מכונת הרדמה | |
| Ecogel 100 ג'ל אולטרסאונד | Eco-Med Pharmaceuticals Inc. | ||
| תחליב להסרת שיער (נאיר) | אספקה | ||
| Isoflurane | Esteve Veterinaria | הרדמה אינהלטורית | |
| * התוכנה הנדרשת היא תוכנת Vevo הכוללת יישום B-Mode, יישום דופלר גלי דופק וחבילת כלים לניתוח מתח כלי דם. |
מקורות
- Hunter, R. K. II, et al. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cell Effects on a Rodent Model of Thin Endometrium. PLoS ONE. 10 (12), e0144823(2015).
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nat Rev Genet. 7 (3), 185-199 (2006).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. C. Murine Echocardiography and Ultrasound Imaging. J Vis Exp. (42), (2010).
- Lohmiller, J. J., Swing, S. P. Reproduction and Breeding. The Laboratory Rat. , 2nd, Elsevier Academic Press. 147-164 (2006).
- Jaiswal, R. S., Singh, J., Adams, G. P. High-resolution ultrasound biomicroscopy for monitoring ovarian structures in mice. Reprod Biol Endocrinol. 7 (69), (2009).
- Kim, G. H. Murine Fetal Echocardiography. J Vis Exp. (72), (2013).
- Jing, Z., Qiong, Z., Yonggang, W., Yanping, L. Rat bone marrow mesenchymal stem cells improve regeneration of thin endometrium in rat. Fertil Steril. 101 (2), 587-594 (2014).
- Mu, J., Adamson, S. L. Developmental changes in hemodynamics of uterine artery, utero- and umbilicoplacental, and vitelline circulations in mouse throughout gestation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (3), H1421-H1428 (2006).
- Anderson, C. M., Lopez, F., Zhang, H. Y., Pavlish, K., Benoit, J. N. Reduced uteroplacental perfusion alters uterine arcuate artery function in the pregnant Sprague-Dawley rat. Biol Reprod. 72 (3), 762-766 (2005).
- Hongmei, L., et al. Ultrasound Molecular Imaging of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 Expression for Endometrial Receptivity Evaluation. Theranostics. 5 (2), 206-217 (2015).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
